антитела и иммуноконъюгаты и их применения

Формула изобретения

1. Антитело (Ab), связывающееся с CD22, которое содержит:

(1) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:9, 10, 19-23, 32 и 33, и

(2) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2;

(3) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4;

(4) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6;

(5) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12; и

(6) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, причем антитело связывается с эпитопом в области CD22, расположенным от аминокислоты 22 до аминокислоты 240 последовательности SEQ ID NO:27.

2. Антитело по п.1, содержащее HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность, которая соответствует консенсусной последовательности SEQ ID NO:10.

3. Антитело по п.1, где HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9.

4. Антитело по п.1, где HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:19.

5. Антитело по п.1, где HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20.

6. Антитело по п.1, где HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:21.

7. Антитело по п.1, где HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:22.

8. Антитело по п.1, где HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:23.

9. Антитело по п.1, где HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32.

10. Антитело по п.1, где HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:33.

11. Антитело по п.1, дополнительно содержащее по меньшей мере одну каркасную область, выбранную из консенсусной каркасной области тяжелой цепи (VH) подгруппы III и консенсусной каркасной области легкой цепи (VL) подгруппы I.

12. Антитело по п.1, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи, который по меньшей мере на 90% идентичен последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:16.

13. Антитело по п.1, содержащее вариабельный домен легкой цепи, который по меньшей мере на 90% идентичен последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:17.

14. Антитело по п.1, содержащее вариабельный домен легкой цепи, который по меньшей мере на 90% идентичен последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:18.

15. Антитело по п.1, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две, три или четыре аминокислотные последовательности каркасной области, выбранной из SEQ ID NO:1, 3, 5 и 7.

16. Антитело по п.1, содержащее вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две, три или четыре аминокислотные последовательности каркасной области, выбранной из SEQ ID NO:8, 11, 13 и 15.

17. Антитело по п.12, содержащее вариабельный домен легкой цепи, который по меньшей мере на 90% идентичен аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:17.

18. Антитело по п.12, содержащее вариабельный домен легкой цепи, который по меньшей мере на 90% идентичен аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:18.

19. Антитело по п.1, содержащее тяжелую цепь, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:88.

20. Антитело по п.1, содержащее легкую цепь, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:87.

21. Антитело по п.1, содержащее тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:88 и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:87.

22. Антитело, связывающееся с CD22, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи, который по меньшей мере на 90% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO:16, и

вариабельный домен легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из последовательности, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:17, и последовательности, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:18,

причем антитело связывается с эпитопом в области CD22,

расположенным от аминокислоты 22 до аминокислоты 240 последовательности SEQ ID NO:27.

23. Антитело по п.1, продуцируемое гибридомой с инвентарным номером АТСС РТА-7621 (10F4.4.1).

24. Антитело, которое связывается с эпитопом в области CD22, расположенным от аминокислоты 22 по аминокислоту 240 последовательности SEQ ID NO:27.

25. Антитело по п.1, являющееся гуманизированным.

26. Антитело по п.22, являющееся гуманизированным.

27. Антитело по п.1, где CD22 представляет собой CD22 млекопитающего.

28. Антитело по п.27, где CD22 выбран из CD22 грызунов и CD22 приматов.

29. Антитело по п.28, где CD22 представляет собой CD22 человека.

30. Антитело по п.22, где CD22 представляет собой CD22 млекопитающего.

31. Антитело по п.30, где CD22 выбран из CD22 грызуна и CD22 примата.

32. Антитело по п.31, где CD22 представляет собой CD22 человека.

33. Полинуклеотид, кодирующий антитело по п.1.

34. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п.33.

35. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.34, продуцирующая антитело по п.1.

36. Клетка-хозяин по п.35, являющаяся эукариотической.

37. Клетка-хозяин по п.36, являющаяся клеткой СНО.

38. Способ получения антитела против CD22, включающий:

a) культивирование клетки-хозяина по п.30 в условиях, подходящих для экспрессии полинуклеотида, кодирующего антитело, и

b) выделение антитела.

39. Антитело по п.1, где CD22 экспрессируется на поверхности клетки.

40. Антитело по п.39, где клетка представляет собой В-клетку.

41. Антитело по п.22, где CD22 экспрессируется на поверхности клетки.

42. Антитело по п.41, где клетка представляет собой В-клетку.

43. Антитело по п.35, где В-клетка связана с нарушением пролиферации В-клеток.

44. Антитело по п.43, где нарушение пролиферации В-клеток представляет собой злокачественную опухоль.

45. Антитело по п.43, где нарушение пролиферации В-клеток выбрано из лимфомы, неходжкинской лимфомы (NHL), агрессивной NHL, рецидивирующей агрессивной NHL, рецидивирующей медленно растущей NHL, рефракторной NHL, рефракторной медленно растущей NHL, хронического лимфолейкоза (CLL), мелкоклеточной лимфомы, лейкоза, волосатоклеточного лейкоза (HCL), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL) и лимфомы из клеток мантийной зоны.

46. Антитело по п.42, где В-клетка связана с нарушением пролиферации В-клеток.

47. Антитело по п.46, где нарушение пролиферации В-клеток представляет собой злокачественную опухоль.

48. Антитело по п.46, где нарушение пролиферации В-клеток выбрано из лимфомы, неходжкинской лимфомы (NHL), агрессивной NHL, рецидивирующей агрессивной NHL, рецидивирующей медленно растущей NHL, рефракторной NHL, рефракторной медленно растущей NHL, хронического лимфолейкоза (CLL), мелкоклеточной лимфомы, лейкоза, волосатоклеточного лейкоза (HCL), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL) и лимфомы из клеток мантийной зоны.

49. Антитело по любому из пп.1-13, 15-22 или 27-30, представляющее собой моноклональное антитело.

50. Антитело по п.1, представляющее собой фрагмент антитела, выбранный из фрагментов Fab, Fab'-SH, Fv, scFv или (Fab') ₂.

51. Антитело по п.1, являющееся гуманизированным.

52. Антитело по п.1, представляющее собой антитело человека.

53. Антитело по п.22, представляющее собой моноклональное антитело.

54. Антитело по п.53, представляющее собой фрагмент антитела, выбранный из фрагментов Fab, Fab'-SH, Fv, scFv или (Fab')₂.

55. Антитело по п.53, являющееся гуманизированным.

56. Антитело по п.53, представляющее собой антитело человека.

57. Антитело по п.1, связывающееся с тем же эпитопом, что и антитело, выбранное из АТСС РТА-7621 (10F4.4.1); и антитело, содержащее последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:88 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO:87.

58. Антитело по п.22, связывающееся с тем же эпитопом, что и антитело, выбранное из АТСС РТА-7621 (10F4.4.1); и антитело, содержащее последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:88 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO:87.

59. Способ детекции CD22 в биологическом образце, включающий:

приведение биологического образца в контакт с антителом по п.1 в условиях, допускающих связывание антитела с CD22, и детекцию того, формируется ли комплекс между антителом и CD22,

где наличие CD22 в биологическом образце определяют по образованию комплекса между антителом и CD22.

60. Способ по п.59, где биологический образец берут у пациента с подозрением на наличие нарушения пролиферации В-клеток.

61. Способ по п.60, где нарушение пролиферации В-клеток выбрано из лимфомы, неходжкинской лимфомы (NHL), агрессивной NHL, рецидивирующей агрессивной NHL, рецидивирующей медленно растущей NHL, рефракторной NHL, рефракторной медленно растущей NHL, хронического лимфолейкоза (CLL), мелкоклеточной лимфомы, лейкоза, волосатоклеточного лейкоза (HCL), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL) и лимфомы из клеток мантийной зоны.

62. Способ детекции CD22 в биологическом образце, включающий:

приведение биологического образца в контакт с антителом по п.22 в условиях, допускающих связывание антитела с CD22, и детекцию того, формируется ли комплекс между антителом и CD22,

где наличие CD22 в биологическом образце определяют по образованию комплекса между антителом и CD22.

63. Способ по п.62, где биологический образец берут у пациента с подозрением на наличие нарушения пролиферации В-клеток.

64. Способ по п.63, где нарушение пролиферации В-клеток выбрано из лимфомы, неходжкинской лимфомы (NHL), агрессивной NHL, рецидивирующей агрессивной NHL, рецидивирующей медленно растущей NHL, рефракторной NHL, рефракторной медленно растущей NHL, хронического лимфолейкоза (CLL), мелкоклеточной лимфомы, лейкоза, волосатоклеточного лейкоза (HCL), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL) и лимфомы из клеток мантийной зоны.

65. Иммуноконъюгат, направленный против CD22, содержащий антитело по п.1, ковалентно связанное с цитотоксическим средством.

66. Иммуноконъюгат, направленный против CD22, содержащий антитело по п.22, ковалентно связанное с цитотоксическим средством.

67. Иммуноконъюгат по п.65, где цитотоксическое средство выбрано из токсина, химиотерапевтического средства, молекулы лекарственного средства, антибиотика, радиоактивного изотопа и нуклеолитического фермента.

68. Иммуноконъюгат по п.67, имеющий формулу



где: (a) Ab представляет собой антитело по п.1;

(b) L представляет собой линкер;

(c) D представляет собой молекулу лекарственного средства; и

(d) p равно от 1 до приблизительно 20.

69. Иммуноконъюгат по п.68, где L выбран из 6-малеимидокапроила (МС), малеимидопропаноила (МР), валина-цитруллина (val-cit), аланина-фенилаланина (ala-phe), п-аминобензилоксикарбонила (РАВ), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноата (SPP), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (SMCC) и N-сукцинимидил-(4-йодацетил)аминобензоата (SIAB).

70. Иммуноконъюгат по п.68, где D выбран из ауристатина и долостатина.

71. Иммуноконъюгат по п.70, где D представляет собой молекулу лекарственного средства формулы D_E или D_F:



и где каждый R² и R⁶ представляют собой метил, каждый R³ и R⁴

представляют собой изопропил, R⁷ представляет собой втор-бутил, каждый R⁸ независимо выбран из СН ₃, O-СН₃, ОН и Н; R⁹ представляет собой Н; R¹⁰ представляет собой арил; Z представляет собой -О- или -NH-; R¹¹ представляет собой Н, C ₁-C₈-алкил или -(СН₂)₂ -O-(СН₂)₂-O-(СН₂)₂ -O-СН₃; и R¹⁸ представляет собой -C(R ⁸)₂-C(R⁸)₂-арил; и (d) p находится в диапазоне приблизительно от 1 до 8.

72. Иммуноконъюгат по п.65, обладающий активностью по уничтожению клеток in vitro или in vivo.

73. Иммуноконъюгат по п.68, где линкер связан с антителом через тиольную группу антитела.

74. Иммуноконъюгат по п.68, где линкер может расщепляться под действием протеазы.

75. Иммуноконъюгат по п.69, где линкер содержит дипептид val-cit.

76. Иммуноконъюгат по п.68, где линкер содержит п-аминобензильную единицу.

77. Иммуноконъюгат по п.69, где линкер содержит 6-малеимидокапроил.

78. Иммуноконъюгат по п.71, где лекарственное средство выбрано из ММАЕ и MMAF.

79. Иммуноконъюгат по п.78, где лекарственное средство представляет собой ММАЕ.

80. Иммуноконъюгат по п.78, где лекарственное средство представляет собой MMAF.

81. Иммуноконъюгат по п.66, где цитотоксическое средство выбрано из токсина, химиотерапевтического средства, молекулы лекарственного средства, антибиотика, радиоактивного изотопа и нуклеолитического фермента.

82. Иммуноконъюгат по п.81, имеющий формулу



где (a) Ab представляет собой антитело по п.22;

(b) L представляет собой линкер;

(c) D представляет собой молекулу лекарственного средства; и

(d) p равно от 1 до приблизительно 20.

83. Иммуноконъюгат по п.82, где L выбран из 6-малеимидокапроила (МС), малеимидопропаноила (МР), валина-цитруллина (val-cit), аланина-фенилаланина (ala-phe), п-аминобензилоксикарбонила (РАВ), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноата (SPP), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (SMCC) и N-сукцинимидил-(4-йодацетил)аминобензоата (SIAB).

84. Иммуноконъюгат по п.82, где линкер L может расщепляться под действием протеазы.

85. Иммуноконъюгат по п.83, где L содержит дипептид val-cit.

86. Иммуноконъюгат по п.82, где L содержит п-аминобензильную единицу.

87. Иммуноконъюгат по п.86, где п-аминобензильная единица представляет собой п-аминобензилоксикарбонил (РАВ).

88. Иммуноконъюгат по п.83, где L содержит 6-малеимидокапроил (МС).

89. Иммуноконъюгат по п.83, где линкер содержит 6-малеимидокапроил и п-аминобензилоксикарбонил.

90. Иммуноконъюгат по п.68, имеющий формулу



где L представляет собой линкер, а р находится в диапазоне от 2 до 5.

91. Иммуноконъюгат по п.90, где L содержит val-cit.

92. Иммуноконъюгат по п.90, где L содержит МС.

93. Иммуноконъюгат по п.90, где L содержит РАВ.

94. Иммуноконъюгат по п.90, где L содержит МС-РАВ.

95. Иммуноконъюгат по п.82, имеющий формулу Ab-(L-MMAE)p, где L представляет собой линкер, а р находится в диапазоне от 2 до 5.

96. Иммуноконъюгат по п.95, где L содержит val-cit.

97. Иммуноконъюгат по п.95, где L содержит МС.

98. Иммуноконъюгат по п.95, где L содержит РАВ.

99. Иммуноконъюгат по п.95, где L содержит МС-РАВ.

100. Иммуноконъюгат по п.68, имеющий формулу Ab-(L-MMAF)p, где L представляет собой линкер, а р находится в диапазоне от 2 до 5.

101. Иммуноконъюгат по п.100, где L содержит val-cit.

102. Иммуноконъюгат по п.100, где L содержит МС.

103. Иммуноконъюгат по п.100, где L содержит РАВ.

104. Иммуноконъюгат по п.100, где L содержит МС-РАВ.

105. Иммуноконъюгат по п.82, имеющий формулу Ab-(L-MMAF)p, где L представляет собой линкер, а р находится в диапазоне от 2 до 5.

106. Иммуноконъюгат по п.105, где L содержит val-cit.

107. Иммуноконъюгат по п.105, где L содержит МС.

108. Иммуноконъюгат по п.105, где L содержит РАВ.

109. Иммуноконъюгат по п.105, где L содержит МС-РАВ.

110. Иммуноконъюгат по п.68, где D представляет собой майтанзиноид.

111. Иммуноконъюгат по п.110, где D выбран из DM1, DM3 и DM4.

112. Иммуноконъюгат по п.110, обладающий активностью по уничтожению клеток in vitro или in vivo.

113. Иммуноконъюгат по п.110, где линкер связан с антителом через тиольную группу антитела.

114. Иммуноконъюгат по п.110, где линкер L выбран из N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноата (SPP), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (SMCC) и N-сукцинимидил-(4-йодацетил)аминобензоата (SIAB).

115. Иммуноконъюгат по п.111, где лекарственное средство представляет собой DM1.

116. Иммуноконъюгат по п.111, где L содержит SPP.

117. Иммуноконъюгат по п.111, где L содержит SMCC.

118. Иммуноконъюгат по п.111, где р составляет от 2 до 4.

119. Иммуноконъюгат по п.111, где р составляет от 3 до 4.

120. Иммуноконъюгат по п.82, где D представляет собой майтанзиноид.

121. Иммуноконъюгат по п.120, где D выбран из DM1, DM3 и DM4.

122. Иммуноконъюгат по п.120, обладающий активностью по уничтожению клеток in vitro или in vivo.

123. Иммуноконъюгат по п.120, где линкер связан с антителом через тиольную группу антитела.

124. Иммуноконъюгат по п.120, где линкер L выбран из N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноата (SPP), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (SMCC) и N-сукцинимидил-(4-йодацетил)аминобензоата (SIAB).

125. Иммуноконъюгат по п.121, где лекарственное средство представляет собой DM1.

126. Иммуноконъюгат по п.125, где L содержит SPP.

127. Иммуноконъюгат по п.125, где L содержит SMCC.

128. Иммуноконъюгат по п.125, где р составляет от 2 до 4.

129. Иммуноконъюгат по п.125, где р составляет от 3 до 4.

130. Фармацевтическая композиция для лечения нарушения пролиферации В-клеток, содержащая эффективное количество иммуноконъюгата по п.68 и фармацевтически приемлемый носитель.

131. Способ лечения нарушения пролиферации В-клеток, включающий введение индивидууму эффективного количества фармацевтической композиции по п.130.

132. Способ по п.131, где нарушение пролиферации В-клеток выбрано из лимфомы, неходжкинской лимфомы (NHL), агрессивной NHL, рецидивирующей агрессивной NHL, рецидивирующей медленно растущей NHL, рефракторной NHL, рефракторной медленно растущей NHL, хронического лимфолейкоза (CLL), мелкоклеточной лимфомы, лейкоза, волосатоклеточного лейкоза (HCL), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL) и лимфомы из клеток мантийной зоны.

133. Фармацевтическая композиция для лечения нарушения пролиферации В-клеток, содержащая эффективное количество иммуноконъюгата по п.82 и фармацевтически приемлемый носитель.

134. Способ лечения нарушения пролиферации В-клеток, включающий введение индивидууму эффективного количества фармацевтической композиции по п.133.

135. Способ по п.134, где В-клеточное пролиферативное нарушение выбрано из лимфомы, неходжкинской лимфомы (NHL), агрессивной NHL, рецидивирующей агрессивной NHL, рецидивирующей медленно растущей NHL, рефракторной NHL, рефракторной медленно растущей NHL, хронического лимфолейкоза (CLL), мелкоклеточной лимфомы, лейкоза, волосатоклеточного лейкоза (HCL), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL) и лимфомы из клеток мантийной зоны.

136. Фармацевтическая композиция для лечения нарушения пролиферации В-клеток, содержащая эффективное количество иммуноконъюгата по пп.65, 66, 67 или 81 и фармацевтически приемлемый носитель.

137. Способ лечения нарушения пролиферации В-клеток, включающий введение индивидууму эффективного количества фармацевтической композиции по п.136.

138. Способ по п.137, где нарушение пролиферации В-клеток выбрано из лимфомы, неходжкинской лимфомы (NHL), агрессивной NHL, рецидивирующей агрессивной NHL, рецидивирующей медленно растущей NHL, рефракторной NHL, рефракторной медленно растущей NHL, хронического лимфолейкоза (CLL), мелкоклеточной лимфомы, лейкоза, волосатоклеточного лейкоза (HCL), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL) и лимфомы из клеток мантийной зоны.

139. Способ ингибирования пролиферации В-клеток, включающий воздействие на клетки иммуноконъюгатом по п.68 в условиях, позволяющих иммуноконъюгату связываться с CD22.

140. Способ по п.139, где пролиферация В-клеток связана с нарушением, выбранным из лимфомы, неходжкинской лимфомы (NHL), агрессивной NHL, рецидивирующей агрессивной NHL, рецидивирующей медленно растущей NHL, рефракторной NHL, рефракторной медленно растущей NHL, хронического лимфолейкоза (CLL), мелкоклеточной лимфомы, лейкоза, волосатоклеточного лейкоза (HCL), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL) и лимфомы из клеток мантийной зоны.

141. Способ по п.139, где В-клетка представляет собой ксенотрансплантат.

142. Способ по п.139, где воздействие происходит in vitro.

143. Способ по п.139, где воздействие происходит in vivo.

144. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами, которое связывается с CD22, содержащее один или несколько свободных цистеиновых остатков с величиной тиоловой реактивности в пределах от 0,6 до 1,0, где сконструированное антитело с цистеиновыми заменами получают способом, включающим замену одного или нескольких аминокислотных остатков родительского антитела цистеиновым остатком, где указанное антитело содержит:

(1) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:9, 10, 19-23, 32 и 33, и

(2) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2;

(3) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4;

(4) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6;

(5) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12; и

(6) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14.

145. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п.144, являющееся более реакционноспособным в отношении тиолового реагента, чем родительское антитело.

146. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п.144, где способ дополнительно включает определение реакционноспособности тиоловых групп сконструированного антитела с цистеиновыми заменами посредством проведения реакции сконструированного антитела с цистеиновыми заменами с тиоловым реагентом;

где сконструированное антитело с цистеиновыми заменами является более реакционноспособным в отношении тиолового реагента, чем родительское антитело.

147. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п.144, где один или несколько свободных цистеиновых остатков расположены в легкой цепи.

148. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п.144, где антитело представляет собой иммуноконъюгат, содержащий сконструированное антитело с цистеиновыми заменами, ковалентно связанное с цитотоксическим средством.

149. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п.148, где цитотоксическое средство выбрано из токсина, химиотерапевтического средства, молекулы лекарственного средства, антибиотика, радиоактивного изотопа и нуклеолитического фермента.

150. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п.144, где антитело ковалентно связано с захватывающей меткой, меткой для детекции или твердой подложкой.

151. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п.150, где антитело ковалентно связано с захватывающей меткой - биотином.

152. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п.150, где антитело ковалентно связано с меткой для детекции - флуоресцентным красителем.

153. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п.152, где флуоресцентный краситель выбран из красителя флуоресцеинового типа, родаминового типа, дансила, лиссамина, цианина, фикоэритрина, техасского красного и их аналогов.

154. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п.150, где антитело ковалентно связано с радионуклидной меткой для детекции, выбранной из ³H, ¹¹ С, ¹⁴С, ¹⁸F, ³²P, ³⁵ S, ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ⁸⁶Y, ⁹⁹ Tc, ¹¹¹In, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹³³Xe, ¹⁷⁷ Lu, ²¹¹At и ²¹³Bi.

155. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п.150, где антитело ковалентно связано с меткой для детекции - хелатирующим лигандом.

156. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п.155, где хелатирующий лиганд выбран из DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA и ТЕТА.

157. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами, связывающееся с CD22, содержащее один или несколько свободных цистеиновых остатков с величиной тиоловой реактивности в пределах от 0,6 до 1,0, где сконструированное антитело с цистеиновыми заменами получают способом, включающим замену одного или нескольких аминокислотных остатков родительского антитела цистеиновым остатком, где антитело содержит:

вариабельный домен тяжелой цепи, который по меньшей мере на 90% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO:16, и вариабельный домен легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из последовательности, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:17, и последовательности, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:18.

158. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п.157, являющееся более реакционноспособным в отношении тиолового реагента, чем родительское антитело.

159. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п.157, где способ дополнительно включает определение реакционноспособности тиоловых групп сконструированного антитела с цистеиновыми заменами посредством проведения реакции сконструированного антитела с цистеиновыми заменами с тиоловым реагентом;

где сконструированное антитело с цистеиновыми заменами является более реакционноспособным в отношении тиолового реагента, чем родительское антитело.

160. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п.157, где один или несколько свободных цистеиновых остатков расположены в легкой цепи.

161. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п.157, где антитело представляет собой иммуноконъюгат, содержащий сконструированное антитело с цистеиновыми заменами, ковалентно связанное с цитотоксическим средством.

162. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п.161, где цитотоксическое средство выбрано из токсина, химиотерапевтического средства, молекулы лекарственного средства, антибиотика, радиоактивного изотопа и нуклеолитического фермента.

163. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п.157, где антитело ковалентно связано с захватывающей меткой, меткой для детекции или твердой подложкой.

164. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п.163, где антитело ковалентно связано с захватывающей меткой - биотином.

165. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п.163, где антитело ковалентно связано с меткой для детекции - флуоресцентным красителем.

166. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п.165, где флуоресцентный краситель выбран из красителя флуоресцеинового типа, родаминового типа, дансила, лиссамина, цианина, фикоэритрина, техасского красного и их аналогов.

167. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п.162, где антитело ковалентно связано с радионуклидной меткой для детекции, выбранной из ³H, ¹¹ C, ¹⁴C, ¹⁸F, ³²Р, ³⁵ S, ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ⁸⁶Y, ⁹⁹ Tc, ¹¹¹In, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹³³Xe, ¹⁷⁷ Lu, ²¹¹At и ²¹³Bi.

168. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п.162, где антитело ковалентно связано с меткой для детекции - хелатирующим лигандом.

169. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами по п.168, где хелатирующий лиганд выбран из DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA и ТЕТА.

170. Иммуноконъюгат по п.82, где линкер связан с антителом через тиольную группу антитела.

171. Иммуноконъюгат, направленный против CD22, содержащий антитело по п.1 и альбуминсвязывающий пептид.

172. Иммуноконъюгат по п.171, где альбуминсвязывающий пептид выбран из SEQ ID NO:42-46.

173. Иммуноконъюгат, направленный против CD22, содержащий антитело по п.22 и альбуминсвязывающий пептид.

174. Иммуноконъюгат по п.173, где альбуминсвязывающий пептид выбран из SEQ ID NO:42-46.

175. Сконструированное антитело с цистеиновыми заменами (Ab), связывающееся с CD22, которое содержит:

(1) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:9, 10, 19-23, 32 и 33, и

(2) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2;

(3) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4;

(4) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6;

(5) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12; и

(6) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14,

причем антитело связывается с эпитопом в области CD22, расположенным от аминокислоты 22 до аминокислоты 240 последовательности SEQ ID NO:27,

и дополнительно содержит цистеин в одном или нескольких положениях, выбранных из 15, 43, 110, 144, 168 и 205 легкой цепи по правилам нумерации Кабат и 41, 88, 115, 118, 120, 171, 172, 282, 375 и 400 тяжелой цепи по правилам нумерации EU.

176. Антитело по п.175, где цистеин находится в положении 205 легкой цепи.

177. Антитело по п.175, где цистеин находится в положении 118 тяжелой цепи.

178. Антитело по п.175, где цистеин находится в положении 400 тяжелой цепи.

179. Антитело по п.175, где антитело выбрано из моноклонального антитела, биспецифического антитела, химерного антитела, антитела человека и гуманизированного антитела.

180. Антитело по п.175, которое представляет собой фрагмент антитела.

181. Антитело по п.180, где фрагмент антитела представляет собой фрагмент Fab.

182. Антитело по п.175, которое выбрано из химерного антитела, антитела человека или гуманизированного антитела.

183. Антитело по п.175, которое получают в бактериях.

184. Антитело по п.175, которое получают в клетках СНО.

185. Способ детекции белка CD22 в образце, предположительно содержащем указанный белок, включающий воздействие на указанный образец антителом по п.174 и определение связывания указанного антитела с указанным белком CD22 в указанном образце, где связывание антитела с указанным белком указывает на наличие указанного белка в указанном образце.

186. Способ по п.185, где указанный образец содержит клетки, предположительно экспрессируемые указанный белок CD22.

187. Способ по п.185, где указанная клетка представляет собой В-клетку.

188. Способ по п.185, где антитело ковалентно связано с меткой, выбранной из флуоресцентного красителя, радиоактивного изотопа, биотина или лиганда, образующего комплексы с металлами.

189. Фармацевтический состав для лечения нарушения пролиферации В-клеток, содержащий эффективное количество антитела против CD22 по п.175 и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или эксципиент.

190. Конъюгат антитело-лекарственное средство, направленный против CD22, содержащий антитело по п.175, ковалентно связанное с ауристатином или молекулой майтанзиноидного лекарственного средства.

191. Конъюгат по п.190, содержащий антитело (Ab) и ауристатин или молекулу майтанзиноидного лекарственного средства (D), где сконструированное антитело с цистеиновыми заменами присоединено к D с помощью линкера (L) через один или несколько свободных цистеиновых остатков; причем конъюгат имеет формулу I:



где р представляет собой 1, 2, 3 или 4.

192. Конъюгат по п.191, где р равно 2.

193. Конъюгат по п.191, где L имеет формулу:



где А представляет собой удлинитель, ковалентно связанный с тиолом цистеина сконструированного антитела с цистеиновыми заменами (Ab);

а равно 0 или 1;

каждый W независимо представляет собой аминокислотную единицу;

w представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 12;

Y представляет собой спейсерную единицу, ковалентно связанную с молекулой лекарственного средства; и

y представляет собой 0, 1 или 2.

194. Конъюгат по п.193, имеющий формулу:



где РАВ представляет собой пара-аминобензилкарбамоил, a R¹⁷ представляет собой бивалентный радикал, выбранный из (CH₂)_r, С₃-С₈-карбоциклила, O-(СН₂)_r, арилена, (СН₂) _r-арилена, -арилен-(СН₂)_r-(СН ₂)_r-(С₃-С₈-карбоциклила), (С₃-С₈-карбоциклила)-(СН₂) _r, С₃-С₈-гетероциклила,

(СН ₂)_r-(С₃-С₈-гетероциклила), -(С₃-С₈-гетероциклил)-(СН₂) _r-,

-(CH₂)_rC(O)NR^b (CH₂)_r-, -(CH₂CH₂ O)_r-, -(CH₂CH₂O)_r -CH₂-,

-(CH₂)_rC(O)NR ^b(CH₂CH₂O)_r-, -(CH ₂)_rC(O)NR^b(CH₂CH₂ O)_r-CH₂-,

-(CH₂CH ₂O)_rC(O)NR^b(CH₂CH ₂O)_r-, -(CH₂CH₂O) _rC(O)NR^b(CH₂CH₂O) _r-CH₂- и

-(CH₂CH₂ O)_rC(O)NR^b(CH₂)_r-; где R^b представляет собой Н, C₁-С₆ -алкил, фенил или бензил; и r независимо представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 10.

195. Конъюгат по п.193, где W_w представляет собой валин-цитруллин.

196. Конъюгат по п.193, где R¹⁷ представляет собой (СН ₂)₅ или (СН₂)₂.

197. Конъюгат по п.193, имеющий формулу:

198. Конъюгат по п.197, где R¹⁷ представляет собой (СН₂)₅ или (СН₂)₂ .

199. Конъюгат по п.193, имеющий формулу:

200. Конъюгат по п.191, где L представляет собой SMCC, SPP или ВМРЕО.

201. Конъюгат по п.191, где D представляет собой ММАЕ, со структурой:



где волнистая линия указывает участок связывания с линкером L.

202. Конъюгат по п.191, где D представляет собой MMAF, со структурой:



где волнистая линия указывает участок связывания с линкером L.

203. Конъюгат по п.191, где D представляет собой DM1 со структурой:



где волнистая линия указывает участок связывания с линкером L.

204. Конъюгат по п.190, где родительское антитело против CD22 выбрано из моноклонального антитела, биспецифического антитела, химерного антитела, антитела человека, гуманизированного антитела и фрагмента антитела.

205. Конъюгат по п.190, где фрагмент антитела представляет собой фрагмент Fab.

206. Конъюгат антитело-лекарственное средство, направленный против CD22, выбран из структур:



где Val представляет собой валин; Cit представляет собой цитруллин; р представляет собой 1, 2, 3 или 4; и Ab представляет собой антитело против CD22 по п.175.

207. Конъюгат по п.190, где ауристатин представляет собой ММАЕ или MMAF.

208. Конъюгат по п.191, где L представляет собой MC-val-cit-PAB или МС.

209. Способ детекции В-клеток за счет связывания конъюгата антитело-лекарственное средство по п.190 с антителом CD22, включающий

(a) воздействие на клетки конъюгатом антитело-лекарственное средство; и

(b) определение степени связывания конъюгата антитело-лекарственное средство с клетками.

210. Способ ингибирования клеточной пролиферации, включающий обработку злокачественных В-клеток млекопитающих в среде для культивирования клеток конъюгатом антитело-лекарственное средство по п.190, в результате чего пролиферация злокачественных В-клеток ингибируется.

211. Фармацевтический состав для лечения нарушения пролиферации В-клеток, содержащий эффективное количество конъюгата антитело-лекарственное средство по п.190 и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или эксципиент.

212. Способ лечения злокачественной опухоли, включающий введение пациенту фармацевтического состава по п.211.

213. Способ по п.212, где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из лимфомы, неходжкинской лимфомы (NHL), агрессивной NHL, рецидивирующей агрессивной NHL, рецидивирующей медленно растущей NHL, рефракторной NHL, рефракторной медленно растущей NHL, хронического лимфолейкоза (CLL), мелкоклеточной лимфомы, лейкоза, волосатоклеточного лейкоза (HCL), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL) и лимфомы из клеток мантийной зоны.

214. Способ по п.212, где пациенту вводят цитотоксическое средство в сочетании с конъюгатом антитело-лекарственное средство.

215. Изделие для лечения нарушения пролиферации В-клеток, содержащее

- фармацевтический состав по п.211;

- контейнер; и

- вкладыш или ярлык, указывающий, что соединение можно использовать для лечения злокачественной опухоли, характеризующейся сверхэкспрессией полипептида CD22.

216. Изделие по п.215, где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из лимфомы, неходжкинской лимфомы (NHL), агрессивной NHL, рецидивирующей агрессивной NHL, рецидивирующей медленно растущей NHL, рефракторной NHL, рефракторной медленно растущей NHL, хронического лимфолейкоза (CLL), мелкоклеточной лимфомы, лейкоза, волосатоклеточного лейкоза (HCL), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL) и лимфомы из клеток мантийной зоны.

217. Способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство, содержащего антитело против CD22 (Ab) по п.175, и ауристатин или молекулу майтанзиноидного лекарственного средства (D), где антитело присоединено к D с помощью линкера (L) через один или несколько свободных цистеиновых остатков сконструированного антитела с цистеиновыми заменами; причем конъюгат имеет формулу I:



где р равно 1, 2, 3 или 4;

где способ включает стадии:

(a) взаимодействия полученной в результате конструирования группы цистеина антитела с линкерным реагентом с образованием промежуточного продукта антитело-линкер (Ab-L); и

(b) взаимодействия Ab-L с активированной молекулой лекарственного средства D; в результате чего образуется конъюгат антитело-лекарственное средство;

или где способ включает стадии:

(c) взаимодействия нуклеофильной группы молекулы лекарственного средства с линкерным реагентом с образованием промежуточного продукта лекарственное средство-линкер (D-L); и

(d) взаимодействия D-L с полученной в результате конструирования группой цистеина антитела; в результате чего образуется конъюгат антитело-лекарственное средство.

218. Способ по п.217, дополнительно включающий стадию экспрессии антитела в клетках яичника китайского хомячка (СНО).

219. Способ по п.218, дополнительно включающий стадию обработки экспрессированного антитела восстановителем.

220. Способ по п.219, где восстановитель выбран из ТСЕР и DTT.

221. Способ по п.219, дополнительно включающий стадию обработки экспрессированного антитела окислителем после обработки восстановителем.

222. Способ по п.221, где окислитель выбран из сульфата меди, дегидроаскорбиновой кислоты и воздуха.

223. Антитело по п.175, где антитело содержит последовательность тяжелой цепи, выбранную из любой последовательности SEQ ID NO:88, 92 или 93.

224. Антитело по п.175, где антитело содержит последовательность легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO:87 или 91.

225. Антитело по п.175, где антитело содержит последовательность легкой цепи SEQ ID NO:87 и последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:92.

226. Антитело по п.175, где антитело содержит последовательность легкой цепи SEQ ID NO:87 и последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:93.

227. Антитело по п.175, где антитело содержит последовательность легкой цепи SEQ ID NO:91 и последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:88.

Описание изобретения к патенту

Эта заявка представляет собой непредварительную заявку, поданную в соответствии с 37 CFR раздел 1.53(b), по которой испрашивается приоритет в соответствии с 35 USC раздел 119(e) предварительных заявок США с серийными номерами 60/809328, поданной 30 мая 2006 года, 60/908941, поданной 29 марта 2007 года, и 60/911829, поданной 13 апреля 2007 года, полное содержание которых, таким образом, приведено в описании в качестве ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к антителам к CD22 и их иммуноконъюгатам. Изобретение, кроме того, относится к способам применения антител к CD22 и их иммуноконъюгатов.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Лимфоциты представляют собой один из многих типов лейкоцитов, образующихся в костном мозге в процессе гемопоэза. Существуют две популяции лимфоцитов: B-лимфоциты (B-клетки) и T-лимфоциты (T-клетки). В настоящей заявке лимфоцитами, представляющими особый интерес, являются B-клетки.

B-клетки созревают в костном мозге и покидают костный мозг, экспрессируя на своей поверхности антигенсвязывающее антитело. Когда наивная B-клетка впервые встречает антиген, к которому специфично ее связанное с мембраной антитело, клетка начинает быстро делиться и ее потомство дифференцируется в B-клетки памяти и эффекторные клетки, называемые "плазматические клетки". B-клетки памяти обладают более длительной продолжительностью жизни и продолжают экспрессировать связанное с мембраной антитело с той же специфичностью, что и исходная родительская клетка. Плазматические клетки не продуцируют связанное с мембраной антитело, но вместо этого продуцируют антитело в форме, которую можно секретировать. Секретируемые антитела являются основными эффекторными молекулами гуморального иммунитета.

Связанные с B-клетками нарушения включают, в качестве неограничивающих примеров, злокачественную лимфому (неходжкинская лимфома, NHL), множественную миелому и хронический лимфолейкоз (CLL, B-клеточный лейкоз (CD5+ B-лимфоциты). Неходжкинские лимфомы (NHL), гетерогенная группа злокачественных опухолей, преимущественно возникающих из B-лимфоцитов, представляют собой приблизительно 4% всех вновь диагностированных злокачественных опухолей (Jemal, A. et al., CA-Cancer J. Clin., 52: 23-47, (2002)). Агрессивная NHL включает приблизительно 30-40% взрослых NHL (Harris, N.L. et al., Hematol. J. 1: 53-66 (2001)) и включает диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому (DLBCL), лимфому мантийных клеток (MCL), лимфому периферических T-клеток и анапластическую крупноклеточную лимфому. Передовая сочетанная химиотерапия вылечивает менее чем половину пациентов с агрессивной NHL, и большинство пациентов, в конечном счете, умирают от этого заболевания (Fisher, R.I. Semin. Oncol. 27(suppl. 12): 2-8 (2000)).

Связанные с B-клетками нарушения также включают аутоиммунные заболевания. Аутоиммунные заболевания остаются клинически важными заболеваниями у людей. Как видно из названия, аутоиммунные заболевания воздействуют посредством собственной иммунной системы организма. Хотя у конкретных типов аутоиммунных заболеваний патологические механизмы отличаются, один из основных механизмов включает связывание определенных антител (называемых в настоящем документе как аутореактивные антитела или аутоантитела) с эндогенными белками организма. Доктора и ученые идентифицировали более 70 клинически определенных аутоиммунных заболеваний, включая ревматоидный артрит, рассеянный склероз, васкулит, иммуноопосредованный диабет и волчанку, такую как системная красная волчанка. Хотя многие аутоиммунные заболевания являются редкими - поражая менее 200000 индивидуумов - в совокупности эти заболевания поражают миллионы американцев, приблизительно пять процентов населения, где большинство заболеваний непропорционально поражает женщин. Хронический характер этих заболеваний приводит к громадной социальной и финансовой нагрузке.

Цитотоксические средства, нацеленные на поверхностные антигены B-клеток, представляют собой важный фокус лечения связанной с B-клетками злокачественной опухоли. Один такой поверхностный антиген B-клеток представляет собой CD20. Первым терапевтическим антителом, одобренным United States Food and Drug Administration для лечения рецидивирующей или устойчивой низкодифференцированной или фолликулярной NHL, был ритуксимаб (ритуксан; Genentech, Inc. (South San Francisco, CA) и IDEC Pharmaceutical Corp. (San Diego, CA)), химерное (мышь/человек) моноклональное антитело к CD20 (Leonard, J.P. et al., Clin. Cane. Res. 10: 5327-5334 (2004)).

Другие B-клеточные антигены, такие как CD19, CD22 и CD52, представляют мишени терапевтического потенциала для лечения лимфомы (Grillo-Lopez A.J. et al., Curr. Pharm. Biotechnol., 2: 301-11, (2001)). CD22 представляет собой 135 кДа рестриктированный B-клетками сиалогликопротеин, экспрессируемый только на поверхности B-клеток на поздних стадиях дифференцировки (Dorken, B. et al., J. Immunol. 136: 4470-4479 (1986)). Преобладающей формой CD22 у людей является CD22-бета, который содержит во внеклеточном домене семь доменов иммуноглобулинового суперсемейства (фиг.1) (Wilson, G.L. et al., J. Exp. Med. 173: 137-146 (1991)). У другой формы, CD22-альфа, отсутствуют домены иммуноглобулинового суперсемейства 3 и 4 (Stamenkovic, I. and Seed, B., Nature 345: 74-77 (1990)). Показано, что связывание лигандов с CD22 человека ассоциировано с доменами иммуноглобулинового суперсемейства 1 и 2 (также обозначаемыми как эпитопы 1 и 2) (Engel, P. et al., J. Exp. Med. 181: 1581-1586, 1995).

При B-клеточной NHL экспрессия CD22 находится в диапазоне от 91% до 99% в агрессивной и медленно растущей популяциях, соответственно (Cesano, A. et al., Blood 100: 350a (2002)). CD22 может функционировать в качестве компонента активационного комплекса B-клетки (Sato, S. et al., Semin. Immunol. 10: 287-296 (1998)) и в качестве молекулы адгезии (Engel, Pl et al., J. Immunol. 150:4719-4732 (1993)). B-клетки мышей с отсутствием CD22 обладают более короткой продолжительностью жизни и усиленным апоптозом, что свидетельствует о ключевой роли этого антигена в жизнеспособности B-клеток (Otipoby, K.L. et al., Nature (Lond) 384: 634-637 (1996)). После связывания с ее природным лигандом(ами) или антителами CD22 быстро интернализуется, обеспечивая мощный костимулирующий сигнал в первичных B-клетках и проапоптотические сигналы в неопластических B-клетках (Sato, S. et al., Immunity 5: 551-562 (1996)).

Антитела к CD22 исследовали в качестве потенциальных лекарственных средств для B-клеточных злокачественных опухолей и других B-клеточных пролиферативных заболеваний. Такие антитела к CD22 включают RFB4 (Mansfield, E. et al., Blood 90: 2020-2026 (1997)), CMC-544 (DiJoseph, J.F., Blood 103: 1807-1814 (2004)) и LL2 (Pawlak-Byczkowska, E.J. et al., Cancer Res. 49: 4568-4577 (1989)). Антитело LL2 (ранее называемое HPB-2) представляет собой моноклональное антитело IgG2a мыши, направленное к антигену CD22 (Pawlak-Byczkowska, E.J. et al., (1989), выше). Иммуногистохимические анализы in vitro продемонстрировали реактивность антитела LL2 относительно 50 из 51 тестируемых образцов B-клеточной NHL, но не относительно других злокачественных опухолей или нормальных лимфоидных тканей (Pawlak-Byczkowska (1989), выше; Stein, R. et al., Cancer Immunol. Immunother. 37: 293-298 (1993)).

Применение конъюгатов антитело-лекарственное средство для локальной доставки цитотоксических или цитостатических средств, т.е. лекарственных средств для уничтожения или ингибирования опухолевых клеток при лечении злокачественной опухоли (Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26: 151-172; патент США 4975278), обеспечивает направленную доставку молекулы лекарственного средства к опухолям и накопление внутри них, когда системное введение этих неконъюгированных лекарственных средств может приводить к неприемлемым уровням токсичности для нормальных клеток, также как и для опухолевых клеток, которые необходимо устранить (Baldwin et al., (1986) Lancet pp.(Mar. 15, 1986): 603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", в Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al., (ed.), p.475-506). Таким образом добиваются максимальной эффективности с минимальной токсичностью. Как о пригодных при этих стратегиях сообщалось и о поликлональных антителах, и о моноклональных антителах (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21: 183-87). Лекарственные средства, применяемые в этих способах, включают дауномицин, доксорубицин, метотрексат и виндезин (Rowland et al., Cancer Immunol. Immunother. 21: 183-87 (1986)). Токсины, применяемые в конъюгатах антитело-токсин, включают бактериальные токсины, такие как дифтерийный токсин, растительные токсины, такие как рицин, низкомолекулярные токсины, такие как гелданамицин (Kerr et al., (1997) Bioconjugate Chem. 8(6): 781-784; Mandler et al., (2000) Journal of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al., (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al., (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786-791), майтанзиноиды (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623) и калихимицин (Lode et al., (1998) Cancer Res. 58: 2928; Hinman et al., (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342). Токсины могут осуществлять свое цитотоксическое и цитостатическое действие посредством механизмов, включающих связывание тубулина, связывание ДНК или ингибирование топоизомеразы (Meyer, D.L. and Senter, P.D. "Recent Advances in Antibody Drug Conjugates for Cancer Therapy" в Annual Reports in Medicinal Chemistry, Vol.38 (2003) Chapter 23, 229-237). Некоторые цитотоксические лекарственные средства при конъюгации с большими антителами или белковыми лигандами рецепторов имеют тенденцию становиться неактивными или менее активными.

ZEVALIN® (зевалин®) (ибритумомаб тиуксетан, Biogen/Idec) представляет собой конъюгат антитело-радиоактивный изотоп, состоящий из моноклонального антитела IgG1 каппа мыши, направленного к антигену CD20, находящемуся на поверхности нормальных и злокачественных B-лимфоцитов, и радиоактивного изотопа ¹¹¹In или ⁹⁰Y, связанного посредством тиомочевинного линкера-хелатора (Wiseman et al., (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7): 766-77; Wiseman et al., (2002) Blood 99(12): 4336-42; Witzig et al., (2002) J. Clin. Oncol. 20(10): 2453-63; Witzig et al., (2002) J. Clin. Oncol. 20(15): 3262-69). Хотя зевалин обладает активностью против B-клеточной неходжкинской лимфомы (NHL), введение у большинства пациентов приводит к тяжелым и продолжительным цитопениям. В 2000 году для лечения острого миелолейкоза посредством инъекции одобрен MYLOTARG (милотарг ) (гемтузумаб озогамицин, Wyeth Pharmaceuticals), конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из антитела CD33 человека, связанного с калихимицином (Drugs of the Future (2000) 25(7):686; патенты США № 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Для лечения злокачественных опухолей, экспрессирующих антиген CanAg, таких как злокачественная опухоль толстого кишечника, поджелудочной железы, желудка и других, разработан кантузумаб мертанзин (Immunogen, Inc.), конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из антитела huC242, связанного посредством дисульфидного линкера SPP с молекулой майтанзиноидного лекарственного средства, DM1. В разработке для потенциального лечения опухолей предстательной железы находится MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologies, Immunogen Inc.), конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из моноклонального антитела к специфическому мембранному антигену простаты (PSMA), связанного с молекулой майтанзиноидного лекарственного средства, DM1. Ту же молекулу майтанзиноидного лекарственного средства, DM1, посредством недисульфидного линкера, SMCC, связали с моноклональным антителом мыши, TA.1 (Chari et al., (1992) Cancer Research 52: 127-131). Сообщалось, что этот конъюгат в 200 раз менее эффективен, чем соответствующий конъюгат с дисульфидным линкером. В приведенном документе предположено, что линкер SMCC был "нерасщепляемым".

Из морского моллюска, Dolabella auricularia, выделено несколько коротких пептидных соединений и обнаружено, что они обладают биологической активностью (Pettit et al., (1993) Tetrahedron 49: 9151; Nakamura et al., (1995) Tetrahedron Letters 36: 5059-5062; Sone et al., (1995) Journal Org. Chem. 60: 4474). Также получены аналоги этих соединений и для некоторых из них обнаружено, что они обладают биологической активностью (для ознакомления, см. Pettit et al., (1998) Anti-Cancer Drug Design 13: 243-277). Например, ауристатин E (US 5635483) представляет собой синтетический аналог природного морского продукта доластатина 10, средства, ингибирующего полимеризацию тубулина посредством связывания того же участка на тубулине, что и противораковое лекарственное средство винкристин (G.R. Pettit, (1997) Prog. Chem. Org. Nat. Prod. 70: 1-79). Доластатин 10, ауристатин PE и ауристатин E представляют собой линейные пептиды из четырех аминокислот, три из которых являются уникальными для соединений класса доластатина, и C-концевой амид.

Ауристатиновые пептиды, ауристатин E (AE) и монометилауристатин (MMAE), синтетические аналоги доластатина, конъюгировали с (i) химерными моноклональными антителами cBR96 (специфичными к антигенам Lewis Y на карциномах); (ii) cAC10, специфичным к CD30 на злокачественных новообразованиях гематологического происхождения (Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4): 765-773; Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7): 778-784; "Monometylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"; Francisco et al. (2003) Blood 102(4): 1458-1465; US 2004/0018194); (iii) антителами к CD20, такими как Rituxan® (ритуксан®, ритуксимаб) (WO 04/032828), для лечения экспрессирующих CD20 злокачественных опухолей и иммунных нарушений; (iv) антителами к EphB2 2H9 и антителами к IL-8 для лечения колоректального рака (Mao, et al. (2004) Cancer Research 64(3): 781-788); (v) антителом к E-селектину (Bhaskar et al. (2003) Cancer Res. 63: 6387-6394) и (vi) другими антителами к CD30 (WO 03/043583). Монометилауристатин (MMAE) также конъюгировали с 2H9 антителом к EphB2R, который представляет собой т/м тирозинкиназный рецептор 1 типа с большой гомологией у мыши и человека и который сверхэкспрессирован в клетках колоректального рака (Mao et al. (2004) Cancer Res. 64: 781-788).

Монометилауристатин MMAF, вариант ауристатина E (MMAE) с фенилаланином на C-конце (патент США № 5767237; патент США № 6124431), является менее сильнодействующим, чем MMAE, но более сильнодействующим при конъюгации с моноклональными антителами (Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, реферат номер 623, представленный 28 марта 2004 года). Ауристатин F фенилендиамин (AFP); вариант MMAE с фенилаланином соединяли с mAb к CD70, 1F6, посредством C-конца 1F6 через фенилендиаминовый спейсер (Law et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, реферат номер 625, представленный 28 марта 2004 года).

В качестве возможных терапевтических соединений также исследовали конъюгаты антитело к CD22-токсину. Например, в прежних публикациях в качестве противораковых средств описаны содержащие цепь рицина A иммунотоксины, направленные к анти-CD22 (May, R.D. et al., Chemical Abstracts 106(21): 168656x pages 35-36 (1987); Ghetie, M.A. et al., Cancer Research 48: 2610-2617 (1988); и Amlot, P.L. et al., Blood 82(9):2624-2633 (1993)). В случае если токсин представлял собой радиоактивный изотоп, для эпратузумаба, гуманизированной версии (привитая на CDR) IgG1 LL2, показано наличие терапевтической активности радиоиммуноконъюгата (Juweid, M.E. et al., Clin. Cancer Res. 5 (Suppl 10): 3292s-3303s (1999); Griffiths, G.L. et al., J. Nucl. Med. 44: 77-84 (2003); Linden, O. et al., Clin. Cancer Res. 5(suppl 10): 3287s-3291s (1999)).

В данной области существует необходимость в дополнительных лекарственных средствах для лечения различных связанных с B-клетками злокачественных опухолей, таких как лимфомы, такая как неходжкинская лимфома и другие B-клеточные пролиферативные нарушения. Особенно пригодные для данной цели лекарственные средства включают направленные к B-клеткам против CD22 конъюгаты антитело-лекарственное средство, обладающие значительно меньшей токсичностью, при приемлемой терапевтической эффективности. Настоящее изобретение относится к этим и другим ограничениям и проблемам прошлого.

Приведение в данной заявке любой ссылки не является признанием того, что ссылка относится к известному уровню техники для данной заявки. Все цитируемые в данном документе ссылки, включая патенты, патентные заявки и публикации, в полном объеме включены в качестве ссылки.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к антителам к CD22 и способам их использования.

В одном из аспектов предоставлено антитело, связывающееся с CD22, где антитело содержит, по меньшей мере, одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из

(1) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;

(2) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;

(3) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6;

(4) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10;

(5) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; и

(6) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

В другом аспекте антитело, связывающееся с CD22, содержит (a) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (b) по меньшей мере, одну, две, три, четыре или пять HVR, выбранных из

(1) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;

(2) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;

(3) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6;

(4) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; и

(6) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

В другом аспекте антитело, связывающееся с CD22, содержит (a) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и (b) по меньшей мере, одну, две, три, четыре или пять HVR, выбранных из

(1) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;

(2) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;

(3) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6;

(4) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; и

(6) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

В другом аспекте антитело, связывающееся с CD22, содержит (a) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и (b) по меньшей мере, одну, две, три, четыре или пять HVR, выбранных из

(1) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;

(2) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;

(3) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9;

(4) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; и

(5) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

В другом аспекте антитело, связывающееся с CD22, содержит (a) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и (b) по меньшей мере, одну, две, три, четыре или пять HVR, выбранных из

(1) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;

(2) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;

(3) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10;

(4) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; и

(5) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

В одном из вариантов осуществления антитело содержит HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. В одном из вариантов осуществления антитело дополнительно содержит HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В одном из вариантов осуществления антитело дополнительно содержит HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

В определенных вариантах осуществления любое из указанных выше антител дополнительно содержит, по меньшей мере, один каркас, выбранный из консенсусного каркаса подгруппы III VH и консенсусного каркаса подгруппы I VL.

В одном из аспектов предоставлено антитело, связывающееся с CD22, где антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 91%, по меньшей мере, на 92%, по меньшей мере, на 93%, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16. В одном из вариантов осуществления антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO: 16.

В одном из аспектов антитело дополнительно содержит вариабельный домен легкой цепи с последовательностью, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 91%, по меньшей мере, на 92%, по меньшей мере, на 93%, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17. В одном из вариантов осуществления антитело содержит вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO: 17.

В одном из аспектов антитело дополнительно содержит вариабельный домен легкой цепи с последовательностью, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 91%, по меньшей мере, на 92%, по меньшей мере, на 93%, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18. В одном из вариантов осуществления антитело содержит вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO: 18.

В одном из вариантов осуществления антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 91%, по меньшей мере, на 92%, по меньшей мере, на 93%, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98%, по меньшей мере, на 99% или на 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16 и вариабельный домен легкой цепи с последовательностью, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 91%, по меньшей мере, на 92%, по меньшей мере, на 93%, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98%, по меньшей мере, на 99% или на 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17. В одном из вариантов осуществления антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 91%, по меньшей мере, на 92%, по меньшей мере, на 93%, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98%, по меньшей мере, на 99% или на 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16 и вариабельный домен легкой цепи с последовательностью, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 91%, по меньшей мере, на 92%, по меньшей мере, на 93%, по меньшей мере, на 94%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98%, по меньшей мере, на 99% или на 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18. В одном из вариантов осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, а вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17. В одном из вариантов осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, а вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.

В определенных вариантах осуществления предоставлен полинуклеотид, кодирующий любое из указанных выше антител. В одном из вариантов осуществления предоставлен вектор, содержащий полинуклеотид. В одном из вариантов осуществления предоставлена клетка-хозяин, содержащая вектор. В одном из вариантов осуществления клетка-хозяин является эукариотической. В одном из вариантов осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку яичника китайского хомяка (CHO). В одном из вариантов осуществления предоставлен способ получения антитела к CD22, где способ включает культивирование клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии полинуклеотида, кодирующего антитело, и выделение антитела.

В одном из аспектов предоставлено антитело, связывающееся с CD22, экспрессируемым на поверхности клетки. В одном из вариантов осуществления антитело связывается с эпитопом в области CD22 человека или мыши, содержащей домен 1, или домен 2, или домены 1 и 2. В одном из вариантов осуществления клетка представляет собой клетку млекопитающего. В одном из вариантов осуществления клетка представляет собой клетку человека. В одном из вариантов осуществления клетка представляет собой злокачественную клетку. В одном из вариантов осуществления клетка представляет собой B-клетку. В одном из вариантов осуществления злокачественная клетка представляет собой B-клетку.

В определенных вариантах осуществления любое из указанных выше антител представляет собой моноклональное антитело. В одном из вариантов осуществления антитело представляет собой фрагмент антитела, выбранный из фрагментов Fab, Fab'-SH, Fv, scFv или (Fab')₂. В одном из вариантов осуществления антитело является гуманизированным. В одном из вариантов осуществления антитело представляет собой антитело человека.

В одном из аспектов предоставлен способ выявления присутствия CD22 в биологическом образце, где способ включает приведение биологического образца в контакт с любым из указанных выше антител в условиях, позволяющих связывание антитела с CD22, и выявление того, образовался ли комплекс между антителом и CD22. В одном из вариантов осуществления биологический образец содержит B-клетки. В одном из вариантов осуществления биологический образец получен у млекопитающего с B-клеточным нарушением и/или с B-клеточным пролиферативным нарушением, включая в качестве неограничивающих примеров лимфому, неходжкинскую лимфому (NHL), агрессивную NHL, рецидивирующую агрессивную NHL, рецидивирующую медленно растущую NHL, рефракторную NHL, рефракторную медленно растущую NHL, хронический лимфолейкоз (CLL), мелкоклеточную лимфому, лейкоз, волосатоклеточный лейкоз (HCL), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL) и лимфому мантийных клеток, или у млекопитающего с подозрением этого нарушения.

В одном из аспектов предоставлен способ диагностики клеточного пролиферативного нарушения, ассоциированного с увеличенной экспрессией CD22, где способ включает приведение тестируемой клетки в контакт с любым из указанных выше антител; определение уровня экспрессии CD22 посредством определения связывания антитела с CD22; и сравнения уровня экспрессии CD22 тестируемой клеткой с уровнем экспрессии CD22 контрольной клеткой, где более высокий уровень экспрессии CD22 тестируемой клеткой по сравнению с контрольной клеткой указывает на наличие клеточного пролиферативного нарушения, ассоциированного с увеличенной экспрессией CD22. В одном из вариантов осуществления тестируемая клетка представляет собой клетку пациента с подозрением на наличие клеточного пролиферативного нарушения, такого как B-клеточное пролиферативное нарушение. В одном из вариантов осуществления клеточное пролиферативное нарушение выбрано из B-клеточных нарушений, включающих в качестве неограничивающих примеров лимфому, неходжкинскую лимфому (NHL), агрессивную NHL, рецидивирующую агрессивную NHL, рецидивирующую медленно растущую NHL, рефракторную NHL, рефракторную медленно растущую NHL, хронический лимфолейкоз (CLL), мелкоклеточную лимфому, лейкоз, волосатоклеточный лейкоз (HCL), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL) и лимфому мантийных клеток. В одном из вариантов осуществления способ включает определение уровня экспрессии CD22 на поверхности тестируемой клетки и сравнение уровня экспрессии CD22 на поверхности тестируемой клетки с уровнем экспрессии CD22 на поверхности контрольной клетки.

В одном из аспектов предоставлен способ диагностики клеточного пролиферативного нарушения, ассоциированного с увеличением количества клеток, таких как B-клетки, экспрессирующие CD22, где способ включает приведение тестируемых клеток в биологическом образце в контакт с любым из указанных выше антител; определение уровня антитела, связанного с тестируемыми клетками в образце посредством определения связывания антитела с CD22; и сравнение с уровнем антитела, связанного с клетками в контрольном образце, где уровень связанного антитела в тестируемом и контрольном образцах нормализован на количество экспрессирующих CD22 клеток и где более высокий уровень связанного антитела в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом указывает на наличие клеточного пролиферативного нарушения, ассоциированного с клетками, экспрессирующими CD22.

В одном из аспектов предоставлен способ определения растворимого CD22 в крови или сыворотке, где способ включает приведение тестируемого образца крови или сыворотки млекопитающего с подозрением на наличие B-клеточного пролиферативного нарушения в контакт с антителом к CD22 по изобретению и определение увеличения растворимого CD22 в тестируемом образце относительно контрольного образца крови или сыворотки нормального млекопитающего. В определенном варианте осуществления способ определения пригоден в качестве способа диагностики B-клеточного пролиферативного нарушения, ассоциированного с увеличением растворимого CD22 в крови или сыворотке млекопитающего.

В одном из аспектов антитела по изобретению включают модифицированные цистеином антитела, где одна или несколько аминокислот исходного антитела замещены аминокислотой свободного цистеина, как описано в WO 2006/034488 (включенной в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме). Так можно модифицировать, т.е. подвергнуть мутации, любую форму антитела к CD22. Например, можно модифицировать исходный Fab-фрагмент антитела так, чтобы получить модифицированный цистеином Fab, обозначенный в настоящем документе как "ThioFab". Подобным образом можно модифицировать исходное моноклональное антитело с получением "ThioMab". Следует отметить, что вследствие димерной природы антитела IgG одноучастковая мутация в тиофаб дает один полученный в результате конструирования цистеиновый остаток, тогда как одноучастковая мутация в тиомаб дает два полученных в результате конструирования цистеиновых остатка. Модифицированные цистеином антитела к CD22 по изобретению включают моноклональные антитела, гуманизированные или химерные моноклональные антитела и антигенсвязывающие фрагменты антител, слитые полипептиды и аналоги, которые предпочтительно связывают связанные с клетками полипептиды CD22. Модифицированное цистеином антитело может альтернативно содержать антитело, содержащее цистеин в описываемом в настоящем документе положении в антителе или Fab, полученный в результате конструирования последовательности и/или отбора антитела, без обязательного изменения исходного антитела, такого как посредством конструирования и отбора антитела посредством фагового дисплея или посредством конструирования каркасных последовательностей и константных областей легких цепей и/или тяжелых цепей de novo. Модифицированное цистеином антитело содержит одну или несколько аминокислот свободного цистеина со значением реакционноспособности тиоловых групп в диапазонах от 0,6 до 1,0; 0,7 до 1,0 или 0,8 до 1,0. Аминокислота свободного цистеина представляет собой остаток цистеина, полученный в результате конструирования в исходном антителе и не являющийся частью дисульфидного мостика. Модифицированные цистеином антитела пригодны для присоединения цитотоксических и/или визуализирующих соединений в участке встроенного цистеина, например, посредством малеимида или галогенацетила. Нуклеофильная реакционноспособность тиоловой функциональной группы остатка Cys по отношению к малеимидной группе приблизительно в 1000 раз больше, чем у любой другой функциональной группы аминокислот в белке, такой как аминогруппа остатков лизина или N-концевая аминогруппа. Специфичная для тиолов функциональная группа в йодацетильных и малеимидных реагентах может реагировать с аминогруппами, но необходимы более высокий pH (>9,0) и более длительное время реакции (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London).

В одном из вариантов осуществления модифицированное цистеином антитело к CD22 по изобретению содержит полученный в результате конструирования цистеин в любом из следующих положений, где положение представляет собой номер по Kabat et al. в легкой цепи (см. Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) и по нумерации EU в тяжелой цепи (включая Fc-область) (см. Kabat et al., (1991), выше), где константная область легкой цепи, обозначенная подчеркиванием на фиг.17A, начинается в положении 108 (нумерация Kabat), а константная область тяжелой цепи, обозначенная подчеркиванием на фиг.17B и 17C, начинается в положении 118 (нумерация EU). Положение также можно указать в виде его положения в последовательной нумерации аминокислот полноразмерных легкой цепи или тяжелой цепи, представленных на фиг.17A-17C. По одному из вариантов осуществления изобретения антитело к CD22 содержит полученный в результате конструирования цистеин в LC-V205C (нумерация Kabat: Val 205; последовательный номер 210 на фиг.17A модифицирован так, чтобы в этом положении находился Cys). Полученный в результате конструирования цистеин в легкой цепи на фиг.17A показан полужирным шрифтом с двойным подчеркиванием. По одному из вариантов осуществления антитело к CD22 содержит полученный в результате конструирования цистеин в HC-A118C (номер EU: Ala 118; последовательный номер 121 на фиг.17B модифицирован так, чтобы в этом положении находился Cys). Полученный в результате конструирования цистеин в тяжелой цепи приведен полужирным шрифтом с двойным подчеркиванием на фиг.17B. По одному из вариантов осуществления антитело к CD22 содержит полученный в результате конструирования цистеин Fc-S400C (номер EU: Ser 400; последовательный номер 403 на фиг.17C модифицирован так, чтобы в этом положении находился Cys). Полученный в результате конструирования цистеин в Fc-области тяжелой цепи приведен на фиг.17C полужирным шрифтом с двойным подчеркиванием. В других вариантах осуществления полученный в результате конструирования цистеин тяжелой цепи (включая Fc-область) находится в любом из указанных положений: (по нумерации EU): 41, 88, 116, 118, 120, 171, 282, 375 или 400. Таким образом, изменения аминокислот в этих положениях в исходном антителе к CD22 по изобретению представляют собой: A41C, A88C, S116C, A118C, T120C, A171C, V282C, S375C или S400C. В других вариантах осуществления полученный в результате конструирования цистеин легкой цепи находится в любом из указанных положений (по нумерации Kabat): 15, 43, 110, 144, 168, 205. Таким образом, изменения аминокислот в этих положениях в исходном антителе к CD22 по изобретению представляют собой: V15C, A43C, V110C, A144C, S168C или V205C.

Модифицированное цистеином антитело к CD22 содержит одну или несколько аминокислот свободного цистеина, где модифицированное цистеином антитело к CD22 связывается с полипептидом CD22 и получено способом, включающим замену одного или нескольких аминокислотных остатков исходного антитела к CD22 цистеином, где исходное антитело содержит, по меньшей мере, одну последовательность HVR, выбранную из

(a) последовательности HVR-L1 RSSQSIVHSNGNTFLE (SEQ ID NO: 9) или последовательности HVR-L1 RSSQSIVHSVGNTFLE (SEQ ID NO: 10) (фиг.2B);

(b) последовательности HVR-L2 KVSNRFS SEQ ID NO: 12 (фиг.2B);

(c) последовательности HVR-L3 FQGSQFPYT (SEQ ID NO: 14) (фиг.2B);

(d) последовательности HVR-H1 GYEFSRSWMN (SEQ ID NO: 2) (фиг.2A);

(e) последовательности HVR-H2 GRIYPGDGDTNYSGKFKG (SEQ ID NO: 4 (фиг.2A) и

(f) последовательности HVR-H3 DGSSWDWYFDV (SEQ ID NO: 6) (фиг.2A).

В определенном аспекте изобретение относится к модифицированному цистеином антителу к CD22, содержащему аминокислотную последовательность, по меньшей мере, приблизительно с 80% идентичностью аминокислотных последовательностей, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно с 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотных последовательностей с модифицированным цистеином антителом с полноразмерной аминокислотной последовательностью, как описано в настоящем документе, или с аминокислотной последовательностью модифицированного цистеином антитела без сигнального пептида, как описано в настоящем документе.

В еще одном дополнительном аспекте изобретение относится к выделенному модифицированному цистеином антителу к CD22, содержащему аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, гибридизующейся с комплементарной молекулой ДНК, кодирующей (a) модифицированное цистеином антитело с полноразмерной аминокислотной последовательностью, как описано в настоящем документе, (b) аминокислотную последовательность модифицированного цистеином антитела без сигнального пептида, как описано в настоящем документе, (c) внеклеточный домен белка трансмембранного модифицированного цистеином антитела, с сигнальным пептидом или без него, как описано в настоящем документе, (d) аминокислотную последовательность, кодируемую любой из последовательностей нуклеиновой кислоты, описываемых в настоящем документе, или (e) любой другой конкретно определенный фрагмент полноразмерной аминокислотной последовательности модифицированного цистеином антитела, как описано в настоящем документе.

В конкретном аспекте изобретение относится к выделенному модифицированному цистеином антителу к CD22 без N-концевой сигнальной последовательности и/или без инициирующего метионина и кодируемому нуклеотидной последовательностью, кодирующей такую аминокислотную последовательность, как описано в настоящем документе. Способы их получения также описаны в настоящем документе, где эти способы включают культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор, содержащий соответствующую кодирующую молекулу нуклеиновой кислоты, в условиях, подходящих для экспрессии модифицированного цистеином антитела, и восстановление модифицированного цистеином антитела из клеточной культуры.

Другой аспект изобретения относится к выделенному модифицированному цистеином антителу к CD22 с удаленным трансмембранным доменом или инактивированным трансмембранным доменом. Способы их получения также описаны в настоящем документе, где эти способы включают культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор, содержащий соответствующую кодирующую молекулу нуклеиновой кислоты, в условиях, подходящих для экспрессии модифицированного цистеином антитела, и восстановление модифицированного цистеином антитела из клеточной культуры.

В других вариантах осуществления изобретение относится к выделенным химерным модифицированным цистеином антителам к CD22, содержащим любое из описанных в настоящем документе модифицированных цистеином антител, слитых с гетерологичным (не являющимся CD22) полипептидом. Пример таких химерных молекул включает любое из описанных в настоящем документе модифицированных цистеином антител, слитое с гетерологичным полипептидом, например, таким как концевая последовательность эпитопа или Fc-область иммуноглобулина.

Модифицированное цистеином антитело к CD22 может представлять собой моноклональное антитело, фрагмент антитела, химерное антитело, гуманизированное антитело, одноцепочечное антитело или антитело, конкурентно ингибирующее связывание антитело к полипептиду CD22 с его соответствующим антигенным эпитопом. Антитела по настоящему изобретению необязательно могут быть конъюгированы с ингибирующим рост средством или цитотоксическим средством, таким как токсин, включая, например, ауристатин, антибиотик, радиоактивный изотоп, нуклеаза или т.п. Антитела по настоящему изобретению необязательно можно получать в клетках CHO или бактериальных клетках, и они предпочтительно ингибируют рост или пролиферацию или индуцируют гибель клетки, с которой они связываются. Для диагностических целей антитела по настоящему изобретению можно метить детектируемой меткой, присоединять к твердой подложке или т.п.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения изобретение относится к векторам, содержащим ДНК, кодирующую любое из описанных в настоящем документе антител к CD22 и модифицированных цистеином антител к CD22. Также предоставлены клетки-хозяева, содержащие любой такой вектор. В качестве примера клетки-хозяева могут представлять собой клетки CHO, клетки E.coli или дрожжевые клетки. Дополнительно предоставлен способ получения любого из описанных в настоящем документе полипептидов, и он включает культивирование клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии описанного полипептида, и восстановление желаемого полипептида из клеточной культуры.

Модифицированные цистеином антитела могут быть пригодными при лечении злокачественной опухоли, и они включают антитела, специфичные для клеточной поверхности и трансмембранных рецепторов и опухолеспецифических антигенов (TAA). Такие антитела можно использовать в виде свободных антител (неконъюгированных с лекарственным средством или молекулой-меткой) или в виде конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC). Модифицированные цистеином антитела по изобретению могут быть сайт-специфически и эффективно связаны с реагирующим с тиолами реагентом. Реагирующий с тиолами реагент может представлять собой полифункциональный линкер, метку захвата, флуорофор или промежуточное соединение лекарственное средство-линкер. Модифицированное цистеином антитело можно метить детектируемой меткой, иммобилизовать на твердофазной подложке и/или конъюгировать с молекулой лекарственного средства. Реакционноспособность тиоловых групп может являться общей для любого антитела, где можно провести замену аминокислот реакционноспособными аминокислотами цистеина в диапазонах в легкой цепи, выбранных из диапазонов аминокислот: от L-10 до L-20; от L-38 до L-48; от L-105 до L-115; от L-139 до L-149; от L-163 до L-173; и в диапазонах в тяжелой цепи, выбранных из диапазонов аминокислот: от H-35 до H-45; от H-83 до H-93; от H-114 до H-127 и от H-170 до H-184, и в Fc-области в диапазонах, выбранных из диапазонов от H-268 до H-291; от H-319 до H-344; от H-370 до H-380 и от H-395 до H-405, где нумерация положений аминокислот начинается в положении 1 по системе нумерации Kabat (Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD), а затем последовательно продолжается, как описано в WO 2006034488. Реакционноспособность тиоловых групп также может являться общей для определенных доменов антитела, таких как константный домен легкой цепи (CL) и константные домены тяжелых цепей, CH ₁, CH₂ и CH₃. Можно проводить замены на цистеин, приводящие к значениям реакционноспособности тиоловых групп 0,6 и выше в константных доменах , , , и µ тяжелых цепей исходных антител: IgA, IgD, IgE, IgG, и IgM, соответственно, включая подклассы IgG: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Такие антитела и их использование описаны в WO 2006/034488.

Модифицированные цистеином антитела по изобретению предпочтительно сохраняют антигенсвязывающую способность их вариантов исходных антител дикого типа. Таким образом, модифицированные цистеином антитела способны к связыванию, предпочтительно специфическому, с антигенами. Такие антигены включают, например, опухолеспецифические антигены (TAA), белки рецепторов клеточной поверхности и другие молекулы клеточной поверхности, трансмембранные белки, сигнальные белки, факторы, регулирующие жизнеспособность клеток, факторы, регулирующие клеточную пролиферацию, молекулы, ассоциированные (например, известные или предположительно функционально способствующие) с развитием или дифференцировкой тканей, лимфокины, цитокины, молекулы, вовлеченные в регуляцию клеточного цикла, молекулы, вовлеченные в ангиогенез, и молекулы, ассоциированные (например, известные или предположительно функционально способствующие) с ангиогенезом. Опухолеспецифический антиген может представлять собой фактор кластера дифференцировки (т.е. белок CD, включая в качестве неограничивающих примеров CD22). Модифицированные цистеином антитела к CD22 по изобретению сохраняют способность связывать антиген их вариантов исходных антител к CD22 дикого типа. Таким образом, модифицированные цистеином антитела к CD22 по изобретению способны к связыванию, предпочтительно специфическому, с антигенами CD22, включая изоформы анти-CD22-бета и/или -альфа человека, включая варианты, когда такие антигены экспрессированы на поверхности клеток, включая в качестве неограничивающих примеров B-клетки.

Антитело по изобретению можно конъюгировать с другими реагирующими с тиолами средствами, в которых реактивная группа представляет собой, например, малеимид, йодацетамид, пиридилдисульфид или другой реагирующий с тиолами партнер по конъюгации (Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. в Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, p.40-55, 643-671). Партнер может представлять собой цитотоксическое средство (например, токсин, такой как доксорубицин или токсин коклюша), флуорофор, такой как флуоресцентный краситель, подобно флуоресцеину или родамину, хелатирующее средство для визуализации или радиотерапевтический металл, пептидную или непептидную метку, или детектируемую метку, или измеряющее клиренс средство, такое как различные изомеры полиэтиленгликоля, пептид, который связывает третий компонент, или другое углеводное или липофильное средство.

В одном из аспектов антитела по изобретению можно конъюгировать с любой молекулой-меткой, которую можно ковалентно присоединить к антителу посредством реакционноспособной группы, активируемой группы или реакционноспособной тиоловой группы цистеина (Singh et al., (2002) Anal. Biochem. 304: 147-15; Harlow E. and Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Lundblad R.L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, FL). Присоединенная метка может функционировать для (i) обеспечения детектируемого сигнала; (ii) взаимодействия со второй меткой для модификации детектируемого сигнала, обеспечиваемого первой или второй меткой, например, для получения FRET (резонансного переноса энергии флуоресценции); (iii) стабилизации взаимодействий или увеличения аффинности связывания с антигеном или лигандом; (iv) воздействия на подвижность, например, электрофоретическую подвижность или клеточную проницаемость, посредством заряда, гидрофобности, формы или других физических параметров, или (v) обеспечения захватывающей группы для модуляции аффинности лиганда, связывания антитела/антигена или ионного комплексообразования.

Меченные модифицированные цистеином антитела могут быть пригодными в диагностических анализах, например, для детекции экспрессии представляющего интерес антигена в конкретных клетках, тканях или сыворотке. Для диагностических приложений антитело, как правило, метят детектируемой группой. Доступно множество меток, которые, как правило, можно сгруппировать в следующие категории:

Радиоактивные изотопы (радионуклиды), такие как ³H, ¹¹C, ¹⁴C, ¹⁸F, ³²P, ³⁵S, ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ⁸⁶Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹ I, ¹³³Xe, ¹⁷⁷Lu, ²¹¹At или ²¹³Bi. Меченные радиоактивными изотопами антитела пригодны для экспериментов, направленных на визуализацию рецепторов. Антитело можно метить реагентами лигандов, которые связывают, хелатируют или иным образом образуют комплекс с радиоактивным изотопом металла, где реагент способен к реакции с тиолом полученного в результате конструирования цистеина в антителе, с использованием способов, описанных в Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, NY, Pubs. (1991). Хелатирующие лиганды, которые могут образовывать комплекс с ионом металла, включают DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA и TETA (Macrocyclics, Dallas, TX). Радионуклиды можно направлять посредством образования комплексов с конъюгатами антитело-лекарственное средство по изобретению (Wu et al., (2005) Nature Biotechnology 23(9): 1137-1146).

Линкерные реагенты, такие как DOTA-малеимид (4-малеимидобутирамидобензил-DOTA), можно получать реакцией аминобензил-DOTA с 4-малеимидомасляной кислотой (Fluka), активированной изопропилхлорформиатом (Aldrich) по способу Axworthy et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4): 1802-1807). Реагенты DOTA-малеимид вступают в реакцию с аминокислотами свободного цистеина модифицированных цистеином антител и образуют на антителе лиганд, образующий комплексы с металлами (Lewis et al., (1998) Bioconj. Chem. 9: 72-86). Хелатирующие линкерные метящие реагенты, такие как DOTA-NHS (моно (N-гидроксисукцинимидный сложный эфир) 1,4,7,10-тетраазациклододекан-l,4,7,10-тетрауксусной кислоты) являются коммерчески доступными (Macrocyclics, Dallas, TX). Направленная на рецепторы визуализация меченными радионуклидами антителами может обеспечить маркер активации каскадов реакций посредством детекции и количественного определения возрастающего накопления антител в опухолевой ткани (Albert et al., (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8: 1207-1210). Конъюгированные радиоактивные металлы после лизосомальной деградации могут оставаться внутри клеток.

Металл-хелатные комплексы, подходящие в качестве меток антител для визуализирующих экспериментов, описаны в патенте США 5342606; патенте США 5428155; патенте США 5316757; патенте США 5480990; патенте США 5462725; патенте США 5428139; патенте США 5385893; патенте США 5739294; патенте США 5750660; патенте США 5834456; Hnatowich et al., (1983) J. Immunol. Methods 65: 147-157; Meares et al., (1984) Anal. Biochem. 142: 68-78; Mirzadeh et al., (1990) Bioconjugate Chem. 1:59-65; Meares et al., (1990) J. Cancer 1990, Suppl. 10: 21-26; Izard et al., (1992) Bioconjugate Chem. 3: 346-350; Nikula et al., (1995) Nucl. Med. Biol. 22: 387-90; Camera et al., (1993) Nucl. Med. Biol. 20: 955-62; Kukis et al., (1998) J. Nucl. Med. 39: 2105-2110; Verel et al., (2003) J. Nucl. Med. 44: 1663-1670; Camera et al., (1994) J. Nucl. Med. 21: 640-646; Ruegg et al., (1990) Cancer Res. 50: 4221-4226; Verel et al., (2003) J. Nucl. Med. 44: 1663-1670; Lee et al., (2001) Cancer Res. 61: 4474-4482; Mitchell, et al., (2003) J. Nucl. Med. 44: 1105-1112; Kobayashi et al., (1999) Bioconjugate Chem. 10: 103-111; Miederer et al., (2004) J. Nucl. Med. 45: 129-137; DeNardo et al., (1998) Clinical Cancer Research 4: 2483-90; Blend et al., (2003) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18:355-363; Nikula et al., (1999) J. Nucl. Med. 40: 166-76; Kobayashi et al., (1998) J. Nucl. Med. 39: 829-36; Mardirossian et al., (1993) Nucl. Med. Biol. 20: 65-74; Roselli et al., (1999) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14: 209-20.

(b) Флуоресцентные метки, такие как редкоземельные хелаты (хелаты европия), классы флуоресцеина, включая FITC, 5-карбоксифлуоресцеин, 6-карбоксифлуоресцеин; классы родамина, включая TAMRA; дансил; лиссамин; цианины; фикоэритрины; техасский красный и их аналоги. Флуоресцентные метки можно конъюгировать с антителами с использованием способов, описанных, например, в Current Protocols in Immunology, выше. Флуоресцентные красители и реагенты флуоресцентных меток включают флуоресцентные красители и реагенты флуоресцентных меток, которые коммерчески доступны в Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR) и Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL).

(c) Доступны или описаны различные метки фермент-субстрат (патент США 4275149). Фермент, как правило, катализирует химическую модификацию хромогенного субстрата, которую можно измерять различными способами. Например, фермент может катализировать изменение окраски субстрата, которое можно измерять спектрофотометрически. Альтернативно фермент может изменять флуоресценцию или хемилюминесценцию субстрата. Способы количественной оценки изменения флуоресценции описаны выше. Хемилюминесцентный субстрат при химической реакции становится электронно-возбужденным, а затем может испускать свет, который можно измерять (например, с применением хемилюминометра), или передавать энергию флуоресцентному акцептору. Примеры ферментативных меток включают люциферазы (например, светлячковую люциферазу и бактериальную люциферазу; патент США 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, малатдегидрогеназу, уреазу, пероксидазу, такую как пероксидаза хрена (HRP), щелочную фосфатазу (AP), -галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, оксидазы сахаров (например, глюкозооксидаза, галактозооксидаза и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа), оксидазы гетероциклов (такие как уриказа и ксантиноксидаза), лактопероксидазу, микропероксидазу и т.п. Способы конъюгации ферментов с антителами описаны в O'Sullivan et al., (1981) "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", в Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73: 147-166.

Примеры сочетаний фермент-субстрат включают, например,

(i) пероксидазу хрена (HRP) с перекисью водорода в качестве субстрата, где перекись водорода окисляет предшественник красителя (например, ортофенилендиамин (OPD) или 3,3',5,5'-гидрохлорид тетраметилбензидина (TMB));

(ii) щелочную фосфатазу (AP) c пара-нитрофенилфосфатом в качестве хромогенного субстрата; и

(iii) -D-галактозидазу ( -D-Gal) с хромогенным субстратом (например, п-нитрофенил- -D-галактозидаза) или флуорогенным субстратом 4-метилумбеллиферил- -D-галактозидаза.

Специалистам в данной области доступно множество других сочетаний фермент-субстрат. Для общего обзора см. патент США 4275149 и патент США 4318980.

Метку можно непрямым способом конъюгировать с боковой цепью аминокислот, с активированной боковой цепью аминокислот, с модифицированным цистеином антителом и т.п. Например, антитело можно конъюгировать с биотином, а любую из трех широких категорий меток, указанных выше, можно конъюгировать с авидином или стрептавидином, или наоборот. Биотин селективно связывается со стрептавидином и, таким образом, метку можно конъюгировать с антителом таким непрямым способом. Альтернативно, для осуществления непрямой конъюгации метки с вариантом полипептида вариант полипептида конъюгируют с небольшим гаптеном (например, дигоксином), а один из различных типов меток, указанных выше, конъюгируют с вариантом полипептида против гаптена (например, антитело к дигоксину). Таким образом, можно осуществить непрямую конъюгацию метки с вариантом полипептида (Hermanson, G. (1996) в Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego).

Антитело по настоящему изобретению можно применять в любом известном способе анализа, таком как ELISA, анализы конкурентного связывания, прямой и непрямой сэндвич-анализы и анализы иммуноосаждения (Zola, (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158, CRC Press, Inc.).

Детектируемая метка может быть пригодной для локализации, визуализации и количественного определения события связывания или узнавания. Мечеными антителами по изобретению можно определять рецепторы клеточной поверхности. Другое использование детектируемо меченных антител представляет собой способ иммунозахвата на основе гранул, включающий конъюгацию гранул с флуоресцентно меченным антителом и детекцию флуоресцентного сигнала после связывания лиганда. В сходных способах детекции используют эффект поверхностного плазмонного резонанса (SPR) для измерения и детекции взаимодействий антитело-антиген.

Детектируемые метки, такие как флуоресцентные красители и хемилюминесцентные красители (Briggs et al., (1997) "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids", J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1: 1051-1058), обеспечивают детектируемый сигнал и, как правило, применимы для меченых антител, предпочтительно со следующими свойствами: (i) меченое антитело должно давать очень высокий сигнал с низким фоном так, чтобы небольшие количества антител можно было с высокой чувствительностью детектировать в бесклеточных и основанных на клетках анализах; и (ii) меченое антитело должно быть фотостабильным так, чтобы флуоресцентный сигнал можно было наблюдать, измерять и записывать без значительного фотообесцвечивания. Для применений, включающих связывание клеточной поверхности меченых антител с мембранами или клеточными поверхностями, в частности живых клеток, метки предпочтительно (iii) обладают хорошей растворимостью в воде для достижения эффективной концентрации конъюгатов и чувствительности детекции и (iv) являются нетоксичными для живых клеток так, чтобы не нарушать нормальных метаболических процессов в клетках или не вызывать преждевременную гибель клеток.

Прямое количественное определение интенсивности клеточной флуоресценции и подсчет событий флуоресцентного мечения, например, связывание конъюгатов пептид-краситель с клеточной поверхностью, можно проводить в системе (FMAT® 8100 HTS System, Applied Biosystems, Foster City, Calif.), которая автоматизирует смешивание и считывание, нерадиоактивные анализы с живыми клетками или гранулами (Miraglia, "Homogeneous cell- and bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) J. of Biomolecular Screening 4: 193-204). Использование меченых антител также включает анализы связывания поверхностных рецепторов, анализы иммунозахвата, твердофазный иммунофлуоресцентный анализ (FLISA), расщепление каспазой (Zheng, "Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo", (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 618-23; патент США 6372907), апоптоз (Vermes, "A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V" (1995) J. Immunol. Methods 184: 39-51) и цитотоксический анализ. Для идентификации позитивной или негативной регуляции молекулой, которая имеет мишень на клеточной поверхности, можно использовать способ флуориметрического анализа в микрообъемах (Swartzman, "A homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) Anal. Biochem. 271: 143-51).

Меченые антитела по изобретению пригодны в качестве биомаркеров и зондов для визуализации различными способами и средствами биомедицинской и молекулярной визуализации, такими как (i) MRI (магнитно-резонансная томография); (ii) MicroCT (компьютерная томография); (iii) SPECT (однофотонная эмиссионная компьютерная томография); (iv) PET (позитронно-эмиссионная томография) Chen et al., (2004) Bioconjugate Chem. 15: 41-49; (v) биолюминесценция; (vi) флуоресценция и (vii) ультразвук. Иммуносцинтиграфия представляет собой способ визуализации, при котором антитела, меченные радиоактивными веществами, вводят пациенту, животному или человеку и получают изображение участка в организме, где локализуется антитело (патент США 6528624). Визуализирующие биомаркеры можно объективно измерять и оценивать как индикатор нормальных биологических процессов, патогенетических процессов или фармакологического ответа на терапевтическое вмешательство. Биомаркеры могут быть нескольких типов: тип 0 представляют собой природные исторические маркеры заболевания и лонгитудинально коррелирует с известными клиническими индексами, например, обследование MRI синовиального воспаления при ревматоидном артрите; маркеры типа I выявляют эффект вмешательства в соответствии с механизмом действия, даже если механизм может не быть ассоциированным с клиническим исходом; маркеры типа II функционируют в качестве заместительных конечных точек, где изменение биомаркера или сигнал от него предполагает клиническое преимущество для "подтверждения" заданного ответа, такого как измерение эрозии костей при ревматоидном артрите посредством CT. Таким образом, визуализирующие биомаркеры могут предоставить фармакодинамическую (PD) терапевтическую информацию: (i) об экспрессии целевого белка, (ii) о связывании терапевтического средства с целевым белком, т.е. о селективности, и (iii) о фармакокинетических данных клиренса и времени полужизни. Преимущества визуализирующих биомаркеров in vivo относительно лабораторных биомаркеров включают неинвазивное воздействие, количественную оценку во всем организме, повторное дозирование и оценку, т.е. несколько временных точек и потенциально переносимое воздействие от преклинических (небольшое животное) к клиническим (человек) результатам. Для некоторых применений биовизуализация заменяет или минимизирует количество экспериментов на животных при преклинических исследованиях.

Способы мечения пептидов хорошо известны. См. Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer et al., (1975) Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T.S. Work and E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York; Lundblad, R.L. and Noyes, C.M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York; Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGryter, Berlin and New York; and Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.); De Leon-Rodriguez et al., (2004) Chem. Eur. J. 10: 1149-1155; Lewis et al., (2001) Bioconjugate Chem. 12: 320-324; Li et al., (2002) Bioconjugate Chem. 13: 110-115; Mier et al., (2005) Bioconjugate Chem. 16: 240-237.

Пептиды и белки, меченные двумя различными молекулами, флуоресцентным репортером и гасителем, в достаточной близости, претерпевают резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET). Репортерные группы, как правило, являются флуоресцентными красителями, которые возбуждаются световым излучением при определенной длине волны и переносят энергию на акцептор или гаситель, группу, с соответствующим сдвигом Стокса для эмиссии при максимальной яркости. Флуоресцентные красители включают молекулы с большой степенью ароматизации, такие как флуоресцеин и родамин и их производные. Флуоресцентный репортер в исходном пептиде может быть частично или в значительной степени погашен молекулой гасителя. После расщепления пептида пептидазой или протеазой можно измерять детектируемое увеличение флуоресценции (Knight, C. (1995) "Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes", Methods in Enzymology, Academic Press, 248: 18-34).

Меченые антитела по изобретению также можно использовать в качестве аффинного очищающего средства. В данном способе меченое антитело иммобилизовано на твердой фазе, такой как смола сефадекс или фильтровальная бумага, хорошо известными в данной области способами. Иммобилизованное антитело контактирует с образцом, содержащим очищаемый антиген, а затем подложку промывают подходящим растворителем, который удаляет по существу все вещество в образце за исключением очищаемого антигена, который связан с иммобилизованным вариантом полипептида. Наконец подложку отмывают другим подходящим растворителем, таким как глициновый буфер, pH 5,0, который высвобождает антиген от варианта полипептида.

Метящие реагенты, как правило, несут реакционноспособную функциональную группу, которая может реагировать (i) непосредственно с тиолом цистеина модифицированного цистеином антитела с формированием меченого антитела, (ii) с линкерным реагентом с формированием промежуточного продукта линкер-метка или (iii) с линкерным антителом с формированием меченого антитела. Реакционноспособная функциональная группа метящих реагентов включает малеимид, галогенацетил, сукцинимидиловый сложный эфир йодацетамида (например, NHS, N-гидроксисукцинимид), изотиоцианат, сульфонилхлорид, 2,6-дихлортриазинил, пентафлуорениловый сложный эфир и фосфорамидит, хотя также можно использовать другие функциональные группы.

Иллюстративной реакционноспособной функциональной группой является сложный N-гидроксисукцинимидильный эфир (NHS) заместителя карбоксильной группы детектируемой метки, например биотина или флуоресцентного красителя. Сложный NHS эфир метки можно заранее получать, выделять, очищать и/или характеризовать, или его можно получать in situ и подвергать реакции с нуклеофильной группой антитела. Как правило, карбоксильная форма метки активируется посредством реакции с определенным сочетанием карбодиимидного реагента, например дициклогексилкарбодиимида, диизопропилкарбодиимида или урониевого реагента, например TSTU (тетрафторборат O-(N-сукцинимидил)-N,N,N',N'-тетраметилурония), HBTU (гексафторфосфат O-бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония) или HATU (гексафторфосфат O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония); активатора, такого как 1-гидроксибензотриазол (HOBt) и N-гидроксисукцинимида с получением сложного NHS эфира метки. В некоторых случаях метку и антитело можно связывать посредством активации и реакции метки с антителом in situ с формированием конъюгата метка-антитело в одну стадию.

Другие активирующие и связывающие реагенты включают TBTU (гексафторфосфат 2-(1H-бензотриазо-1-ил)-1-1,3,3-тетраметилурония), TFFH (2-фтор-гексафторфосфат N,N',N'',N'''-тетраметилурония), PyBOP (гексафторфосфат бензотриазол-1-ил-окси-трис-пирролидинофосфония, EEDQ (2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин), DCC (дициклогексилкарбодиимид); DIPCDI (диизопропилкарбодиимид), MSNT (1-(мезитилен-2-сульфонил)-3-нитро-1H-1,2,4-триазол и арилсульфонилгалогениды, например, триизопропилбензолсульфонилхлорид.

Соединения альбуминсвязывающий пептид-Fab по изобретению:

В одном из аспектов, антитело по изобретению слито с альбуминсвязывающим белком. Связывание белками плазмы может представлять собой эффективный способ улучшения фармакокинетических свойств короткоживущих молекул. Альбумин представляет собой наиболее представленный белок в плазме. Альбуминсвязывающие пептиды (ABP), связывающие сывороточный альбумин, могут изменять фармакодинамику слитых белков с активными доменами, включая изменение захвата, проникновения и диффузии в тканях. Эти фармакодинамические параметры можно изменять посредством конкретного выбора соответствующей последовательности связывающего сывороточный альбумин пептида (патент США 20040001827). Ряд альбуминсвязывающих пептидов определен скринингом посредством фагового дисплея (Dennis et al., (2002) "Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins" J. Biol. Chem. 277: 35035-35043; WO 01/45746). Соединения по изобретению включают ABP последовательности указанные в (i) Dennis et al., (2002) J. Biol. Chem. 277: 35035-35043 в таблицах III и IV, страница 35038; (ii) патент США 20040001827 в [0076] SEQ ID NO: 9-22 и (iii) WO 01/45746 на страницах 12-13, все из которых включены в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. Альбуминсвязывающие (ABP)-Fab конструируют посредством слияния альбуминсвязывающего пептида с C-концом тяжелой цепи Fab в стехиометрическом соотношении 1:1 (1 ABP/1 Fab). Показано, что ассоциация этих ABP-Fab с альбумином увеличивала время полужизни антитела у кроликов и мышей более чем в 25 раз. Таким образом, описанные выше реакционноспособные остатки Cys можно вводить в эти ABP-Fab и использовать для сайт-специфической конъюгации с цитотоксическими лекарственными средствами с последующим изучением на животных in vivo.

Иллюстративные последовательности альбуминсвязывающих пептидов включают в качестве неограничивающих примеров аминокислотные последовательности, перечисленные в SEQ ID NO: 42-46:

CDKTHTGGGSQRLMEDICLPRWGCLWEDDF	SEQ ID NO: 42
QRLMEDICLPRWGCLWEDDF	SEQ ID NO: 43
QRLIEDICLPRWGCLWEDDF	SEQ ID NO: 44
RLIEDICLPRWGCLWEDD	SEQ ID NO: 45
DICLPRWGCLW	SEQ ID NO: 46

Конъюгаты антитело-лекарственное средство

В другом аспекте изобретение относится к иммуноконъюгатам или конъюгатам антитело-лекарственное средство (ADC), содержащим антитело, конъюгированное с цитотоксическим средством, таким как химиотерапевтическое средство, лекарственное средство, ингибирующее рост средство, токсин (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или их фрагменты) или радиоактивный изотоп (т.е. радиоконъюгат). В другом аспекте изобретение дополнительно относится к способам применения иммуноконъюгатов. В одном из аспектов иммуноконъюгат содержит любое из указанных выше антител к CD22, ковалентно присоединенное к цитотоксическому средству или детектируемому средству.

Использование конъюгатов антитело-лекарственное средство для локальной доставки цитотоксических или цитостатических средств, т.е. лекарственные средства для уничтожения или ингибирования опухолевых клеток при лечении злокачественной опухоли (Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172; патент США 4975278), обеспечивает направленную доставку молекулы лекарственного средства к опухолям и внутриклеточное накопление в них там, где системное введение этих неконъюгированных лекарственных средств, кроме опухолевых клеток, которые нужно удалить, может привести к неприемлемым уровням токсичности для нормальных клеток (Baldwin et al., (1986) Lancet pp.(Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", в Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al., (ed.s), pp.475-506). Таким образом, желательной является максимальная эффективность при минимальной токсичности. Сообщалось, что для этих способов пригодны и поликлональные антитела, и моноклональные антитела (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87). Лекарственные средства, используемые в этих способах, включают дауномицин, доксорубицин, метотрексат и виндезин (Rowland et al., (1986) выше). Токсины, используемые в конъюгатах антитело-токсин, включают бактериальные токсины, такие как дифтерийный токсин, растительные токсины, такие как рицин, низкомолекулярные токсины, такие как гелданамицин (Mandler et al., (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al., (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al., (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), майтанзиноиды (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623) и калихимицин (Lode et al., (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al., (1993) Cancer Res. 53:3336-3342). Токсины могут проявлять их цитотоксическое и цитостатическое действие посредством механизмов, включающих связывание тубулина, связывание ДНК или ингибирование топоизомеразы. Некоторые цитотоксические лекарственные средства, как правило, инактивируются или становятся менее активными при конъюгации с большими антителами или лигандами рецепторных белков.

ZEVALIN® (ибритумомаб тиуксетан, Biogen/Idec) представляет собой конъюгат антитело-радиоактивный изотоп, состоящий из моноклонального антитела IgG1 каппа мыши, направленного к антигену CD20, находящемуся на поверхности нормальных и злокачественных B-лимфоцитов, и радиоактивного изотопа ¹¹¹In или ⁹⁰Y, связанного тиомочевинным линкером-хелатором (Wiseman et al., (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al., (2002) Blood 99(12): 4336-42; Witzig et al., (2002) J. Clin. Oncol. 20(10): 2453-63; Witzig et al., (2002) J. Clin. Oncol. 20(15): 3262-69). Хотя зевалин обладает активностью в отношении B-клеточной неходжкинской лимфомы (NHL), введение приводит к тяжелым и длительным цитопениям у большинства пациентов. В 2000 году для лечения острого миелолейкоза посредством инъекции одобрен MILOTARG^TM (гемтузумаб озогамицин, Wyeth Pharmaceuticals), конъюгат антитело-лекарственное средство, составленный из антитела к huCD33, связанного с калихимицином (Drugs of the Future (2000) 25(7):686; патенты США № 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Фазу II испытаний для лечения злокачественных опухолей, экспрессирующих CanAg, таких как злокачественная опухоль толстого кишечника, поджелудочной железы, желудка и другие, проходит кантузумаб мертанзин (Immunogen, Inc.), конъюгат антитело-лекарственное средство, составленный из антитела huC242, связанного через дисульфидный линкер SPP с молекулой майтанзиноидного лекарственного средства, DM1. В разработке для возможного лечения опухолей предстательной железы находится MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), конъюгат антитело-лекарственное средство, составленный из моноклонального антитела к специфическому мембранному антигену простаты (PSMA), связанного с молекулой майтанзиноидного лекарственного средства, DM1. Ауристатиновые пептиды, ауристатин E (AE) и монометилауристатин (MMAE), синтетические аналоги доластатина, конъюгированы с химерными моноклональными антителами cBR96 (специфичными к Lewis Y на карциномах) и cACIO (специфичными к CD30 у гематологических злокачественных образований) (Doronina et al., (2003) Nature Biotechnology 21(7): 778-784) и находятся в стадии терапевтической разработки.

В настоящем документе описаны химиотерапевтические средства, пригодные для получения иммуноконъюгатов. Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые можно использовать, включают цепь A дифтерийного токсина, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь A экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь A рицина, цепь A абрина, цепь A модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, диантиновые белки, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогелин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецены. См., например, WO 93/21232, опубликованную 28 октября 1993 года. Для получения радиоконъюгированных антител доступно множество радионуклидов. Примеры включают ²¹² Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y и ¹⁸⁶Re. Конъюгаты антитела с цитотоксическим средством получают с применением множества бифункциональных связывающих белки средств, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCL), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидо соединения (такие как бис-(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-соединения активного фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, рициновый иммунотоксин можно получать, как описано в Vitetta et al., (1987) Science, 238:1098. Иллюстративным хелатирующим средством для конъюгации радионуклида с антителом является меченная по углероду-14 1-изотиоцианатбензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) (WO 94/11026).

Также в настоящем документе рассматривают конъюгаты антитела и одного или нескольких низкомолекулярных токсинов, таких как калихимицин, майтанзиноиды, доластатины, ауристатины, трихотецен и CC1065 и производные этих токсинов, которые обладают токсической активностью.

Майтанзин и майтанзиноиды

В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат содержит антитело (полноразмерное или фрагменты) по изобретению, конъюгированное с одной или несколькими молекулами майтанзиноидов.

Майтанзиноиды представляют собой ингибиторы митоза, которые действуют, ингибируя полимеризацию тубулина. Майтанзин впервые выделили из восточно-африканского кустарника Maytenus serrata (патент США № 3896111). Впоследствии обнаружили, что определенные микроорганизмы также продуцируют майтанзиноиды, такие как майтанзинол и сложные эфиры майтанзинола по C-3 (патент США № 4151042). Также описаны синтетический майтанзинол и его производные и аналоги, например, в патентах США № 4137230; 4248870; 4256746; 4260608; 4265814; 4294757; 4307016; 4308268; 4308269; 4309428; 4313946; 4315929; 4317821; 4322348; 4331598; 4361650; 4364866; 4424219; 4450254; 4362663 и 4371533.

Молекулы майтанзиноидных лекарственных средств являются привлекательными молекулами в конъюгатах антитело-лекарственное средство потому, что они (i) относительно доступны для получения посредством ферментации или химической модификации, дериватизации продуктов ферментации, (ii) поддаются дериватизации функциональными группами, подходящими для конъюгации через недисульфидные линкеры к антителам, (iii) стабильны в плазме и (iv) эффективны против ряда линий опухолевых клеток.

Майтанзиновые соединения, пригодные для использования в качестве молекул майтанзиноидных лекарственных средств, хорошо известны в данной области, и их можно выделять из природных источников известными способами, получать способами генетической инженерии (см. Yu et al., (2002) PNAS 99: 7968-7973), или майтанзинол и аналоги майтанзинола известными способами получают синтетически.

Иллюстративные молекулы майтанзиноидных лекарственных средств включают молекулы с модифицированным ароматическим кольцом, таким как C-19-дехлоро (патент США 4256746) (полученным посредством восстановления ансамитоцина P2 гидридом алюминия лития); C-20-гидрокси (или C-20-деметил) +/- C-19-дехлоро (патенты США № 4361650 и 4307016) (полученным деметилированием с использованием Streptomyces или Actinomyces или дехлорированием с применением LAH); и C-20-деметокси, C-20-ацилокси (-OCOR), +/-дехлоро (патент США № 4294757) (полученного посредством ацилирования с применением ацилхлоридов) и молекулы с модификациями в других положениях.

Иллюстративные молекулы майтанзиноидных лекарственных средств также включают молекулы с такими модификациями как C-9-SH (патент США 4424219) (полученная посредством реакции майтанзинола с H₂S или P₂S₅); C-14-алкоксиметил(деметокси/CH ₂OR) (патент США 4331598); C-14-гидроксиметил или ацилоксиметил (CH₂OH или CH₂OAc) (патент США 4450254) (полученные из Nocardia); C-15-гидрокси/ацилокси (патент США 4364866) (полученная посредством конверсии майтанзинола Streptomyces); C-15-метокси (патенты США № 4313946 и 4315929) (выделенная из Trewia nudlflora ); C-18-N-деметил (патенты США № 4362663 и 4322348) (полученная посредством деметилирования майтанзинола Streptomyces) и 4,5-дезокси (патент США 4371533) (полученная посредством восстановления майтанзинола трихлоридом титана/LAH).

Иллюстративные варианты осуществления молекул майтанзиноидных лекарственных средств включают DM1; DM3 и DM4, со следующими структурами:

где волнистая линия означает ковалентное присоединение атома серы лекарственного средства к линкеру (L) конъюгата антитело-лекарственное средство. Сообщалось о HERCEPTIN® (герцептин®, трастузумаб, антитело к HER2), связанном посредством SMCC с DM1 (WO 2005/037992, которая в полном объеме включена в настоящий документ в качестве ссылки). Конъюгат антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению можно получать описанными в ней способами.

Другие иллюстративные конъюгаты антитело-лекарственное средство с майтанзиноидами имеют следующие структуры и обозначения (где Ab представляет собой антитело, а p представляет собой число от 1 до приблизительно 8):

Иллюстративные конъюгаты антитело-лекарственное средство, где DM1 связан через линкер BMPEO с тиольной группой антитела, имеют следующие структуру и обозначение:

где Ab представляет собой антитело; n представляет собой 0, 1 или 2; а p представляет собой 1, 2, 3 или 4.

Иммуноконъюгаты, содержащие майтанзиноиды, способы их получения и их терапевтическое применение описаны, например, в патентах США № 5208020; 5416064; 6441163 и европейском патенте EP 0425235 B1, описания которых включены в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. В Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623 (1996) описаны иммуноконъюгаты, содержащие майтанзиноид, обозначенный DM1, связанный с моноклональным антителом C242, направленным против колоректального рака человека. Выявлено, что конъюгат высокоцитотоксичен для культивируемых клеток рака толстого кишечника, и показана противоопухолевая активность в анализе роста опухоли in vivo. В Chad et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992) описаны иммуноконъюгаты, в которых майтанзиноид через дисульфидный линкер конъюгирован с мышиным антителом A7, связываясь с антигеном клеточных линий рака толстого кишечника человека, или с другим моноклональным антителом мыши TA.1, которое связывается с онкогеном HER-2/neu. Цитотоксичность конъюгата TA.1-майтанзиноид тестировали in vitro на клеточной линии рака молочной железы человека SK-BR-3, экспрессирующей 3×10 ⁵ поверхностных антигенов HER-2 на клетку. Лекарственный конъюгат достигал степени цитотоксичности, сходной со степенью цитотоксичности свободного майтанзиноидного лекарственного средства, которую можно увеличить, увеличивая количество майтанзиноидных молекул на молекулу антитела. Конъюгат A7-майтанзиноид продемонстрировал низкую системную цитотоксичность у мышей.

Конъюгаты антитело к CD22-майтанзиноид получают посредством химического связывания антитела с молекулой майтанзиноида без значительного снижения биологической активности антитела или молекулы майтанзиноида. См., например, патент США № 5208020 (описание которого, таким образом, включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме). В среднем 3-4 молекулы майтанзиноида, конъюгированные с одной молекулой антитела, продемонстрировали эффективность в отношении усиления цитотоксичности для клеток-мишеней без отрицательного воздействия на функцию или растворимость антитела, хотя можно ожидать, что даже одна молекула токсина/антитело увеличивает цитотоксичность по сравнению с применением одного антитела. Майтанзиноиды хорошо известны в данной области и их можно синтезировать известными способами или выделять из природных источников. Подходящие майтанзиноиды описаны, например, в патенте США № 5208020 и в других патентных и непатентных публикациях, на которые приводятся ссылки выше в данном документе. Предпочтительными майтанзиноидами являются майтанзинол и аналоги майтанзинола, модифицированные по ароматическому кольцу или по другим положениям молекулы майтанзинола, такие как различные сложные эфиры майтанзинола.

Существует множество известных в данной области линкерных групп для получения конъюгатов антитело-майтанзиноид, включающих, например, линкерные группы, описанные в патентах США № 5208020, 6441163 или европейском патенте 0425235 B1, Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992) и патенте США 2005/0169933 A1, описания которых включены в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. Конъюгаты антитело-майтанзиноид, содержащие линкерный компонент SMCC, можно получать, как описано в патентной заявке США № 11/141344, зарегистрированной 31 мая 2005 года, "Antibody Drug Conjugates and Methods". Линкерные группы включают дисульфидные группы, тиоэфирные группы, кислотолабильные группы, фотолабильные группы, пептидазолабильные группы или эстеразолабильные группы, как описано в указанных выше патентах. Дополнительные линкерные группы описаны и проиллюстрированы в настоящем документе.

Конъюгаты антитела и майтанзиноида можно получать с применением множества бифункциональных связывающих белки средств, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные сложных имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидо соединения (такие как бис-(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-соединения активного фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Особенно предпочтительные связывающие средства включают N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173: 723-737 (1978)) и N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат (SPP) для образования дисульфидной связи.

Линкер можно присоединять к молекуле майтанзиноида в различных положениях в зависимости от типа связи. Например, сложноэфирную связь можно формировать посредством реакции с гидроксильной группой с применением традиционных способов связывания. Реакция может проходить по положению C-3, в котором находится гидроксильная группа, по положению C-14, модифицированному гидроксиметилом, по положению C-15, модифицированному гидроксильной группой, и по положению C-20, в котором находится гидроксильная группа. В предпочтительном варианте осуществления связь формируют по положению C-3 майтанзинола или аналога майтанзинола.

В одном из вариантов осуществления любое антитело по изобретению (полноразмерное или фрагмент) конъюгировано с одной или несколькими молекулами майтанзиноидов. В одном из вариантов осуществления иммуноконъюгата цитотоксическое средство D представляет собой майтанзиноид DM1. В одном из вариантов осуществления иммуноконъюгата линкер представляет собой SMCC. В одном из вариантов осуществления конъюгат антитело-линкер-лекарственное средство представляет собой антитело к CD22, как описано в настоящем документе, к которому через линкер SMCC ковалентно присоединено цитотоксическое средство DM1.

Ауристатины и долостатины

В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат содержит антитело по изобретению, конъюгированное с доластатинами или пептидными аналогами и производными долостатинов, ауристатинами (патенты США № 5635483; 5780588). Показано, что доластатины и ауристатины препятствуют активности микротрубочек, гидролизу ГТФ и делению ядра и клетки (Woyke et al., (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) и обладают противоопухолевой (патент США 5663149) и противогрибковой активностью (Pettit et al., (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). Молекулу лекарственного средства доластатина или ауристатина можно связывать с антителом через N-конец (амино) или C-конец (карбоксильный) пептидной группы лекарственного средства (WO 02/088172).

Иллюстративные варианты осуществления ауристатина включают присоединенные по N-концу группы лекарственного средства монометилауристатина DE и DF, описанные в "Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, представленной 28 марта 2004 года, описание которой приведено в качестве ссылки в полном объеме.

Иллюстративный вариант осуществления ауристатина представляет собой MMAE (где волнистая линия указывает ковалентную связь с линкером (L) конъюгата антитело-лекарственное средство).

Другой иллюстративный вариант осуществления ауристатина представляет собой MMAF, где волнистая линия указывает ковалентную связь с линкером (L) конъюгата антитело-лекарственное средство (патент США 2005/0238649):

Дополнительные иллюстративные варианты осуществления, содержащие MMAE или MMAF, и различные линкерные компоненты (описанные далее в настоящем документы) имеют следующие структуры и сокращения (где Ab означает антитело, а p представляет собой число от 1 до приблизительно 8):

Как правило, пептидные группы лекарственных средств можно получать посредством формирования пептидной связи между двумя или более аминокислотами и/или пептидными фрагментами. Такие пептидные связи можно получать, например, способом синтеза в жидкой фазе (см. E. Schröder and K. Lübke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press), который хорошо известен в области пептидной химии. Ауристатиновые/доластатиновые группы лекарственных средств можно получать способами по патенту США 5635483; патенту США 5780588; Pettit et al., (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465; Pettit et al., (1998) Anti-Cancer Drug Design 13: 243-277; Pettit, G.R., et al., Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al., (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5: 859-863 и Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7): 778-784.

Калихимицин

В других вариантах осуществления иммуноконъюгат содержит антитело по изобретению, конъюгированное с одной или несколькими молекулами калихимицина. Калихимициновое семейство антибиотиков способно к образованию двухцепочечных разрывов в ДНК в субпикомолярных концентрациях. Для получения конъюгатов калихимицинового семейства см. патенты США № 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001, 5877296 (все выданы American Cyanamid Company). Структурные аналоги калихимицина, которые можно использовать, включают в качестве неограничивающих примеров ₁ ^I, ₂ ^I, ₃ ^I, N-ацетил- ₁ ^I, PSAG и ₁ ^I (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) и указанные выше патенты США, выданные American Cyanamid). Другим противоопухолевым лекарственным средством, с которым можно конъюгировать антитело, является QFA, представляющее собой антифолат. И калихимицин, и QFA содержат внутриклеточные участки действия и с трудом проходят через плазматическую мембрану. Таким образом, клеточный захват этих средств вследствие опосредованной антителом интернализации значительно усиливает их действие.

Другие цитотоксические средства

Другие противоопухолевые средства, которые можно конъюгировать с антителами по изобретению, включают BCNU, стрептозоицин, винкристин и 5-фторурацил, семейство средств, в совокупности известных как комплекс LL-E33288, описанный в патентах США 5053394, 5770710, а также эсперамицины (патент США 5877296).

Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые можно использовать, включают цепь A дифтерийного токсина, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь A экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь A рицина, цепь A абрина, цепь A модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, диантиновые белки, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогелин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецены. См., например, WO 93/21232, опубликованную 28 октября 1993 года.

Настоящее изобретение дополнительно относится к иммуноконъюгату, образованному антителом и соединением с нуклеолитической активностью (например, рибонуклеазой или ДНК-эндонуклеазой, такой как дезоксирибонуклеаза; ДНКаза).

Для избирательного разрушения опухоли антитело может содержать высокорадиоактивный атом. Для получения радиоконъюгированных антител доступно множество радиоактивных изотопов. Примеры включают At²¹¹, I ¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² , Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu. Когда конъюгат применяют для детекции, он может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например tc^99m или I¹²³, или спиновую метку для получения изображения ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) (также известного как магнитно-резонансная томография, МРТ), такую как снова йод-123, йод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.

Радиоактивные или другие метки можно вводить в конъюгат известными способами. Например, пептид можно биосинтезировать или синтезировать посредством химического синтеза аминокислот с применением подходящих предшественников аминокислот, содержащих, например, фтор-19 вместо водорода. Метки, такие как tc^99m или I¹²³, Re¹⁸⁶, Re ¹⁸⁸ и In¹¹¹, можно присоединить через цистеиновый остаток в пептиде. Иттрий-90 можно присоединять посредством лизинового остатка. Для введения йода-123 можно использовать способ IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57). В "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) подробно описаны другие способы.

Конъюгаты антитела и цитотоксического средства можно получать с применением различных связывающих белки средств, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные сложных имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидо соединения (такие как бис-(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол 2,6-диизоцианат) и бис-соединения активного фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, рициновый иммунотоксин можно получать, как описано в Vitetta et al. Science, 238:1098 (1987). Меченная по углероду-14 1-изотиоцианатбензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) представляет собой иллюстративное хелатирующее средство для конъюгации радионуклеотида с антителом. См. WO 94/11026. Линкер может представлять собой "расщепляемый линкер", облегчающий высвобождение цитотоксического лекарственного средства в клетке. Например, можно использовать кислотолабильный линкер, пептидазочувствительный линкер, фотолабильный линкер, диметильный линкер или содержащий дисульфид линкер (Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992); патент США № 5208020).

Соединения по изобретению включают в качестве неограничивающих примеров ADC, полученные с перекрестно-сшивающими реагентами: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), которые являются коммерчески доступными (например, в Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A). См. страницы 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.

Получение конъюгатов антитело-лекарственное средство:

В конъюгатах антитело-лекарственное средство (ADC) по изобретению, антитело (Ab) конъюгировано с одним или несколькими молекулами лекарственного средства (D), например, с молекулами лекарственного средства в количестве от приблизительно 1 до приблизительно 20 на антитело, посредством линкера (L). ADC формулы I можно получать несколькими способами с применением реакций органической химии, условий и реагентов, известных специалистам в данной области, включая (1) реакцию нуклеофильной молекулы антитела с бивалентным линкерным реагентом, с формированием Ab-L посредством ковалентной связи с последующей реакцией с молекулой лекарственного средства D; и (2) реакцию нуклеофильной группы из молекулы лекарственного средства с бивалентным линкерным реагентом с формированием D-L посредством ковалентной связи с последующей реакцией с нуклеофильной группой антитела. В настоящем документе описаны дополнительные способы получения ADC.

Ab-(L-D) p

Формула I

Линкер может состоять из одного или нескольких линкерных компонентов. Иллюстративные линкерные компоненты включают 6-малеимидокапроил ("MC"), малеимидопропаноил ("MP"), валин-цитруллин ("val-cit"), аланин-фенилаланин ("ala-phe"), п-аминобензилоксикарбонил ("PAB"), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат ("SPP"), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат ("SMCC") и N-сукцинимидил(4-йодацетил)аминобензоат ("SIAB"). Дополнительные линкерные компоненты известны в данной области, и некоторые описаны в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления линкер может содержать аминокислотные остатки. Иллюстративные аминокислотные линкерные компоненты включают дипептид, трипептид, тетрапептид или пентапептид. Иллюстративные дипептиды включают валин-цитруллин (vc или val-cit), аланин-фенилаланин (af или ala-phe). Иллюстративные трипептиды включают глицин-валин-цитруллин (gly-val-cit) и глицин-глицин-глицин (gly-gly-gly). Аминокислотные остатки, содержащиеся в аминокислотном линкерном компоненте, включают остатки, встречающиеся в природе, а также минорные аминокислоты и невстречающиеся в природе аналоги аминокислот, такие как цитруллин. Аминокислотные линкерные компоненты можно конструировать и оптимизировать по их селективности для ферментативного расщепления конкретными ферментами, например, ассоциированной с опухолью протеазой, катепсином B, C и D или протеазой плазмином.

Иллюстративные структуры линкерных компонентов представлены ниже (где волнистая линия указывает участки ковалентного присоединения к другим компонентам ADC):

Дополнительные иллюстративные линкерные компоненты и сокращения включают (где антитело (Ab) и линкер изображены, а p представляет собой число от 1 до приблизительно 8):

Нуклеофильные группы антител включают в качестве неограничивающих примеров (i) N-концевые аминогруппы, (ii) аминогруппы боковой цепи, например, лизина, (iii) тиольные группы боковой цепи, например цистеина, и (iv) гидроксильные или аминогруппы сахаров, когда антитело гликозилировано. Аминогруппы, тиольные и гидроксильные группы являются нуклеофильными и способны к реакции с формированием ковалентных связей с электрофильными группами на линкерных молекулах и линкерных реагентах, включая (i) активные сложные эфиры, такие как сложные эфиры NHS, сложные эфиры HOBt, галогенформиаты и галогенангидриды; (ii) алкилгалогениды и бензилгалогениды, такие как галогенацетамиды; (iii) альдегидные, кетоновые, карбоксильные и малеимидные группы. Определенные антитела содержат восстанавливаемые межцепочечные дисульфиды, т.е. цистеиновые мостики. Антитела можно сделать реакционноспособными для конъюгации с линкерными реагентами посредством обработки восстановителем, таким как DTT (дитиотреитол). Таким образом, каждый цистеиновый мостик, теоретически, будет формировать два реакционноспособных тиоловых нуклеофила. Дополнительные нуклеофильные группы можно вводить в антитела посредством реакции лизинов с 2-иминотиоланом (реагент Трота), что приводит к превращению амина в тиол. Реакционноспособные тиольные группы можно вводить в антитело (или в его фрагмент) посредством введения одного, двух, трех, четырех или более остатков цистеина (например, получая мутантные антитела, содержащие один или несколько неприродных аминокислотных остатков цистеина).

Конъюгаты антитело-лекарственное средство по изобретению можно также получать посредством модификации антитела с введением электрофильных групп, которые могут реагировать с нуклеофильными заместителями на линкерном реагенте или лекарственном средстве. Сахара гликозилированных антител можно окислять, например, с помощью периодатных окисляющих реагентов с формированием альдегидных или кетоновых групп, которые могут реагировать с аминогруппами линкерных реагентов или молекул лекарственного средства. Полученные группы иминовых оснований Шиффа могут формировать стабильную связь или их можно восстанавливать, например, боргидридными реагентами с формированием стабильных аминовых связей. В одном из вариантов осуществлением реакция углеводной части гликозилированного антитела с оксидазой галактозы или с метапериодатом натрия может приводить к образованию в белке карбонильных групп (альдегида и кетона), которые могут реагировать с соответствующими группами на лекарственном средстве (Hermanson, Bioconjugate Techniques). В другом варианте осуществления белки, содержащие N-концевые остатки серина или треонина, могут реагировать с метапериодатом натрия, приводя к получению альдегида вместо первой аминокислоты (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3: 138-146; US 5362852). Такие альдегиды могут реагировать с молекулой лекарственного средства или нуклеофилом линкера.

Подобным образом, нуклеофильные группы на молекуле лекарственного средства включают в качестве неограничивающих примеров аминогруппы, тиольные, гидроксильные, гидразидные, оксимные, гидразиновые, тиосемикарбазоновые, гидразинкарбоксилатные и арилгидразидные группы, способные к реакции с формированием ковалентных связей с электрофильными группами на линкерных молекулах и линкерных реагентах, включая (i) активные сложные эфиры, такие как сложные эфиры NHS, сложные эфиры HOBt, галогенформиаты и галогенангидриды; (ii) алкил- и бензилгалогениды, такие как галогенацетамиды; (iii) альдегидные, кетоновые, карбоксильные и малеимидные группы.

В еще одном аспекте антитело содержит один или несколько остатков лизина, которые можно химически модифицировать с введением одной или нескольких сульфгидрильных групп. Антительная часть молекулы связывается с линкерной частью молекулы через атом серы сульфгидрильной группы. Реагенты, которые можно использовать для модификации лизина, включают в качестве неограничивающих примеров N-сукцинимидил S-ацетилтиоацетат (SATA) и гидрохлорид 2-иминотиолана (реагент Трота).

В другом варианте осуществления антитело может содержать одну или несколько углеводных групп, которые можно химически модифицировать так, чтобы они содержали одну или несколько сульфгидрильных групп. Антительная часть молекулы связывается с линкерной частью молекулы, такой как элемент Stretcher, посредством атома серы сульфгидрильной группы, как описано в настоящем документе.

В другом варианте осуществления антитело может содержать одну или несколько углеводных групп, которые можно окислять с получением альдегидной (-CHO) группы (см., например, Laguzza, et al., J. Med. Chem. 1989, 32(3), 548-55). Соответствующий альдегид может формировать связь с реактивным центром на элементе Stretcher. Реактивные центры на элементе Stretcher, который может реагировать с карбонильной группой на антителе, включают в качестве неограничивающих примеров гидразин и гидроксиламин. Другие протоколы для модификации белков с присоединением или ассоциацией элементов лекарственных средств описаны в Coligan et al., Current Protocols in Protein Science, Vol.2, John Wiley & Sons (2002), включенной в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.

Способы конъюгации молекул линкер-лекарственное средство с направленными к клеткам белкам, такими как антитела, иммуноглобулины или их фрагменты находятся, например, в US5208020; US6441163; WO 2005037992; WO 2005081711 и WO 2006/034488, которые, таким образом, все включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Альтернативно можно получать слитый белок, содержащий антитело и цитотоксическое средство, например, рекомбинантными способами или пептидным синтезом. Отрезок ДНК может содержать соответствующие области, кодирующие две части конъюгата, примыкающие друг к другу или разделенные областью, кодирующей линкерный пептид, который не нарушает желаемых свойств конъюгата.

В другом варианте осуществления антитело можно конъюгировать с "рецептором" (таким как стрептавидин) для использования в предварительном нацеливании, где конъюгат антитело-рецептор вводят пациенту с последующим удалением несвязанного конъюгата из циркуляции с применением очищающего средства, а затем вводят "лиганд" (например, авидин), который конъюгирован с цитотоксическим средством (например, радионуклиотидом).

В одном из вариантов осуществления иммуноконъюгата цитотоксическое средство, D, представляет собой ауристатин формулы D_E или D_F

D_F

и где каждый из R² и R⁶ представляет собой метил, каждый из R³ и R⁴ представляет собой изопропил, R⁷ представляет собой втор-бутил, каждый R⁸ независимо выбран из CH₃, O-CH₃, OH и H; R⁹ представляет собой H; R¹⁰ представляет собой арил; Z представляет собой -O- или -NH-; R¹¹ представляет собой H, C₁-C₈-алкил, или -(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-(CH ₂)₂-O-CH₃; и R¹⁸ представляет собой -C(R⁸)₂-C(R⁸)₂ -арил; и

(d) p находится в диапазоне от приблизительно 1 до 8.

Приведенные ниже варианты осуществления относятся к любому из указанных выше иммуноконъюгатов. В одном из вариантов осуществления иммуноконъюгат обладает активностью в отношении уничтожения клеток in vitro или in vivo . В одном из вариантов осуществления линкер присоединен к антителу через тиольную группу на антителе. В одном из вариантов осуществления линкер подвержен расщеплению протеазой. В одном из вариантов осуществления линкер содержит дипептид val-cit. В одном из вариантов осуществления линкер содержит п-аминобензильную группу. В одном из вариантов осуществления п-аминобензильная группа в линкере располагается между лекарственным средством и участком расщепления протеазы. В одном из вариантов осуществления п-аминобензильная группа представляет собой п-аминобензилоксикарбонил (PAB). В одном из вариантов осуществления линкер содержит 6-малеимидокапроил. В одном из вариантов осуществления 6-малеимидокапроил в линкере расположен между антителом и участком расщепления протеазы. Указанные выше варианты осуществления можно осуществлять по одному или в любом сочетании друг с другом.

В одном из вариантов осуществления лекарственное средство выбрано из MMAE и MMAF. В одном из вариантов осуществления иммуноконъюгат имеет формулу

где Ab представляет собой любое из указанных выше антител к CD22, S представляет собой атом серы, а p находится в диапазоне от 2 до 5. В одном из вариантов осуществления иммуноконъюгат имеет формулу

где Ab представляет собой любое из указанных выше антител к CD22, S представляет собой атом серы, а p находится в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 6, от приблизительно 2 до приблизительно 5, от приблизительно 2 до приблизительно 6, от приблизительно 2 до приблизительно 4, от приблизительно 2 до приблизительно 3, от приблизительно 3 до приблизительно 4, от приблизительно 3 до приблизительно 5, от приблизительно 3 до приблизительно 6 или от приблизительно 4 до приблизительно 6.

Способы визуализации с меченым антителом:

В другом варианте осуществления изобретения модифицированные цистеином антитела можно метить посредством тиольных групп цистеина радионуклидами, флуоресцентными красителями, запускающими биолюминесценцию молекулами субстрата, запускающими хемилюминесценцию молекулами субстрата, ферментами и другими детектируемыми метками для экспериментов по визуализации с диагностическими, фармакодинамическими и терапевтическими применениями. Как правило, меченое модифицированное цистеином антитело, т.е. "биомаркер" или "зонд", вводят посредством инъекции, перфузии или перорального введения в живой организм, например, человеку, грызуну или другому небольшому животному, перфузируемый орган или образец ткани. С течением времени детектируют распределение зонда и представляют в виде изображения.

Промышленные изделия:

В другом варианте осуществления изобретения предоставлено промышленное изделие или "набор", содержащий вещества, пригодные для лечения описанных выше заболеваний. Промышленное изделие содержит контейнер и ярлык или вкладыш в упаковку на контейнере или относящиеся к нему. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы, блистерные упаковки и т.д. Контейнеры можно получать из множества материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC), которая эффективна для лечения патологического состояния, и может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или флакон с пробкой, поддающийся прокалыванию иглой для подкожных инъекций). По меньшей мере одно активное средство в композиции представляет собой ADC. В ярлыке или вкладыше в упаковку указано, что композицию применяют для лечения выбранного состояния, такого как злокачественная опухоль. Альтернативно или дополнительно промышленное изделие может дополнительно содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Дополнительно оно может включать другие материалы, желательные с коммерческой или пользовательской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

Фармацевтические композиции :

В одном из аспектов предоставлена фармацевтическая композиция, содержащая любой из указанных иммуноконъюгатов и фармацевтически приемлемый носитель. В одном из аспектов предоставлен способ лечения B-клеточного пролиферативного нарушения, где способ включает введение индивидууму фармацевтической композиции. В одном из вариантов осуществления B-клеточное пролиферативное нарушение выбрано из лимфомы, неходжкинской лимфомы (NHL), агрессивной NHL, рецидивирующей агрессивной NHL, рецидивирующей медленно растущей NHL, рефракторной NHL, рефракторной медленно растущей NHL, хронического лимфолейкоза (CLL), мелкоклеточной лимфомы, лейкоза, волосатоклеточного лейкоза (HCL), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL) и лимфомы мантийных клеток. В одном из вариантов осуществления клеточное пролиферативное нарушение ассоциировано с увеличенной экспрессией CD22 на поверхности клетки.

В одном из аспектов предоставлен способ ингибирования клеточной пролиферации, где способ включает воздействие на клетку любым из указанных выше иммуноконъюгатов в условиях, позволяющих связывание иммуноконъюгата с CD22. В одном из вариантов осуществления B-клетка представляет собой опухолевую клетку. В одном из вариантов осуществления опухолевая клетка представляет собой B-клетку млекопитающего, с наличием или с подозрением на наличие B-клеточного пролиферативного нарушения, выбранного из лимфомы, неходжкинской лимфомы (NHL), агрессивной NHL, рецидивирующей агрессивной NHL, рецидивирующей медленно растущей NHL, рефракторной NHL, рефракторной медленно растущей NHL, хронического лимфолейкоза (CLL), мелкоклеточной лимфомы, лейкоза, волосатоклеточного лейкоза (HCL), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL) и лимфомы мантийных клеток, клетка представляет собой ксенотрансплантат. В одном из вариантов осуществления воздействие происходит in vitro. В одном из вариантов осуществления воздействие происходит in vivo.

В одном из аспектов предоставлен способ применения антитело к CD22 по изобретению для анализа сывороточного растворимого CD22 у млекопитающих с лейкозом или лимфомой для диагностики B-клеточного лейкоза или B-клеточной лимфомы, для контроля клинического прогресса или регресса заболеваний или для оценки опухолевой массы или рецидива. Такие способы описаны в патенте США 20050244828 (Kreitman, R.J. et al., содержание которого, таким образом, включено в качестве ссылки в полном объеме), где применяют конъюгат антитела RFB4 к CD22 и токсина PE38 (фрагмент 38 экзотоксина A Pseudomonas ) (см. Kreitman, R.J. et al., NEJM 345: 241-247 (2001)).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг.1A-1D: фиг.1A представляет собой диаграмму CD22, демонстрирующую семь иммуноглобулин-подобных доменов внеклеточного домена бета-изоформы. В альфа-изоформе отсутствуют домены 3 и 4. "TM" относится к трансмембранному домену. На фиг.1B изображена аминокислотная последовательность бета-формы CD22 (SEQ ID NO: 27). В альфа-форме CD22 отсутствуют аминокислоты, изображенные курсивом (кодирующие домены 3 и 4 внеклеточного домена). Внеклеточный домен зрелой формы белка подчеркнут (SEQ ID NO: 28). Аминокислоты 1-21 представляют собой сигнальную последовательность, отщепляемую от зрелой формы. Фиг.1C представляет собой аминокислотную последовательность CD22-альфа (SEQ ID NO: 29). ECD CD22-альфа подчеркнут (SEQ ID NO: 30). Фигура 1D представляет собой аминокислотную последовательность CD22 яванского макака (cyno) (SEQ ID NO: 31). Первые 19 аминокислот CD22 cyno представляют собой сигнальную последовательность.

Фиг.2A-2B: фиг.2A представляет собой аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела 10F4 к CD22 мыши по изобретению (m10F4), выравненную с гуманизированной версией 1 антитела 10F4 (h10F4v1) и выравненную с последовательностью человека подгруппы III. HVR заключены в рамку (HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3). Последовательности, охватывающие HVR, представляют собой каркасные последовательности (от FR-H1 до FR-H4). Последовательности пронумерованы в соответствии с нумерацией Kabat. CDR по Kabat, Chothia и контактные CDR указаны над заключенными в рамку HVR. На фиг.2B приведена аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела 10F4 к CD22 мыши по изобретению (m10F4), выравненная с гуманизированной версией 1 антитела 10F4 (h10F4v1) и выравненную с последовательностью человека каппа I. Версии 2 и 3 гуманизированного антитела 10F4 (h10F4v2 и h10F4v3) у секретируемой зрелой формы содержат те же аминокислотные последовательности. Антитела h10F4v2 и h10F4v3 отличаются от h10F4v1 аминокислотой 28 HVR-L1 (N28V). HVR заключены в рамку. последовательности FR-L1, FR-L2, FR-L3 и FR-L4 охватывают HVR (HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3). Последовательности пронумерованы в соответствии с нумерацией Kabat. CDR по Kabat, Chothia и контактные CDR указаны над заключенными в рамки HVR.

На фиг.3A и 3B показаны иллюстративные акцепторные консенсусные каркасные последовательности вариабельных фрагментов тяжелых цепей человека для применения в практическом осуществлении настоящего изобретения с идентификаторами последовательностей, как указано ниже, где SEQ ID NO: FR перечислены в порядке FR-H1, FR-H2, FR-H3, FR-H4:

- консенсусный каркас "A" VH подгруппы I человека без CDR по Kabat (SEQ ID NO: 26, 47, 48, 7);

- консенсусные каркасы "B", "C" и "D" VH подгруппы I человека без расширенных гипервариабельных областей (SEQ ID NO: 50, 51, 52, 7; SEQ ID NO: 50, 51, 52, 7 и SEQ ID NO: 50, 51, 53, 7);

- консенсусный каркас "A" VH подгруппы II человека без CDR по Kabat (SEQ ID NO: 54, 55, 56, 7);

- консенсусные каркасы "B", "C" и "D" VH подгруппы II человека без расширенных гипервариабельных областей (SEQ ID NO: 57, 58, 56, 7 SEQ ID NO: 57, 58, 59, 7; и SEQ ID NO: 57, 58, 60, 7);

- консенсусный каркас "A" VH подгруппы III человека без CDR по Kabat (SEQ ID NO: 61, 62, 63, 7);

- консенсусные каркасы "B", "C" и "D" VH подгруппы III человека без расширенных гипервариабельных областей (SEQ ID NO: 64, 65, 63, 7; SEQ ID NO: 64, 65, 66, 7 и SEQ ID NO: 64, 65, 67, 7);

- каркас "A" акцепторной VH 1 человека без CDR по Kabat (SEQ ID NO: 68, 62, 69, 7);

- каркасы "B" и "C" акцепторной VH человека без расширенных гипервариабельных областей (SEQ ID NO: 64, 65, 69, 7; и SEQ ID NO: 64, 65, 70, 7);

- каркас "A" акцепторной VH 2 человека без CDR по Kabat (SEQ ID NO: 68, 62, 71, 7);

- каркасы "B", "C" и "D" акцепторной VH 2 человека без расширенных гипервариабельных областей (SEQ ID NO: 64, 65, 71, 7; SEQ ID NO: 64, 65, 72, 7 и SEQ ID NO: 64, 65, 73, 7).

На фиг.4A и 4B показаны иллюстративные акцепторные консенсусные каркасные последовательности вариабельных фрагментов легких цепей (VL) человека для применения в практическом осуществлении настоящего изобретения с идентификаторами последовательностей, как указано ниже:

- консенсусный каркас ( v1-1) VL каппа подгруппы 1-1 человека: SEQ ID NO: 74, 75, 76, 77;

- консенсусный каркас ( v1) VL каппа подгруппы I человека: SEQ ID NO: 74, 78, 76, 77;

- консенсусный каркас ( v2) VL каппа подгруппы II человека: SEQ ID NO: 49, 79, 80, 77;

- консенсусный каркас ( v3) VL каппа подгруппы III человека: SEQ ID NO: 81, 82, 83, 77;

- консенсусный каркас ( v4) VL каппа подгруппы IV человека: SEQ ID NO: 84, 85, 86, 77.

Фиг.5A и 5B: на фиг.5A приведены выравнивания последовательностей Fc-областей природных последовательностей IgG человека humIgG1 (аллотип не-A, SEQ ID NO: 38; и аллотип A, где аминокислотная последовательность SREEM в SEQ ID NO: 38 заменена на SRDEL), humIgG2 (SEQ ID NO: 39), humIgG3 (SEQ ID NO: 40) и humIgG4 (SEQ ID NO: 41) с различиями между последовательностями, обозначенными звездочками. Номера над последовательностями представляют собой нумерацию по системе EU. Также приведена иллюстративная константная область каппа. На фиг.5B представлены полноразмерные аминокислотные последовательности (вариабельные и константные области) легких и тяжелых цепей гуманизированного антитела к CD22 10F4v2, изотип IgG1. Подчеркнутые участки означают константные домены.

На фиг.6A-6D показаны результаты анализов по измерению эффективности ADC с CD22 в лимфомных клеточных линиях. На фиг.6A показано, что более высокие уровни CD22 на клеточной поверхности коррелируют с меньшей IC₅₀ анти-CD22-MCC-DM1 (большая эффективность). На фиг.6B показано, что увеличенная интернализация анти-CD22-MCC-DM1 коррелирует с меньшей IC ₅₀ анти-CD22-MCC-DM1. На фиг.6C показано, что увеличенная собственная чувствительность клеток к свободному лекарственному средству коррелирует с меньшей IC₅₀ анти-CD22-MCC-DM1. Фиг.6D представляет собой микрофотографию, на которой показана интернализация флуоресцентно меченного антитела к CD22 после связывания с CD22 на клеточной поверхности.

Фиг.7A-7B: фиг.7A представляет собой график уменьшения объема опухоли in vivo в модели на ксенотрансплантате, который демонстрирует, что введение антител к CD22 mu10F4-smcc-DM1 и hu10F4v1-smcc-DM1 мышам SCID с пересаженными B-клеточными опухолями человека значительно уменьшает объем опухоли. Нагрузка лекарственным средством составляла приблизительно 4 и 4,6, см. таблицу 4. Фиг.7B представляет собой график сходного исследования, но нагрузка лекарственным средством была немного меньшей, приблизительно 2,9 и 3,0 (см. таблицу 5), а эффективность mu10F4-smcc-DM1 и hu10F4v2-smcc-DM1 сравнивали с контрольным антителом и неконъюгированным mu10F4. Фиг.7C представляет собой график уменьшения опухоли in vivo в модели с ксенотрансплантатом, где анти-CD22-spp-DM1 вводили, как указано в таблице 6.

Фиг.8A и 8B: фиг.8A представляет собой график для антител к CD22 5E8.1.8-smcc-DM1 и RFB4-smcc-DM1, вводимых в ксенотрансплантаты клеток Ramos. Фиг.8B представляет собой график для антител к CD22 5E8.1.8-smcc-DM1 и RFB4-smcc-DM1, вводимых в ксенотрансплантаты BJAB-luc.

Фиг.9 представляет собой график, демонстрирующий относительное воздействие на объем опухоли в зависимости от времени после введения анти-CD22(RFB4)-smcc-DM1 при низкой, средней и высокой нагрузках лекарственным средством.

Фиг.10 представляет собой график, демонстрирующий относительное воздействие на объем опухоли в зависимости от времени после введения анти-CD22(RFB4)-MC-vcPAB-MMAF или анти-CD22(RFB4)-MC-MMAF в ксенотрансплантаты Ramos.

Фиг.11 представляет собой график, демонстри рующий относительное воздействие на объем опухоли в зависимости от времени после введения анти-CD22(RFB4)-smcc-DM1 или -MCvcPAB-MMAE.

Фиг.12 представляет собой график, демонстрирующий относительное воздействие на объем опухоли в зависимости от времени после введения гуманизированных вариантов анти-CD22 10F4 в виде иммуноконъюгатов с MMAF или DM1, как описано в таблице 12.

Фиг.13A-13C представляют собой графики, демонстрирующие относительное воздействие на объем опухоли в зависимости от времени после введения анти-CD22-smcc-DM1 или анти-CD22-MC-MMAF в различных моделях ксенотрансплантатов B-клеточной лимфомы: SuDHL-4 (фиг.13A), DoHH2 (фиг.13B) и Granta-519 (фиг.13C).

На фиг.14 показаны диаграммы доменов CD22, удаляемых при картировании эпитопов, как описано в примерах. Домены пронумерованы 1-7. "TM" относится к трансмембранному домену.

На фиг.15 приведены изображения модифицированных цистеином конъюгатов антитело к CD22-лекарственное средство (ADC), где молекула лекарственного средства присоединена к полученной в результате конструирования цистеиновой группе в легкой цепи (LC-ADC); тяжелой цепи (HC-ADC) и Fc-области (Fc-ADC).

На фиг.16 показаны стадии: (i) восстановление дисульфидных аддуктов цистеина и межцепочечных и внутрицепочечных дисульфидов в модифицированном цистеином антителе к CD22 (тиомаб) восстановителем TCEP (гидрохлорид трис-(2-карбоксиэтил)фосфина); (ii) частичное окисление, т.е. повторное окисление для восстановления межцепочечных и внутрицепочечных дисульфидов dhAA (дегидроаскорбиновая кислота); и (iii) конъюгация повторно окисленного антитела с промежуточным соединением лекарственное средство-линкер с формированием конъюгата модифицированное цистеином антитело к CD22-лекарственное средство (ADC).

На фиг.17A-17C приведены аминокислотные последовательности модифицированных цистеином антител к CD22 по изобретению, в которых легкая цепь, или тяжелая цепь, или Fc-область изменены с введением цистеина в выбранных положениях аминокислот. На фиг.17A приведена аминокислотная последовательность легкой цепи варианта антитела к CD22 10F4, в которой валин в положении по Kabat 205 (положение в последовательности - валин 210) заменен на цистеин. На фиг.17B приведена аминокислотная последовательность тяжелой цепи варианта антитела к CD22 10F4, в которой аланин в положении по EU 118 (положение в последовательности - аланин 121) заменен на цистеин. На фиг.17C приведена аминокислотная последовательность Fc-области варианта антитела к CD22 10F4, в которой серин в положении по EU 400 (положение в последовательности - серин 403) заменен на цистеин. На каждой фигуре измененная аминокислота показана полужирным шрифтом с двойным подчеркиванием. Подчеркивание одиночной линией означает константные области. Вариабельные области не подчеркнуты.

Фиг.18A-18E представляют собой диаграммы FACS, демонстрирующие, что связывание конъюгатов тиомаб к CD22 и лекарственного средства (TDC) по изобретению, связывающегося с CD22, экспрессированным на поверхности клеток BJAB-lucs, является сходным с вариантами тиомаб LC, HC и Fc тиомаб, также как и для конъюгатов с различными приведенными лекарственными средствами.

Фиг.19 представляет собой график, на котором показаны изменения среднего объема опухоли с течением времени в модели на ксенотрансплантате, обработанном различными TDC к CD22, различающимися по положению полученного в результате конструирования цистеина (LC, HC или Fc) и/или по конъюгированию с лекарственным средством (MMAF или MMAE). В моделях на ксенотрансплантатах, обработанных TDC, антитело к CD22 10F4-LC-V210C-MCvcPAB-MMAE и антитело к CD22 10F4-HC-A121C-MCvcPAB-MMAE, показано уменьшение объема опухоли в ходе исследования.

Фиг.20A представляет собой график, на котором показаны изменения среднего объема опухоли с течением времени в ксенотрансплантате лимфомы мантийных клеток Granta-519 человека мышам SCID CB17, обработанных тяжелыми цепями A118C TDC к CD22, конъюгированными с различными молекулами линкер-лекарственное средство и/или введенными в различных дозах, как показано. По-видимому, TDC антитело к CD22 10F4-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE является наиболее эффективным из протестированных в этом эксперименте средств. Фиг.20B представляет собой график, на котором показаны изменения среднего объема опухоли с течением времени в ксенотрансплантате фолликулярной лимфомы DOHH2 мышам SCID CB17, обработанных теми же тяжелыми цепями A118C TDC к CD22, но в больших дозах. По-видимому, TDC антитело к CD22 10F4-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE является наиболее эффективным из протестированных в этом эксперименте средств. Фиг.20C представляет собой график процентного изменения массы у мышей из исследования с ксенотрансплантатами DOHH2, демонстрирующий отсутствие значимого изменения массы в течение первых 14 суток исследования.

Фиг.21A и 21B представляют собой столбчатые диаграммы, демонстрирующие изменения сывороточной AST (аспартатаминотрансфераза) (фиг.21A) и сывороточных нейтрофилов (фиг.21B) на сутки 0 и 5, где вводили ADC, содержащий расщепляемый и нерасщепляемый линкер.

Фиг.22A и 22B представляют собой графики, демонстрирующие снижение количества периферических B-клеток (клетки CD20⁺) у яванских макак, которым дозировали 10, 20 и 30 мг/кг антитела к CD22 с MMAF (фиг.22A) и антитела к CD22 с DM1 (фиг.22B).

Фиг.23A и 23B представляют собой графики, демонстрирующие отсутствие значимых изменений CD4⁺ лимфоцитов при 10, 20 и 30 мг/кг антитела к CD22 с MMAF (фиг.23A) и антитела к CD22 с DM1 (фиг.23B).

На фиг.24A и 24B приведены гистологические образцы ткани миндалевидных желез яванских макак, где в образце миндалевидной железы животного, которому вводили дозу 10 мг/кг hu10F4v3-SMCC-DM1, снижается количество B-клеток в герминальных центрах, видимых при дозировании контроля в виде носителя (фиг.24A).

Фиг.25A представляет собой диаграмму, демонстрирующую области фолликула селезенки, из которой взят образец ткани для исследования, в котором показано, что ADC к CD22 у яванских макак удаляет B-клетки из покоящейся ткани. Деление клеток в герминативном центре фолликула селезенки cyno в делящихся герминативных центрах селезенок cyno у животных, которым вводили дозу 10 мг/кг hu10F4v3-MC-MMAF, уменьшалось (фиг.25B и 25C). Неделящиеся наивные B-клетки в тех же условиях не уменьшались (фиг.25D и 25E).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предоставлены выделенные антитела, связывающиеся с CD22. Дополнительно предоставлены иммуноконъюгаты, содержащие антитела к CD22. Дополнительно предоставлены модифицированные цистеином антитела к CD22 и их иммуноконъюгаты. Антитела и иммуноконъюгаты по изобретению пригодны, например, для диагностики или лечения нарушений, ассоциированных с измененной экспрессией, например, увеличенной экспрессией, CD22. В определенных вариантах осуществления антитела или иммуноконъюгаты по изобретению пригодны для диагностики или лечения клеточного пролиферативного нарушения, такого как опухоль или злокачественная опухоль. В определенных вариантах осуществления антитела или иммуноконъюгаты по изобретению пригодны для детекции CD22, например, CD22, экспрессированного на клеточной поверхности.

Предоставлены полинуклеотиды, кодирующие антитела к CD22. Предоставлены векторы, содержащие полинуклеотиды, кодирующие антитела к CD22, и предоставлены клетки-хозяева, содержащие такие векторы. Также предоставлены композиции, включающие фармацевтические препараты, содержащие любой один или несколько из полинуклеотидов, антител к CD22 или иммуноконъюгатов по изобретению.

Общие способы

Способы и процедуры, описанные или указанные в настоящем документе, как правило, широко распространены и обычно применяются специалистами в данной области с использованием традиционной методологии, например, такой, как широко используемые способы, описанные в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd, edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M.Ausubel, et al., eds., (2003)); серия Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): Pcr 2: A Practical Approach (M.J.MacPherson, B.D.Hames and G.R.Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I.Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait, ed., 1984): Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E.Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I.Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P.Mather and P.E.Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A.Doyle, J.B.Griffiths, and D.G.Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M.Weir and C.C.Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M.Miller and M.P.Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction. (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E.Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A.Janeway and P.Travers, 1997); Antibodies (P.Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D.Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P.Shepherd and C.Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E.Harlow and D.Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M.Zanetti and J.D.Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); и Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T.DeVita et al., eds., J.B.Lippincott Company, 1993).

ОПРЕДЕЛЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

Определения

"Выделенное" антитело представляет собой антитело, которое идентифицировано и отделено от компонентов его природного окружения и/или выделено из них. Загрязняющими компонентами его природного окружения являются вещества, которые могут мешать диагностическим или терапевтическим применениям антитела, и они могут включать ферменты, гормоны и другие белковые и небелковые растворы. В некоторых вариантах осуществления антитело очищают (1) до более чем 95% по массе антитела, как определяют методом Лоури, а в некоторых вариантах осуществления - более чем до 99% по массе, (2) до степени, достаточной для получения, по меньшей мере, 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности при применении секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности при SDS-PAGE в невосстанавливающих или восстанавливающих условиях с применением красителя кумасси синего или серебра. Выделенное антитело включает антитело в рекомбинантных клетках in situ, так как отсутствует, по меньшей мере, один компонент природного окружения антитела. Однако, как правило, выделенное антитело получают посредством, по меньшей мере, одной стадии очистки.

"Выделенная" молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая отделена, по меньшей мере, от одной другой молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она, как правило, ассоциирована, например, в ее природном окружении. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты дополнительно включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые, как правило, экспрессируют молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты находится вне хромосомы или в хромосоме, но в положении, отличающемся от ее природного положения в хромосоме.

"Очищенная" означает, что молекула находится в образце в концентрации, по меньшей мере, 95% по массе или, по меньшей мере, 98% по массе образца, в котором она содержится.

Как применяют в настоящем документе, термин "в значительной степени сходный" или "по существу такой же", означает в достаточной степени высокое сходство между двумя числовыми значениями (например, одним, ассоциированным с антителом по изобретению, а другим, ассоциированным с референсным/сравниваемым антителом) так, что специалист в данной области может считать разницу между двумя значениями малой или не имеющей биологической и/или статистической значимости в пределах контекста измеряемых указанными значениями биологических характеристик (например, значения Kd). Различие между указанными двумя значениями составляет, например, менее чем приблизительно 50%, менее чем приблизительно 40%, менее чем приблизительно 30%, менее чем приблизительно 20% и/или менее чем приблизительно 10% в зависимости от референсного/сравниваемого значения.

Как применяют в настоящем документе, фраза "в значительной степени уменьшенный" или "существенно отличающийся" означает достаточно большую степень различий между двумя числовыми значениями (как правило, одним, ассоциированным с молекулой, а другим, ассоциированным с референсной/сравниваемой молекулой) так, что специалист в данной области может считать разницу между двумя значениями статистически значимой в пределах контекста измеряемых указанными значениями биологических характеристик (например, значения Kd). Различие между указанными двумя значениями составляет, например, больше, чем приблизительно 10%, больше, чем приблизительно 20%, больше, чем приблизительно 30%, больше, чем приблизительно 40% и/или больше чем приблизительно 50% в зависимости от значения для референсной/сравниваемой молекулы.

Как применяют в настоящем документе, термин "вектор", предназначен для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты, способной к транспортировке другой нуклеиновой кислоты, с которой он соединен. Одним из типов векторов является "плазмида", которая обозначает кольцевую двухцепочечную ДНК, в которую можно лигировать дополнительные участки ДНК. Другим типом вектора является фаговый вектор. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные участки ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую их вводят (например, бактериальные векторы с бактериальным участком начала репликации и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут интегрироваться в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина и, таким образом, реплицироваться вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в настоящем документе обозначают как "рекомбинантные экспрессирующие векторы" или просто, "экспрессирующие векторы". Как правило, экспрессирующие векторы, пригодные в способах рекомбинантной ДНК, часто находятся в форме плазмид. В настоящем описании "плазмида" и "вектор" могут быть использованы взаимозаменяемо, так как плазмида представляет собой наиболее общеупотребительную форму вектора.

"Полинуклеотид" или "нуклеиновая кислота", как взаимозаменяемо используют в настоящем документе, относится к полимерам нуклеотидов любой длины и включает ДНК и РНК. Нуклеотиды могут представлять собой дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, модифицированные нуклеотиды или основания и/или их аналоги или любой субстрат, который можно встроить в полимер ДНК- или РНК-полимеразой или посредством синтетической реакции. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Если присутствует, модификацию структуры нуклеотида можно проводить до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может прерываться ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может содержать модификацию(и), осуществленную после синтеза, такую как конъюгация метки. Другие типы модификаций включают, например, "кэпирование", замену одного или нескольких встречающихся в природе нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации, например, такие как модификации с незаряженными связями (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфоамидаты, карбаматы и т.д.) и с заряженными связями (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.), модификации, содержащие боковые группы, например, такие как белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, ply-L-лизин и т.д.), модификации с интеркаляторами (например, акридин, псорален и т.д.), модификации, содержащие хелаторы (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и т.д.), модификации, содержащие алкилирующие средства, модификации с модифицированными связями (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.), а также немодифицированные формы полинуклеотида(ов). Кроме того, можно замещать любые гидрофильные группы, обычно присутствующие на сахарах, например, фосфонатными группами, фосфатными группами, они могут быть защищены стандартными защитными группами или активированы с получением дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами и могут быть конъюгированы с твердой или полутвердой подложкой. 5'- и 3'-концевой OH может быть фосфорилирован или замещен аминами или органическими кэпирующими группами с количеством атомов углерода от 1 до 20. Другие гидроксилы также могут быть дериватизированы стандартными защитными группами. Полинуклеотиды также могут содержать формы, аналогичные сахарам рибозе и дезоксирибозе, которые, как правило, известны в данной области, включая, например, 2'-O-метил-, 2'-O-аллил-, 2'-фтор- или 2'-азидорибозу, аналоги карбоциклических сахаров, -аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, нециклические аналоги и основные нуклеозидные аналоги, такие как метилрибозид. Одну или несколько фосфодиэфирных связей можно заменить альтернативными связывающими группами. Эти альтернативные связывающие группы включают в качестве неограничивающих примеров варианты осуществления, где фосфат замещен посредством P(O)S ("тиоат"), P(S)S ("дитиоат"), (O)NR₂ ("амидат"), P(O)R, P(O)OR', CO или CH₂ ("формацеталь"), в которых каждый R или R' независимо представляет собой H или замещенный или незамещенный алкил (1-20 C), необязательно содержащий эфирную (-O-) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралкил. Не все связи в полинуклеотиде должны быть идентичными. Предшествующее описание применимо ко всем полинуклеотидам, приводимым в настоящем документе, включая РНК и ДНК.

Как применяют в настоящем документе, "олигонуклеотид", как правило, относится к коротким, как правило, одноцепочечным, как правило, синтетическим полинуклеотидам, длина которых, как правило, но необязательно, составляют менее чем приблизительно 200 нуклеотидов. Термины "олигонуклеотид" и "полинуклеотид" не являются взаимоисключающими. Приведенное выше описание для полинуклеотидов в равной степени и полностью применимо к олигонуклеотидам.

"Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности" по отношению к референсной полипептидной последовательности определен как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в референсной полипептидной последовательности после выравнивания последовательностей и внесения, если необходимо, пропусков, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и не рассматривая никакие консервативные замены как часть, определяющую идентичность последовательностей. Выравнивание с целью определения процента идентичности аминокислотных последовательностей можно получать различными известными специалистам в данной области способами, например, с применением общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить подходящие параметры для выравнивания последовательностей, включающие любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания между сравниваемыми полноразмерными последовательностями. Однако для целей по настоящему документу значения % идентичности аминокислотных последовательностей получают с применением компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа сравнения последовательностей ALIGN-2 создана в Genentech, Inc. и исходный код подан вместе с документацией для пользователя в U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, где он зарегистрирован под U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Программа ALIGN-2 общедоступна в Genentech, Inc., South San Francisco, California, или ее можно скомпилировать из исходного кода. Программу ALIGN-2 следует компилировать для применения в операционной системе UNIX, предпочтительно цифровой UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей устанавливаются программой ALIGN-2 и не изменяются.

В тех случаях, когда для сравнения аминокислотных последовательностей применяют ALIGN-2, % идентичности аминокислотной последовательности данной аминокислотной последовательности A с данной аминокислотной последовательностью B (что, альтернативно, можно сформулировать как то, что данная аминокислотная последовательность A имеет или содержит определенный % идентичности аминокислотной последовательности с данной аминокислотной последовательностью B) рассчитывают следующим образом:

100 умножить на отношение X/Y,

где X представляет собой количество аминокислотных остатков, засчитанных программой выравнивания последовательностей ALIGN-2 в этом программном выравнивании A и B как идентичные совпадения, и где Y представляет собой общее количество аминокислотных остатков в B. Понятно, что там, где длина аминокислотной последовательности A не равна длине аминокислотной последовательности B, % идентичности аминокислотной последовательности A с B не будет равным % идентичности аминокислотной последовательности B с A. Если конкретно не указано иначе, все значения % идентичности аминокислотных последовательностей, используемые в настоящем документе, получены как описано в непосредственно предшествующем параграфе с применением компьютерной программы ALIGN-2.

"Поверхностный маркер B-клеток" или "поверхностный антиген B-клеток" в настоящем документе представляет собой антиген, экспрессируемый на поверхности B-клетки, который может служить мишенью для антагониста, который связывается с ним, включая в качестве неограничивающих примеров антитела к поверхностному антигену B-клеток, или растворимую форму поверхностного антигена B-клеток, способную к противодействию связыванию лиганда с встречающимся в природе B-клеточным антигеном. Иллюстративные поверхностные маркеры B-клеток включают поверхностные маркеры лейкоцитов CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 и CD86 (для описания, см. The Leukocyte Antigen Facts Book, 2^nd Edition. 1997, ed. Barclay et al., Academic Press, Harcourt Brace & Co., New York). Другие поверхностные маркеры B-клеток включают RP105, FcRH2, B-клеточный CR2, CCR6, P2X5, HLA-DOB, CXCR5, FCER2, BR3, BAFF, BLyS, Btig, NAG14, SLGC16270, FcRH1, IRTA2, ATWD578, FcRH3, IRTA1, FcRH6, BCMA и 239287. Поверхностный маркер B-клеток, представляющий особый интерес, предпочтительно экспрессирован на B-клетках по сравнению с другими не B-клеточными тканями млекопитающего и может быть экспрессирован на предшественниках B-клеток и на зрелых B-клетках.

Как применяют в настоящем документе, термин "CD22" относится к любому природному CD22, источником которого может служить любое позвоночное, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди, яванский макак (cyno)) и грызуны (например, мыши и крысы), если не указано иначе. Термин включает "полноразмерный", непроцессированный CD22, а также любую форму CD22, которая является результатом процессинга в клетке. Термин также включает встречающиеся в природе варианты CD22, например, варианты сплайсинга, аллельные варианты и изоформы. Основная изоформа CD22 (CD22бета) содержит 847 аминокислот и семь иммуноглобулин-подобных областей во внеклеточном домене (см. Wilson, G.L. et al., J. Exp. Med. 173: 137-146 (1991)). Второстепенная изоформа, CD22-альфа, содержит 647 аминокислот и в ее внеклеточном домене отсутствуют иммуноглобулин-подобные домены 3 и 4 (см. Stamenkovic, I. and Seed, B., Nature 345: 74-77 (1990)) и Wilson et al., (1991), выше). Аминокислотная последовательность CD22бета приведена на фиг.1B, где подчеркнутая область представляет собой внеклеточный домен (ECD), а область, отображенная курсивом, указывает аминокислоты, отсутствующие в последовательности внеклеточного домена CD22 альфа. На фиг.1C представлена аминокислотная последовательность CD22альфа, в которой ECD подчеркнут. Аминокислотная последовательность от аминокислоты 1 до аминокислоты 21 представляет сигнальную последовательность, отщепляемую от зрелой формы белка. В одном из вариантов осуществления CD22 экспрессирован на клеточной поверхности, так как на поверхности нормальной B-клетки или опухолевой B-клетки. На фиг.1D представлена аминокислотная последовательность CD22 яванского макака.

"Антитела" (Ab) и "иммуноглобулины" (Ig) представляют собой гликопротеины со сходными структурными характеристиками. В то время как антитела демонстрируют специфичность связывания с конкретным антигеном, иммуноглобулины включают и антитела и другие подобные антителам молекулы, у которых, как правило, отсутствует антигенная специфичность. Полипептиды последнего типа образуются, например, на низких уровнях лимфатической системой и на повышенных уровнях миеломами.

Термины "антитело" и "иммуноглобулин" используют взаимозаменяемо в самом широком смысле, и они включают моноклональные антитела (например, полноразмерные или интактные моноклональные антитела), поликлональные антитела, моновалентные антитела, поливалентные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела при условии, что они проявляют желательную биологическую активность), а также могут включать определенные фрагменты антител (как более подробно описано в настоящем документе). Антитело может быть химерным, человеческим, гуманизированным и/или аффинно зрелым.

Термин "антитело к CD22" или "антитело, связывающееся с CD22" относится к антителу, которое способно к связыванию с CD22 с достаточной аффинностью так, что антитело пригодно в качестве диагностического и/или терапевтического средства с направленной доставкой к CD22. Предпочтительно, степень связывания антител к CD22 к неродственному белку, не являющемуся CD22, составляет менее чем приблизительно 10% от связывания антитела с CD22 как измерено, например, посредством радиоиммунологического анализа (RIA). В определенных вариантах осуществления антитело, связывающееся с CD22, обладает константой диссоциации (Kd) 1 мкМ, 100 нМ, 10 нМ, 1 нМ или 0,1 нМ. В определенных вариантах осуществления антитело к CD22 связывается с эпитопом CD22, который консервативен в CD22 у различных видов.

"Вариабельная область" или "вариабельный домен" антитела относится к аминоконцевым доменам тяжелой или легкой цепи антитела. Вариабельный домен тяжелой цепи можно обозначать как "VH". Вариабельный домен легкой цепи можно обозначать как "VL". Эти домены, как правило, являются наиболее вариабельными частями антитела и содержат антигенсвязывающие участки.

Термин "вариабельный" относится к тому факту, что определенные части вариабельных доменов сильно отличаются по последовательности среди антител и используются в связывании и специфическом узнавании каждым конкретным антителом его конкретного антигена. Однако вариабельность распределена на всем протяжении вариабельных доменов антител не равномерно. Она сосредоточена в трех сегментах, называемых определяющими комплементарность областями (CDR) или гипервариабельными областями (HVR) в вариабельных доменах легких цепей и тяжелых цепей. Более высококонсервативные части вариабельных доменов называют каркасными областями (FR). Вариабельные домены исходных тяжелых и легких цепей содержат по четыре области FR, в основном принимающие конфигурацию бета-слоя, связанные тремя CDR, которые формируют петли, соединяющие, а в некоторых случаях формирующие часть структуры бета-слоев. CDR в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости областями FR и вместе с CDR из другой цепи участвуют в формировании антигенсвязывающего участка антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Константные домены напрямую не участвуют в связывании антитела с антигеном, но обладают различными эффекторными функциями, такими как участие антитела в антителозависимой клеточной токсичности.

"Легкие цепи" антител (иммуноглобулинов) любого вида позвоночных на основе аминокислотных последовательностей их константных доменов можно отнести к одному из двух четко выраженных типов, называемых каппа ( ) и лямбда ( ).

В зависимости от аминокислотных последовательностей константных доменов их тяжелых цепей антитела (иммуноглобулины) можно отнести к различным классам. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, а некоторые из них можно дополнительно разделить на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄ , IgA₁ и IgA₂. Константные домены тяжелых цепей, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, называются , , , и µ, соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны и в основном описаны, например, в Abbas et al., Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (2000). Антитело может являться частью более крупной слитой молекулы, сформированной ковалентным или нековалентным соединением антитела с одним или несколькими другими белками или пептидами.

Термины "полноразмерное антитело", "интактное антитело" и "целое антитело" используют в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения антитела в его по существу интактной форме, а не в виде фрагментов антител, как определено ниже. Термины, в частности, относятся к антителу с тяжелыми цепями, которые содержат Fc-области.

"Фрагменты антител" содержат только часть интактного антитела, где эта часть сохраняет, по меньшей мере, одну и до большинства или все, из функций, в норме ассоциированных с данной частью, когда она находится в интактном антителе. В одном из вариантов осуществления фрагмент антитела содержит антигенсвязывающий участок интактного антитела и таким образом сохраняет способность связывать антиген. В другом варианте осуществления фрагмент антитела, например, фрагмент, содержащий Fc-область, сохраняет по меньшей мере одну из биологических функций, в норме ассоциированных с Fc-областью, когда она находится в интактном антителе, такую как связывание FcRn, модуляция времени полужизни антитела, функция ADCC и связывание комплемента. В одном из вариантов осуществления фрагмент антитела представляет собой моновалентное антитело, обладающее временем полужизни in vivo, по существу сходным со временем для интактного антитела. Например, такой фрагмент антитела может содержать антигенсвязывающее плечо, связанное с последовательностью Fc, способной обеспечивать стабильность фрагмента in vivo.

Расщепление антител папаином приводит к образованию двух идентичных антигенсвязывающих фрагментов, называемых "Fab"-фрагменты, каждый с одним антигенсвязывающим участком, и одного остаточного "Fc"-фрагмента, название которого отражает его способность к легкой кристаллизации. Обработка пепсином приводит к образованию фрагмента (Fab') ₂, содержащего два антигенсвязывающих участка и все еще способного к перекрестному связыванию антигена.

"Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, содержащий полный антигенсвязывающий участок. В одном из вариантов осуществления двухцепочечная молекула Fv состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи в тесной нековалентной ассоциации. В молекуле одноцепочечного Fv (scFv) один вариабельный домен тяжелой цепи и один вариабельный домен легкой цепи могут быть ковалентно связаны посредством гибкого пептидного линкера так, что легкая и тяжелая цепь могут ассоциировать в "димерную" структуру, аналогичную структуре двухцепочечной молекулы Fv. Именно в этой конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют с образованием антигенсвязывающего участка на поверхности димера VH-VL. Вместе шесть CDR обеспечивают антителу специфичность связывания антигена. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичные для антигена) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и с меньшей аффинностью, чем целый участок связывания.

Фрагмент Fab содержит вариабельные домены тяжелой и легкой цепей, а также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Фрагменты Fab' отличаются от фрагментов Fab добавлением нескольких остатков на C-конце CH1 домена тяжелой цепи, включая один или несколько цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH в настоящем документе представляет собой обозначение для Fab', в котором остаток цистеина(ов) константных доменов несет свободную тиольную группу. Фрагменты (Fab')₂ антител исходно получали как пары фрагментов Fab', которые содержат между собой шарнирные цистеины. Также известны другие химические соединители фрагментов антител.

Фрагменты антител "одноцепочечные Fv" или "scFv" содержат домены антитела VH и VL, где эти домены находятся в одной полипептидной цепи. Как правило, полипептид scFv между VH и VL доменами дополнительно содержит полипептидный линкер, который позволяет scFv формировать желаемую для связывания антигена структуру. Для обзора см. scFv Pluckthun, в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994).

Термин "диатела" относится к небольшим фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими участками, где эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в той же полипептидной цепи (VH-VL). Посредством использования линкера, который является слишком коротким, чтобы позволить спаривание между двумя доменами одной цепи, домены вынуждают образовывать пару с комплементарными доменами другой цепи и получают два антигенсвязывающих участка. Диатела могут быть бивалентными или биспецифическими. Диатела более полно описаны, например, в EP 404097; WO 93/1161; Hudson et al., (2003) Nat. Med. 9: 129-134; и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). В Hudson et al., (2003) Nat. Med. 9: 129-134 также описаны триатела и тетратела.

Как применяют в настоящем документе, термин "моноклональное антитело" относится к антителу, полученному из группы по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие группу, являются идентичными за исключением возможных мутаций, например, встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Таким образом, определение "моноклональный" указывает на характеристику антитела как не являющегося смесью различных антител. В определенных вариантах осуществления такое моноклональное антитело, как правило, включает антитело, содержащее полипептидную последовательность, которая связывает мишень, где связывающая мишень полипептидная последовательность получена способом, который включает отбор связывающей одну мишень полипептидной последовательности из множества полипептидных последовательностей. Например, процесс отбора может представлять собой отбор уникального клона из множества клонов, таких как пул гибридомных клонов, фаговых клонов или клонов рекомбинантной ДНК. Следует понимать, что выбранную связывающую мишень последовательность можно дополнительно изменять, например, для увеличения аффинности в отношении мишени, для гуманизации связывающей мишень последовательности, для увеличения продукции в клеточной культуре, для уменьшения ее иммуногенности in vivo, для получения полиспецифического антитела и т.д., и что антитело, содержащее измененную связывающую мишень последовательность также представляет собой моноклональное антитело по данному изобретению. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, содержат различные антитела, направленные к различным детерминантам (эпитопам), каждое моноклональное антитело из препарата моноклонального антитела направлено к одной детерминанте на антигене. В дополнение к их специфичности, препараты моноклональных антител имеют преимущество в том, что они, как правило, не загрязнены другими иммуноглобулинами.

Определение "моноклональный" указывает на характеристику антитела, как полученного по существу из гомогенной группы антител, и его не следует рассматривать как требующего получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для применения по настоящему изобретению можно получать множеством способов, включая, например, гибридомный способ (например, Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2^nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), способы рекомбинантной ДНК (например, см. патент США № 4816567), технологии фагового дисплея (например, см. Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004) и Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004), и способы получения антител человека или подобных антителам человека у животных, которые имеет части или все локусы или гены иммуноглобулинов человека, кодирующие последовательности иммуноглобулинов человека (например, см. WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; WO 91/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); патенты США № 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5661016; Marks et al., Bio. Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) и Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

Моноклональные антитела в настоящем документе, в частности, включают "химерные" антитела, у которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям антител, полученных у конкретного вида или принадлежащих конкретному классу или подклассу антител, тогда как оставшаяся часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, полученных у другого вида или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они проявляют желательную биологическую активность (патент США № 4816567 и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

"Гуманизированные" формы не принадлежащих человеку (например, мышиных) антител представляют собой химерные антитела, содержащие минимальную последовательность, полученную из не принадлежащего человеку иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления гуманизированное антитело представляет собой иммуноглобулин человека (реципиентное антитело), в котором остатки из гипервариабельной области реципиента заменены остатками из гипервариабельной области не являющихся человеком видов (донорное антитело), таких как мышь, крыса, кролик, или не являющийся человеком примат с желательной специфичностью, аффинностью и/или емкостью. В некоторых случаях соответствующими не принадлежащими человеку остатками замещают остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не существуют в реципиентном антителе или в донорном антителе. Эти модификации можно проводить для дальнейшего повышения эффективности антитела. В основном гуманизированное антитело содержит по существу весь, по меньшей мере, один, а, как правило, два, вариабельных домена, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют гипервариабельным петлям не принадлежащего человеку иммуноглобулина, и все или по существу все FR представляют собой FR последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно также содержит, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, часть константной области иммуноглобулина человека. Более подробно, см. Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988) и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). Также см. следующие обзорные статьи и цитируемые в них ссылки: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428-433 (1994).

"Антитело человека" представляет собой антитело, которое содержит аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности антитела, продуцируемого человеком, и/или полученную любым из способов получения антител человека, как описано в настоящем документе. Это определение антитела человека конкретно исключает гуманизированное антитело, содержащее не принадлежащие человеку антигенсвязывающие остатки.

При использовании в настоящем документе термин "гипервариабельная область", "HVR" или "HV" относится к областям вариабельного домена антитела, которые являются гипервариабельными в последовательности и/или формируют структурно заданные петли. Как правило, антитела содержат шесть гипервариабельных областей; три в VH (H1, H2, H3) и три в VL (L1, L2, L3). В природных антителах наибольшее разнообразие из шести гипервариабельных областей демонстрируют H3 и L3, и полагают, что конкретно H3 играет уникальную роль в придании антителам высокой специфичности. Xu et al., (2000) Immunity 13: 37-45; Johnson and Wu (2003) в Methods in Molecular Biology 248: 1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ). Действительно, встречающиеся в природе антитела верблюда, состоящие только из тяжелой цепи, функциональны и стабильны в отсутствие легкой цепи. Hamers-Casterman et al., (1993) Nature 363: 446-448; Sheriff et al., (1996) Nature Struct. Biol. 3: 733-736.

В настоящем документе применяется и находится в обращении ряд описаний гипервариабельных областей. Определяющие комплементарность области (CDR) по Kabat основаны на вариабельности последовательности и являются наиболее общеупотребительными (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Вместо этого Chothia указывает на положение структурных петель (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Гипервариабельные области AbM представляют компромисс между CDR по Kabat и структурными петлями по Chothia и их используют в программном обеспечении моделирования антител Oxford Molecular's AbM. "Контактные" гипервариабельные области основаны на анализе доступных комплексных кристаллических структур. Ниже указаны остатки каждой из этих гипервариабельных области.

Петля	Kabat	AbM	Chothia	Контакт
L1	L24-L34	L24-L34	L26-L32	L30-L36
L2	L50-L56	L50-L56	L50-L52	L46-L55
L3	L89-L97	L89-L97	L91-L96	L89-L96
H1	H31-H35B	H26-H35B	H26-H32	H30-H35B
(Нумерация по Kabat)
H1	H31-H35	H26-H35	H26-H32	H30-H35
(Нумерация по Chothia)
H2	H50-H65	H50-H58	H53-H55	H47-H58
H3	H95-H102	H95-H102	H96-H101	H93-H101

Гипервариабельные области могут содержать "расширенные гипервариабельные области", как указано далее: 24-36 или 24-34 (L1), 46-56 или 50-56 (L2) и 89-97 или 89-96 (L3) в VL и 26-35 (H1), 50-65 или 49-65 (H2) и 93-102, 94-102, или 95-102 (H3) в VH. В каждом из этих определений остатки вариабельных доменов нумеруют по Kabat et al., выше. Гипервариабельные области HVR-H1 и HVR-H2 of антител 10F4 к CD22 по изобретению представляют собой H26-H35 и H49-H65 с использованием нумерации по Kabat.

"Каркасные" или "FR" остатки представляют собой те остатки вариабельных доменов, которые отличаются от остатков гипервариабельных областей, как определено в настоящем документе.

Термин "нумерация остатков вариабельного домена как в Kabat" или "нумерация положений аминокислот как в Kabat" и их варианты относится к системе нумерации, используемой для вариабельных доменов тяжелых цепей или вариабельных доменов легких цепей в представлении антител в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). С применением этой системы нумерации фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньше аминокислот или дополнительные аминокислоты, соответствующие укорочению или вставке в FR или HVR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать вставку одной аминокислоты (остаток 52a по Kabat) после остатка 52 H2 и вставленные остатки (например, остатки 82a, 82b и 82c и т.д. по Kabat) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерацию остатков по Kabat для данного антитела можно определить посредством выравнивания по областям гомологии последовательности антитела со "стандартной" пронумерованной по Kabat последовательностью.

"Аминокислота свободного цистеина" относится к аминокислотному остатку цистеина, который вставлен биоинженерным способом в исходное антитело, несет тиольную функциональную группу (-SH) и не спарен в качестве или не является частью иным образом внутримолекулярного или межмолекулярного дисульфидного мостика.

Термин "значение тиоловой реакционноспособности" представляет собой количественную характеристику реактивности аминокислот свободного цистеина. Значение тиоловой реакционноспособности представляет собой процент аминокислоты свободного цистеина в модифицированном цистеином антителе, который вступает в реакцию с реагирующим с тиолами реагентом и преобразуется в максимальное значение 1. Например, аминокислота свободного цистеина в модифицированном цистеином антителе, которая со 100% выходом вступает в реакцию с реагирующим с тиолами реагентом, таким как биотинмалеимидный реагент, с формированием меченного биотином антитела имеет значение тиоловой реакционноспособности 1,0. Другая аминокислота цистеина, вставленная в то же или другое исходное антитело, которая с 80% выходом вступает в реакцию с реагирующим с тиолами реагентом, имеет значение тиоловой реакционноспособности 0,8. Другая аминокислота цистеина, вставленная в то же или другое исходное антитело, которая совсем не вступает в реакцию с реагирующим с тиолами реагентом, имеет значение тиоловой реакционноспособности 0. Определение значения тиоловой реакционноспособности конкретного цистеина можно проводить посредством анализа ELISA, масс-спектроскопии, жидкостной хроматографии, ауторадиографии или других количественных аналитических тестов. Вступающие в реакцию с тиолами реагенты, позволяющие захват модифицированного цистеином антитела и сравнение и количественный анализ реактивности цистеина, включают биотин-PEO-малеимид ((+)-биотинил-3-малеимидопропионамидил-3,6-диоксаоктаиндиамин, Oda et al., (2001) Nature Biotechnology 19:379-382, Pierce Biotechnology, Inc.) Биотин-BMCC, PEO-йодацетилбиотин, йодацетил-1C-биотин и биотин-HPDP (Pierce Biotechnology, Inc.) и Na-(3-малеимидилпропионил)биоцитин (MPB, Molecular Probes, Eugene, OR). Другие коммерческие источники для биотинилирование, бифункциональные и полифункциональные линкерные реагенты включают Molecular Probes, Eugene, OR и Sigma, St. Louis, MO.

"Исходное антитело" представляет собой антитело, содержащее аминокислотную последовательность, на основании которой один или несколько аминокислотных остатков замещают одним или несколькими остатками цистеина. Исходное антитело может содержать природную последовательность или последовательность дикого типа. Исходное антитело может содержать предсуществующие модификации аминокислотной последовательности (такие как добавления, делеции и/или замены) относительно других природных, дикого типа или модифицированных форм антитела. Исходное антитело может быть направлено к представляющему интерес антигену-мишени, например, к биологически важному полипептиду. Также рассматривают антитела, направленные к неполипептидным антигенам (таким как ассоциированные с опухолями гликолипидные антигены; см. патент США 5091178).

В настоящем документе используют следующие аббревиатуры, и они имеют указанные определения: BME представляет собой бета-меркаптоэтанол, Boc представляет собой N-(трет-бутоксикарбонил), cit представляет собой цитруллин (2-амино-5-уреидопентановая кислота), dap представляет собой долапроин, DCC представляет собой 1,3-дициклогексилкарбодиимид, DCM представляет собой дихлорметан, DEA представляет собой диэтиламин, DEAD представляет собой диэтилазодикарбоксилат, DEPC представляет собой диэтилфосфорилцианидат, DIAD представляет собой диизопропилазодикарбоксилат, DIEA представляет собой N,N-диизопропилэтиламин, dil представляет собой долаизолейцин, DMA представляет собой диметилацетамид, DMAP представляет собой 4-диметиламинопиридин, DME представляет собой простой диметиловый эфир этиленгликоля (или 1,2-диметоксиэтан), DMF представляет собой N,N-диметилформамид, DMSO представляет собой диметилсульфоксид, doe представляет собой долафенин, dov представляет собой N,N-диметилвалин, DTNB представляет собой 5,5'-дитиобис(2-нитробензойную кислоту), DTPA представляет собой диэтилентриаминпентауксусную кислоту, DTT представляет собой дитиотреитол, EDCI представляет собой гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида, EEDQ представляет собой 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин, ES-MS представляет собой электроспрейную масс-спектрометрию, EtOAc представляет собой этилацетат, Fmoc представляет собой N-(9-флуоренилметоксикарбонил), gly представляет собой глицин, HATU представляет собой гексафторфосфат O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония, HOBt представляет собой 1-гидроксибензотриазол, ВЭЖХ представляет собой высокоэффективную жидкостную хроматографию, ile представляет собой изолейцин, lys представляет собой лизин, MeCN (CH₃ CN) представляет собой ацетонитрил, MeOH представляет собой метанол, Mtr представляет собой 4-анизилдифенилметил (или 4-метокситритил), nor представляет собой (1S,2R)-(+)-норэфедрин, PAB представляет собой п-аминобензилкарбамоил, PBS представляет собой фосфатно-солевой буфер (pH 7), PEG представляет собой полиэтиленгликоль, Ph представляет собой фенил, Pnp представляет собой п-нитрофенил, MC представляет собой 6-малеимидокапроил, phe представляет собой L-фенилаланин, PyBrop представляет собой гексафторфосфат бром-трис-пирролидинофосфония, SEC представляет собой эксклюзионную хроматографию, Su представляет собой сукцинимид, TFA представляет собой трифторуксусную кислоту, TLC представляет собой тонкослойную хроматографию, UV представляет собой ультрафиолет и val представляет собой валин.

"Аффинно зрелое" антитело представляет собой антитело с одним или несколькими изменениями в одной или нескольких его HVR, что приводит к улучшению аффинности антитела в отношении антигена по сравнению с исходным антителом, в котором нет такого изменения(ий). В одном из вариантов осуществления аффинно зрелое антитело обладает наномолярными или даже пикомолярными аффинностями для антигена-мишени. Аффинно зрелые антитела получают известными в данной области способами. В Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992) описано созревание аффинности посредством перестановки доменов VH и VL. Случайный мутагенез HVR и/или каркасных остатков описан в Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7): 3310-9 (1995) и Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992).

"Блокирующее" антитело или "антагонистическое" антитело представляет собой антитело, которое ингибирует или снижает биологическую активность связываемого им антигена. Определенные блокирующие антитела или антагонистические антитела в значительной степени или полностью ингибируют биологическую активность антигена.

Как применяют в настоящем документе, "агонистическое антитело", представляет собой антитело, которое имитирует, по меньшей мере, один из видов функциональной активности представляющего интерес полипептида.

"Эффекторные функции" антитела относятся к тем видам биологической активности, которые свойственны Fc-области (Fc-область с природной последовательностью или Fc-область с вариантом аминокислотной последовательности) антитела, и варьируют в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антител включают связывание C1q и обусловленную комплементом цитотоксичность; связывание Fc-рецептора; антителозависимую опосредованную клетками цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; негативную регуляцию клеточных поверхностных рецепторов (например, B-клеточный рецептор) и активацию B-клеток.

"Fc-рецептор" или "FcR" описывает рецептор, который связывается с Fc-областью антитела. В некоторых вариантах осуществления FcR представляет собой природный FcR человека. В некоторых вариантах осуществления FcR представляет собой FcR, который связывает антитело IgG (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов Fc RI, Fc RII и Fc RIII, включая аллельные варианты и формы альтернативного сплайсинга этих рецепторов. Рецепторы Fc RII включают Fc RIIA ("активирующий рецептор") и Fc RIIB ("ингибирующий рецептор"), со сходными аминокислотными последовательностями, которые в основном отличаются их цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор Fc RIIA содержит в своем цитоплазматическом домене иммунорецепторный активирующий мотив на основе тирозина (ITAM). Ингибирующий рецептор Fc RIIB содержит в своем цитоплазматическом домене иммунорецепторный ингибирующий мотив на основе тирозина (ITIM) (см. Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). FcR рассмотрены в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). В настоящем документе термин "FcR" охватывает и другие FcR, включая FcR, которые будут идентифицированы в будущем.

Термин "Fc-рецептор" или "FcR" также включает неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)) и регуляцию гомеостаза иммуноглобулинов. Способы измерения связывания с FcRn известны (см., например, Ghetie 1997, Hinton 2004). Связывание с FcRn человека in vivo и время полужизни в сыворотке FcRn человека полипептидов с высокой аффинностью связывания можно оценить, например, у трансгенных мышей или трансфицированных клеточных линий человека, экспрессирующих FcRn человека, или у приматов, которым ввели варианты полипептидов Fc.

В WO 00/42072 (Presta) описаны варианты антител с улучшенным или сниженным связыванием с FcR. Содержание этой патентной публикации включено в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. Также см. Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).

"Эффекторные клетки человека" представляют собой лейкоциты, экспрессирующие один или несколько FcR и осуществляющие эффекторные функции. В определенных вариантах осуществления клетки экспрессируют, по меньшей мере, Fc RIII и осуществляют эффекторную функцию(и) ADCC. Примеры лейкоцитов человека, опосредующих ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), естественные киллерные (NK) клетки, моноциты, цитотоксические T-клетки и нейтрофилы. Эффекторные клетки можно выделять из природного источника, например из крови.

"Обусловленная антителами опосредованная клетками цитотоксичность" или "ADCC" относится к форме цитотоксичности, при которой секретируемые Ig связывается Fc-рецепторами (FcR), находящимися на определенных цитотоксических клетках (например, естественные киллерные (NK) клетки, нейтрофилы и макрофаги), позволяя этим цитотоксическим эффекторным клеткам специфически связываться с несущей антиген клеткой-мишенью, а затем уничтожать клетку-мишень цитотоксинами. Первичные клетки, опосредующие ADCC, NK клетки, экспрессируют только Fc RIII, тогда как моноциты экспрессируют Fc RI, Fc RII и Fc RIII. Экспрессия FcR на гемопоэтических клетках суммирована в таблице 3 на странице 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). Для оценки активности ADCC представляющей интерес молекулы можно проводить анализ ADCC in vitro, такой как анализ, описанный в патенте США № 5500362 или 5821337, или патенте США № 6737056, выданном Presta. Пригодные для таких анализов эффекторные клетки включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и естественные киллерные (NK) клетки. Альтернативно или дополнительно, активность ADCC представляющей интерес молекулы можно оценивать in vivo, например, в модели на животных, такой как модель, описанная в Clynes et al., PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).

"Обусловленная комплементом цитотоксичность" или "CDC" относится к лизису клетки-мишени в присутствии комплемента. Активация классического пути комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с антителами (подходящего подкласса), которые связаны с узнаваемым ими антигеном. Для оценки активации комплемента можно проводить анализ CDC, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).

Варианты полипептидов с измененными аминокислотными последовательностями Fc-области и увеличенной или сниженной способностью связывания C1q описаны в патенте США № 6194551B1 и WO 99/51642. Содержания этих патентных публикаций включены в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. Также см. Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Термин "содержащий Fc-область полипептид" относится к полипептиду, такому как антитело или иммуноадгезин, который содержит Fc-область. C-концевой лизин (остаток 447 по нумерации системы EU) Fc-области можно удалять, например, при очистке полипептида или посредством рекомбинантного конструирования кодирующей полипептид нуклеиновой кислоты. Таким образом, композиция, содержащая полипептид с Fc-областью по данному изобретению, может содержать полипептиды с K447, со всеми удаленными K447 или смесь полипептидов с остатком K447 и без него.

"Акцепторный каркас человека" для целей настоящего документа представляет собой каркас, содержащий аминокислотную последовательность каркаса VL или VH, полученную из каркаса иммуноглобулина человека или консенсусного каркаса человека. Акцепторный каркас человека "полученный из" каркаса иммуноглобулина человека или консенсусного каркаса человека может содержать такую же их аминокислотную последовательность или он может содержать предсуществующие изменения в аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления количество предсуществующих замен аминокислот составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее или 2 или менее. Там, где в VH присутствуют предсуществующие замены аминокислот, предпочтительно эти замены происходят только по трем, двум или одному положениям 71H, 73H и 78H; например, аминокислотные остатки в этих положениях могут представлять собой 71A, 73T и/или 78A. В одном из вариантов осуществления акцепторный каркас VL человека идентичен последовательности каркаса VL иммуноглобулина человека или последовательности консенсусного каркаса человека.

"Консенсусный каркас человека" представляет собой каркас, который представляет наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки при выборе каркасных последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека. Как правило, выбор последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека проводят из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Как правило, подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу, как в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). В одном из вариантов осуществления VL подгруппа представляет собой подгруппу каппа I как в Kabat et al., выше. В одном из вариантов осуществления VH подгруппа представляет собой подгруппу III как в Kabat et al., выше.

"Консенсусный каркас VH подгруппы III" содержит консенсусную последовательность, полученную из аминокислотных последовательностей в подгруппе III вариабельных доменов тяжелых цепей в Kabat et al., выше. В одном из вариантов осуществления аминокислотная последовательность консенсусного каркаса VH подгруппы III содержит, по меньшей мере, часть из каждой или все следующие последовательности:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (FR-H1, SEQ ID NO: 1)-HVR-H1-

WVRQAPGKGLEWV (FR-H2, SEQ ID NO: 3)-HVR-H2-

RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC (FR-H3, SEQ ID NO: 5)-HVR-H3-

WGQGTLVTVSS (FR-H4, SEQ ID NO: 7).

"Консенсусный каркас VL подгруппы I" содержит консенсусную последовательность, полученную из аминокислотных последовательностей в подгруппе I вариабельных доменов легких цепей каппа в Kabat et al., выше. В одном из вариантов осуществления аминокислотная последовательность консенсусного каркаса VL подгруппы I содержит, по меньшей мере, часть из каждой или все следующие последовательности:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (FR-L1, SEQ ID NO: 8)-HVR-L1-

WYQQKPGKAPKLLIY (FR-L2, SEQ ID NO: 11)-HVR-L2-

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (FR-L3, SEQ ID NO: 13)-HVR-L3-FGQGTKVEIK (FR-L4, SEQ ID NO: 15).

"Секреторная сигнальная последовательность" или "сигнальная последовательность" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей короткий сигнальный пептид, который можно использовать для направления вновь синтезированного представляющего интерес белка через клеточную мембрану, как правило, внутреннюю мембрану или внутреннюю или наружные мембраны прокариот. Поэтому представляющий интерес белок, такой как полипептид легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина, секретируется в периплазму прокариотических клеток-хозяев или в среду для культивирования. Сигнальный пептид, кодируемый секреторной сигнальной последовательностью, может быть эндогенным для клеток-хозяев, или он может быть экзогенным, включая сигнальные пептиды, встречающиеся с экспрессируемым полипептидом в природе. Секреторные сигнальные последовательности, как правило, находятся на аминоконце экспрессируемого полипептида и, как правило, ферментативно удаляются в промежутке между биосинтезом и секрецией полипептида из цитоплазмы. Таким образом, сигнальный пептид, как правило, не присутствует в продукте зрелого белка.

Как правило, "аффинность связывания" относится к силе суммы общих нековалентных взаимодействий между одним участком связывания молекулы (например, антитела) и его партнера по связыванию (например, антигена). Как применяют в настоящем документе, если не указано иначе, "аффинность связывания" относится к естественной аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между партнерами пары связывания (например, антитело и антиген). Аффинность молекулы X для ее партнера Y, как правило, можно представить константой диссоциации (Kd). Аффинность можно измерять общеизвестными в данной области способами, включая способы, описываемые в настоящем документе. Низкоаффинные антитела, как правило, медленно связывают антиген и имеют тенденцию к легкой диссоциации, тогда как высокоаффинные антитела, как правило, связывают антиген быстрее и имеют тенденцию оставаться связанными дольше. В данной области известно множество способов измерения аффинности связывания, любой из которых можно использовать для целей настоящего изобретения. Конкретные иллюстративные варианты осуществления описаны ниже.

В одном из вариантов осуществления "Kd" или "значение Kd" по данному изобретению измеряют посредством анализа связывания радиоактивных антигенов (RIA), проводимого с Fab-вариантом представляющего интерес антитела и его антигеном, как описано в следующем анализе. Аффинность связывания Fab для антигена в растворе измеряют посредством уравновешивания Fab с минимальной концентрацией меченного (¹²⁵I) антигена в присутствии титрующих разведений немеченого антигена, затем проводя захват связанного антигена на покрытом антителами к Fab планшете (Chen, et al., (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881). Для создания условий для анализа планшеты для микротитрования (Dynex) покрывают в течение ночи 5 мкг/мл захватывающего антитела к Fab (Cappel Labs) в 50 мМ карбонате натрия (pH 9,6), а затем блокируют 2% (масс./об.) бычьим сывороточным альбумином в PBS в течение от двух до пяти часов при комнатной температуре (приблизительно 23°C). В неадсорбирующем планшете (Nunc № 269620), 100 пМ или 26 мМ [¹²⁵I]-антиген смешивают с серийными разведениями представляющего интерес Fab (например, в соответствии с оценкой антитела к VEGF, Fab-12, в Presta et al., (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599). Затем представляющий интерес Fab инкубируют в течение ночи; однако, инкубацию можно продолжать и более длительный период (например, приблизительно 65 часов) для гарантии того, что равновесие достигнуто. Затем смеси переносят на захватывающий планшет для инкубации при комнатной температуре (например, в течение одного часа). Затем раствор удаляют и планшет промывают восемь раз 0,1% Tween-20 в PBS. После высушивания планшетов добавляют 150 мкл/лунка сцинтиллятора (MicroScint-20; Packard) и на планшетах проводят подсчет на гамма-счетчике Topcount (Packard) в течение десяти минут. Концентрации каждого Fab, дающие меньшие или равные 20% максимального связывания, выбирают для применения в анализах конкурентного связывания.

По другому варианту осуществления, Kd или значение Kd измеряют посредством использования анализов поверхностного плазмонного резонанса с применением BIAcoreTM-2000 или BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C с применением чипов CM5 с иммобилизованным антигеном при ~10 единицах ответа (RU). В кратком изложении, карбоксиметилированные декстрановые биосенсорные чипы (CM5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) по инструкциям поставщика. Перед инъекцией при скорости потока 5 мкл/минута с достижением приблизительно 10 единиц ответа (RU) связанного белка антиген разводят 10 мМ ацетатом натрия, pH 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ). После инъекции антигена инъецируют 1 M этаноламин для блокирования непрореагировавших групп. Для кинетических измерений инъецируют двукратные серийные разведения Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) в PBS с 0,05% Tween 20 (PBST) при 25°C при скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (kon) и скорости диссоциации (koff) подсчитывают с применением простой модели связывания Лэнгмюра один-к-одному (BIAcore Evaluation Software version 3.2) посредством одновременного построения сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (Kd) подсчитывают как отношение koff/kon. См., например, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881. Если скорость образования при анализе поверхностного плазмонного резонанса превышает 10⁶ М^-1 с^-1, тогда скорость образования можно определять с применением способа гашения флуоресценции, который измеряет увеличение или уменьшение интенсивности излучения флуоресценции (возбуждение = 295 нм; излучение = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°C 20 нМ антитела к антигену (в форме Fab) в PBS, pH 7,2, в присутствии увеличивающихся концентраций антигена, как измеряют в спектрометре, таком как оборудованные остановленным потоком спектрофотометр (Aviv Instruments) или спектрофотометр SLM-Aminco 8000 серии (ThermoSpectronic) с применением кюветы с перемешиванием.

"Скорость образования", "скорость ассоциации" или "k_on" по данному изобретению также можно определять так, как описано выше с применением системы BIAcoreTM-2000 или BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ).

"Нарушение" представляет собой любое патологическое состояние или заболевание, на которое можно благоприятно воздействовать при применении лечения веществом/молекулой или способом по изобретению. Оно включает хронические или острые нарушения, включая патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающего к рассматриваемому нарушению. Неограничивающие примеры нарушений для лечения по настоящему документу включают злокачественные состояния, такие как B-клеточные пролиферативные нарушения и/или B-клеточные опухоли, например, лимфому, неходжкинскую лимфому (NHL), агрессивную NHL, рецидивирующую агрессивную NHL, рецидивирующую медленно растущую NHL, рефракторную NHL, рефракторную медленно растущую NHL, хронический лимфолейкоз (CLL), мелкоклеточную лимфома, лейкоз, волосатоклеточный лейкоз (HCL), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL) и лимфому мантийных клеток.

Термины "клеточное пролиферативное нарушение" и "пролиферативное нарушение" относятся к нарушениям, которые ассоциированы с определенной степенью аномальной клеточной пролиферации. В одном из вариантов осуществления клеточное пролиферативное нарушение представляет собой злокачественную опухоль.

Как применяют в настоящем документе, "опухоль" относится к любому росту и пролиферации неопластических клеток, злокачественному или доброкачественному и ко всем предзлокачественным и злокачественным клеткам и тканям. Термины "злокачественная опухоль", "злокачественный", "клеточное пролиферативное нарушение", "пролиферативное нарушение" и "опухоль" не являются взаимоисключающими, как указано в настоящем документе.

Термины "злокачественная опухоль" и "злокачественный" относятся к физиологическому состоянию у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым клеточным ростом/пролиферацией, или описывают его. Примеры злокачественной опухоли включают в качестве неограничивающих примеров, злокачественные B-клеточные пролиферативные нарушения, где B-клеточное пролиферативное нарушение выбрано из лимфомы, неходжкинской лимфомы (NHL), агрессивной NHL, рецидивирующей агрессивной NHL, рецидивирующей медленно растущей NHL, рефракторной NHL, рефракторной медленно растущей NHL, хронического лимфолейкоза (CLL), мелкоклеточной лимфомы, лейкоза, волосатоклеточного лейкоза (HCL), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL) и лимфомы мантийных клеток. Включены другие злокачественные состояния, например, карцинома, лимфома (например, ходжкинская и неходжкинская лимфома), бластома, саркома и лейкоз. Более конкретные примеры таких злокачественных опухолей включают плоскоклеточную злокачественную опухоль, мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, аденокарциному легких, плоскоклеточную карциному легких, злокачественную опухоль брюшной полости, печеночно-клеточную злокачественную опухоль, желудочно-кишечную злокачественную опухоль, рак поджелудочной железы, глиому, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстого кишечника, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки, рак печени, рак предстательной железы, рак женских наружных половых органов, рак щитовидной железы, печеночную карциному, лейкоз и другие лимфопролиферативные нарушения и различные типы рака головы и шеи.

"B-клеточное злокачественное новообразование" в настоящем документе включает неходжкинскую лимфому (NHL), включая высокодифференцированную/фолликулярную NHL, мелкоклеточную (SL) NHL, промежуточной степени дифференцировки/фолликулярную NHL, промежуточной степени дифференцировки диффузную NHL, высокодифференцированную иммунобластную NHL, высокодифференцированную лимфобластную NHL, высокодифференцированную NHL из мелких нерасщепляющихся клеток, NHL с массивным поражением, лимфому мантийных клеток, связанную со СПИД лимфому и макроглобулинемию Вальденстрема, неходжкинскую лимфому (NHL), болезнь Ходжкина с преобладанием лимфоцитов (LPHD), мелкоклеточную лимфому (SLL), хронический лимфолейкоз (CLL), медленно растущую NHL, включая рецидивирующую медленно растущую NHL и рефракторную к ритуксимабу медленно растущую NHL; лейкоз, включая острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфолейкоз (CLL), волосатоклеточный лейкоз, хронический миелобластный лейкоз; лимфому мантийных клеток и другие гематологические злокачественные новообразования. Такие злокачественные новообразования можно лечить антителами, направленными к поверхностным маркерам B-клеток, таким как CD22. Такие заболевания рассматриваются в настоящем документе как подлежащие лечению введением антител, направленных к поверхностному B-клеточному маркеру, такому как CD22, и введение включает введение неконъюгированного ("свободного") антитела или антитела, конъюгированного с цитотоксическим средством, как описано в настоящем документе. Также такие заболевания рассматриваются в настоящем документе, как подлежащие комбинированному лечению, включающему антитело к CD22 или конъюгат антитело к CD22-лекарственное средство по изобретению в сочетании с другим антителом или конъюгатом антитело-лекарственное средство, другим цитотоксическим средством, лечением радиоактивностью или другим лечением, проводимым одновременно или последовательно. В иллюстративном способе лечения по изобретению антитело к CD22 по изобретению вводят в сочетании с антителом к CD20, иммуноглобулином, или его связывающим CD20 фрагментом, вместе или последовательно. Антитело к CD20 может представлять собой свободное антитело или конъюгат антитело-лекарственное средство. В варианте осуществления комбинированного лечения антитело к CD22 представляет собой антитело по настоящему изобретению, а антитело к CD20 представляет собой Rituxan® (ритуксан®, ритуксимаб).

Как применяют в настоящем документе, термин "неходжкинская лимфома" или "NHL" относится к злокачественной опухоли лимфатической системы, отличной от ходжкинских лимфом. Ходжкинские лимфомы, как правило, можно отличить от неходжкинских лимфом по присутствию клеток Рида-Штернберга при ходжкинских лимфомах и отсутствию указанных клеток при неходжкинских лимфомах. Примеры неходжкинских лимфом, охватываемых термином, как применяют в настоящем документе, включают любую неходжкинскую лимфому, которую специалист в данной области (например, онколог или патолог) идентифицирует как неходжкинскую в соответствии с известными в данной области схемами классификации, такими как схема Revised European-American Limphoma (REAL), как описано в Color Atlas of Clinical Hematology (3rd edition), A. Victor Hoffbrand and John E. Pettit (eds.) (Harcourt Publishers Ltd., 2000). В частности, см. списки на фиг.11.57, 11.58 и 11.59. Более конкретные примеры включают в качестве неограничивающих примеров рецидивирующую или рефракторную NHL, пограничную низкодифференцированную NHL, NHL стадии III/IV, устойчивую к химиотерапии NHL, лимфобластный лейкоз и/или лимфому из предшественников B-клеток, мелкоклеточную лимфому, B-клеточный хронический лимфолейкоз, и/или пролимфоцитарный лейкоз, и/или мелкоклеточную лимфому, B-клеточную пролимфоцитарную лимфому, иммуноцитому и/или лимфоплазматическую лимфому, лимфоплазматическую лимфому, лимфому B-клеток краевой зоны, лимфому селезеночной краевой зоны, внеузловую лимфому краевой зоны - MALT, узелковую лимфому краевой зоны, волосатоклеточный лейкоз, плазмоцитому и/или миелому плазматических клеток, низкодифференцированную/фолликулярную лимфому, промежуточной степени дифференцировки/фолликулярную NHL, лимфому мантийных клеток, лимфому центров фолликулов (фолликулярную), промежуточной степени дифференцировки диффузную NHL, диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому, агрессивную NHL (включая агрессивную пограничную NHL и агрессивную рецидивирующую NHL), NHL, рецидивирующую после трансплантации аутологичных стволовых клеток или рефракторную к ней, первичную медиастинальную крупноклеточную B-клеточную лимфому, первичную эксудативную лимфому, низкодифференцированную иммунобластную NHL, высокодифференцированную лимфобластную NHL, высокодифференцированную NHL из мелких нерасщепляющихся клеток, NHL с массивным поражением, лимфому Беркита, лейкоз из предшественников (периферических) больших гранулярных лимфоцитов, грибовидный микоз и/или синдром Сезари, кожные лимфомы, анапластическую крупноклеточную лимфому, ангиоцентрическую лимфому.

"Аутоиммунное заболевание" в настоящем документе представляет собой заболевание или нарушение, возникающее из и направленное против собственных тканей или органов индивидуума, или его отдельные симптомы или проявления, или возникающее вследствие него состояние. При многих из этих аутоиммунных и воспалительных нарушениях может существовать ряд клинических и лабораторных маркеров, включая в качестве неограничивающих примеров, гипергаммаглобулинемию, высокие уровни аутоантител, отложения комплексов антиген-антитело в тканях, улучшение после кортикостероидного или иммуносупрессирующего лечения и агрегаты лимфоидных клеток в пораженных тканях. Без ограничения какой-либо теорией, относительно опосредованного B-клетками аутоиммунного заболевания, полагают, что B-клетки проявляют патогенное действие при аутоиммунных заболеваниях человека посредством множества механических путей, включая продукцию аутоантител, формирование иммунных комплексов, активацию дендритных и T-клеток, синтез цитокинов, непосредственное высвобождение хемокинов и обеспечение очага для эктопического неолимфогенеза. Каждый из этих путей может принимать участие в патогенезе аутоиммунного заболевания в различной степени.

"Аутоиммунное заболевание" может представлять собой органоспецифическое заболевание (т.е. иммунный ответ специфично направлен против системы органов, такой как эндокринная система, система гемопоэза, кожа, сердечно-легочная система, система желудочно-кишечного тракта и печени, система почек, щитовидная железа, уши, нервно-мышечная система, центральная нервная система и т.д.) или системное заболевание, которое может поражать несколько органных систем (например, системная красная волчанка (СКВ), ревматоидный артрит, полимиозит и т.д.). Предпочтительные такие заболевания включают аутоиммунные ревматологические нарушения (например, такие как ревматоидный артрит, синдром Шегрена, склеродермия, волчанка, такая как СКВ и волчаночный нефрит, полимиозит/дерматомиозит, криоглобулинемия, синдром антифосфолипидных антител и псориатический артрит), аутоиммунные желудочно-кишечные и печеночные нарушения (например, такие как воспалительные заболевания кишечника (например, язвенный колит и болезнь Крона), аутоиммунный гастрит и пернициозная анемия, аутоиммунный гепатит, первичный биллиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит и глютеиновая болезнь), васкулит (например, такой как ANCA-негативный васкулит и ANCA-ассоциированный васкулит, включая васкулит Черджа-Стросс, гранулематоз Вегенера и микроскопический полиангиит), аутоиммунные неврологические нарушения (например, такие как рассеянный склероз, опсоклонический миоклонический синдром, миастения gravis, оптикомиелит, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и аутоиммунные полинейропатии), почечные нарушения (например, такие как гломерулонефрит, синдром Гудпасчера и болезнь Бергера), аутоиммунные дерматологические нарушения (например, такие как псориаз, крапивница, сыпь, обыкновенная пузырчатка, буллезный пемфигоид и кожный волчаночный эритематоз), гематологические нарушения (например, такие как тромбоцитопеническая пурпура, тромботическая тромбоцитопеническая пурпура, посттрансфузионная пурпура и аутоиммунная гемолитическая анемия), атеросклероз, увеит, аутоиммунные болезни слуха (например, такие как болезнь внутреннего уха и потеря слуха), болезнь Бехчета, синдром Рейно, трансплантат органа и аутоиммунные эндокринные нарушения (например, такие как связанные с диабетом аутоиммунные заболевания, такие как инсулинозависимый сахарный диабет (IDDM), болезнь Аддисона и аутоиммунное заболевание щитовидной железы (например, болезнь Грейвса и тиреоидит)). Более предпочтительные такие заболевания включают, например, ревматоидный артрит, язвенный колит, ANCA-ассоциированный васкулит, волчанку, рассеянный склероз, синдром Шегрена, болезнь Грейвса, IDDM, пернициозную анемию, тиреоидит и гломерулонефрит.

Конкретные примеры других аутоиммунных заболеваний, как определено в настоящем документе, которые в некоторых случаях включают аутоиммунные заболевания, перечисленные выше, включают в качестве неограничивающих примеров, артрит (острый и хронический ревматоидный артрит, включая юношеский ревматоидный артрит и стадии, такие как ревматоидный синовиит, подагра или подагрический артрит, острый иммунологический артрит, хронический воспалительный артрит, дегенеративный артрит, индуцированный коллагеном II типа артрит, инфекционный артрит, артрит Лайма, пролиферативный артрит, псориатический артрит, болезнь Стилла, артрит позвоночника, остеоартрит, хронический прогредиентный артрит, деформирующий артрит, первичный хронический полиартрит, реактивный артрит, менопаузальный артрит, артрит вследствие снижения эстрогенов и анкилозирующий спондилит/ревматоидный спондилит), аутоиммунное лимфопролиферативное заболевание, воспалительные гиперпролиферативные кожные заболевания, псориаз, такой как пятнистый псориаз, каплевидный псориаз, пустулезный псориаз и псориаз ногтей, аллергию, включая аллергические заболевания, такие как сенная лихорадка и синдром Джоба, дерматит, включая контактный дерматит, хронический контактный дерматит, шелушащийся дерматит, аллергический дерматит, аллергический контактный дерматит, сыпь, герпетиформный дерматит, монетовидный дерматит, себорейный дерматит, неспецифический дерматит, первичный контактный дерматит от раздражающих веществ и атопический дерматит, x-сцепленный синдром гипер IgM, аллергические внутриглазные воспалительные заболевания, крапивница, такая как хроническая аллергическая крапивница и хроническая идиопатическая крапивница, включая хроническую аутоиммунную крапивницу, миозит, полимиозит/дерматомиозит, юношеский дерматомиозит, токсический эпидермальный некролиз, склеродермию (включая системную склеродермию), склероз, такой как системный склероз, рассеянный склероз (РС), такой как спинооптический РС, первичный прогрессирующий РС (ППРС) и ремитирующий-рецидивирующий РС (РРРС), прогрессирующий системный склероз, атеросклероз, артериосклероз, рассеянный склероз, атаксический склероз, оптиконейромиелит (NMO), воспалительное заболевание кишечника (IBD) (например, болезнь Крона, аутоиммуноопосредованные желудочно-кишечные заболевания, желудочно-кишечное воспаление, колит, такой как язвенный колит, язвенный колит, микроскопический колит, коллагенозный колит, полипозный колит, некротизирующий энтероколит и трансмуральный колит и аутоиммунное воспалительное заболевание кишечника), воспаление кишечника, гангренозную пиодермию, узелковую эритему, первичный склерозирующий холангит, респираторный дистресс-синдром, включая респираторный дистресс-синдром взрослых или синдром острой дыхательной недостаточности (ARDS), менингит, воспаление всей или части сосудистой оболочки глаза, ирит, хориоидит, аутоиммунное гематологическое нарушение, реакция "трансплантат против хозяина", ангионевротический отек, такой как наследственный ангионевротический отек, повреждение черепных нервов как при менингите, герпес беременных, пемфигоид беременных, воспалительный зуд, аутоиммунное раннее прекращение овуляции, неожиданную потерю слуха вследствие аутоиммунного патологического состояния, опосредованные IgE заболевания, такие как анафилаксия и аллергический и атопический ринит, энцефалит, такой как энцефалит Расмуссена и лимбический энцефалит и/или энцефалит ствола головного мозга, увеит, такой как передний увеит, острый передний увеит, гранулематозный увеит, негранулематозный увеит, факоантигенный увеит, задний увеит или аутоиммунный увеит, гломерулонефрит (GN) с нефротическим синдромом и без него, такой как хронический или острый гломерулонефрит, такой как первичный GN, иммуноопосредованный GN, мембранный GN (мембранная нефропатия), идиопатический мембранный GN или идиопатическая мембранная нефропатия, мембрано- или мембранный пролиферативный GN (MPGN), включая тип I и тип II и быстро прогрессирующий GN (RPGN), пролиферативный нефрит, аутоиммунная полижелезистая эндокринная недостаточность, баланит, включая ограниченный плазмаклеточный баланит, баланопостит, центробежная кольцевидная эритема, пепельный дерматоз, мультиформная эритема, кольцевидная гранулема, блестящий лишай, склеротический атрофический лишай, простой хронический лишай, шиповидный лишай, плоский лишай, чешуйчатый ихтиозы, эпидермолитический гиперкератоз, предраковый кератоз, гангренозная пиодермия, аллергические состояния и ответы, пищевые аллергии, аллергии на лекарственные средства, аллергии на насекомых, редкие аллергические нарушения, такие как мастоцитоз, аллергическая реакция, экзема, включая аллергическую или атопическую экзему, астеатозную экзему, дисгидротическую экзему и пузырчатую ладонно-подошвенную экзему, астму, такую как бронхиальная астма и аутоиммунная астма, состояния, включающие инфильтрацию T-клеток и хронический воспалительный ответ, иммунные реакции против чужеродных антигенов, такие как группы крови A-B-О плода при беременности, хроническое легочное воспалительное заболевание, аутоиммунный миокардит, недостаточность адгезии лейкоцитов, волчанку, включая волчаночный нефрит, волчаночный энцефалит, педиатрическую волчанку, непочечную волчанку, экстраренальную волчанку, дисковидную волчанку и дисковидный волчаночный эритематоз, волчаночную алопецию, СКВ, такую как кожная СКВ или подострая кожная СКВ, неонатальный волчаночный синдром (NLE) и волчаночный диссеминированный эритематоз, юношеский (типа I) сахарный диабет, включая детский IDDM, сахарный диабет взрослых (диабет типа II), аутоиммунный диабет, идиопатический несахарный диабет, диабетическую ретинопатию, диабетическую нефропатию, диабетический колит, диабетическое нарушение крупных артерий, иммунный ответ, ассоциированный с острой или замедленной гиперчувствительностью, опосредованной цитокинами и T-лимфоцитами, туберкулез, саркоидоз, гранулематоз, включая лимфоматоидный гранулематоз, агранулоцитоз, васкулит (включая васкулит больших сосудов, такой как ревматическая полимиалгия и гигантоклеточный (Такаясу) артериит, васкулит средних сосудов, такой как синдром Кавасаки и узелковый полиартериит/узелковый периартериит, иммуноваскулит, васкулит ЦНС, кожный васкулит, васкулит вследствие гиперчувствительности, некротизирующий васкулит, такой как фибриноидный некротизирующий васкулит и системный некротизирующий васкулит, ANCA-негативный васкулит и ANCA-ассоциированный васкулит, такой как синдром Черджа-Стросс (CSS), гранулематоз Вегенера и микроскопический полиангиит), височный артериит, апластическую анемию, аутоиммунную апластическую анемию, положительную на тест Кумбса анемию, анемию Даймонда-Блэкфана, гемолитическую анемию или иммунную гемолитическую анемию, включая аутоиммунную гемолитическую анемию (AIHA), пернициозную анемию (anemia perniciosa), болезнь Аддисона, истинную эритроцитарную анемию или аплазию (PRCA), дефицит фактора VIII, гемофилию A, аутоиммунную нейтропению(и), цитопении, такие как панцитопения, лейкопения, заболевания, включающие диапедез лейкоцитов, воспалительные нарушения ЦНС, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, синдром полиорганного повреждения, такой как вторичные синдромы септицимии, травмы или кровоизлияния, опосредованные комплексами антиген-антитело заболевания, болезнь антител к базальной мембране клубочков, синдром антител к фосфолипидам, мотоневрит, аллергический неврит, болезнь/синдром Бехчета, синдром Кастлмена, синдром Гудпасчера, синдром Рейно, синдром Шегрена, синдром Стивенса-Джонсона, пемфигоид или пемфигус, такой как буллезный пемфигоид, рубцовый (слизистая оболочки) пемфигоид, кожный пемфигоид, обыкновенная пузырчатка, паранеопластический пемфигус, слоистый пемфигус, пемфигусный пемфигоид слизистой оболочки и пемфигусный эритематоз, приобретенный буллезный эпидермолиз, глазное воспаление, предпочтительно аллергическое глазное воспаление, такое как аллергический конъюнктивит, буллезное заболевание линейного IgA, аутоиммунно индуцированное воспаление конъюнктивы, аутоиммунные полиэндокринопатии, болезнь или синдром Рейтера, тепловое повреждение вследствие аутоиммунного состояния, предэклампсию, нарушение вследствие иммунных комплексов, такой как нефрит иммунных комплексов, опосредованный антителами нефрит, нейровоспалительные нарушения, полинейропатии, хроническую нейропатию, такую IgM полинейропатии или опосредованная IgM нейропатия, тромбоцитопению (например, как развивается у пациентов с инфарктом миокарда), включая тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (TTP), посттрансфузионную пурпуру (PTP), индуцированную гепарином тромбоцитопению и аутоиммунную или иммуноопосредованную тромбоцитопению, включая, например, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), включая хроническую или острую ITP, склерит, такой как идиопатический кератосклерит, эписклерит, аутоиммунное заболевание семенников и яичников, включая аутоиммунный орхит и оофорит, первичный гипотиреоз, гипопаратиреоз, аутоиммунные эндокринные заболевания, включая тиреоидит, такой как аутоиммунный тиреоидит, болезнь Хашимото, хронический тиреоидит (тиреоидит Хашимото), или подострый тиреоидит, аутоиммунную болезнь щитовидной железы, идиопатический гипотиреоз, болезнь Грейва, болезнь Грейва глаз (офтальмопатия или ассоциированная с щитовидной железой офтальмопатия), полигландулярные синдромы, такие как аутоиммунные полигландулярные синдромы, например, типа I (или полигландулярные эндокринопатические синдромы), паранеопластические синдромы, включая неврологические паранеопластические синдромы, такие как миастенический синдром Ламберта-Итона или синдром Ламберта-Итона, синдром застывшего человека или застывшего индивидуума, энцефаломиелит, такой как аллергический энцефаломиелит и экспериментальный аллергический энцефаломиелит (EAE), миастению gravis, такую как ассоциированную с тимомой миастению gravis, дегенерацию мозжечка, нейромиотонию, опсоклонус или опсоклонический миоклонический синдром (OMS) и сенсорную нейропатию, полифокальную моторную нейропатию, синдром Шихана, аутоиммунный гепатит, хронический гепатит, волчаночный гепатит, гигантоклеточный гепатит, хронический активный гепатит или аутоиммунный хронический активный гепатит, пневмонит, такой как лимфоидный интерстициальный пневмонит (LIP), облитерирующий бронхолит (не трансплантат) против NSIP, синдром Гийена-Барре, болезнь Бергера (IgA-нефропатия), идиопатическую IgA-нефропатию, дерматоз линейных IgA, острый фебрильный нейтрофильный дерматоз, подроговичный пустулезный дерматоз, транзиторный акантолитический дерматоз, цирроз, такой как первичный биллиарный цирроз и пневмоноцирроз, аутоиммунный синдром энтеропатии, глютеновую энтеропатию или целиакию, рефракторную спру, идиопатическую спру, криоглобулинемию, такую как смешанная криоглобулинемия, боковой амиотрофический склероз (ALS; болезнь Лоу-Герига), болезнь коронарных артерий, аутоиммунное заболевание ушей, такое как аутоиммунное заболевание внутреннего уха (AIED), аутоиммунную потерю слуха, полихондрит, такой как рефракторный или рецидивирующий полихондрит, легочный альвеолярный протеиноз, кератит, такой как синдром Когана/несифилитический интерстициальный кератит, паралич Белла, болезнь/синдром Свита, аутоиммунную розацеа, боль, связанную с опоясывающим лишаем, амилоидоз, незлокачественный лимфоцитоз, первичный лимфоцитоз, который включает B-клеточный лимфоцитоз (например, доброкачественную моноклональную гаммапатию и моноклональную гаммапатию неопределенной значимости, MGUS), периферическую нейропатию, паранеопластический синдром, каналопатии, такие как эпилепсия, мигрень, аритмия, мышечные нарушения, глухота, слепота, пароксизмальный паралич и каналопатии CNS, аутизм, воспалительная миопатия, фокальный или сегментарный или фокально-сегментарный гломерулосклероз (FSGS), эндокринную офтальмопатию, увеоретинит, хориоретинит, аутоиммунное гепатологическое нарушение, фибромиалгию, множественную эндокринную недостаточность, синдром Шмидта, адреналит, атрофию желудка, пресенильную деменцию, демиелинизирующие заболевания, такие как аутоиммунные демиелинизирующие заболевания и хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, синдром Дресслера, очаговую алопецию, полную алопецию, синдром CREST (кальциноз, феномен Рейнарда, эзофагальная дискинезия, склеродактилия и телангиэктазия), мужское и женское аутоиммунное бесплодие, например, вследствие антител к сперматозоидам, смешанное поражение соединительной ткани, болезнь Чагаса, ревматическую лихорадку, привычный выкидыш, легкое фермера, полиморфную эритему, посткардиотомический синдром, синдром Кушинга, легкое птицеводов, аллергический гранулематозный васкулит, мягкий лимфоцитный васкулит, синдром Альпорта, альвеолит, такой как аллергический альвеолит и фиброзирующий альвеолит, интерстициальное заболевание легких, трансфузионную реакцию, лепру, малярию, паразитарные заболевания, такие как лейшманиоз, кипаносомиоз, шистозомоз, аскаридоз, аспергиллез, синдром Сэмптера, синдром Каплана, лихорадка денге, эндокардит, эндомиокардиальный фиброз, диффузный интерстициальный легочный фиброз, интерстициальный легочный фиброз, фиброзный медиастинит, легочный фиброз, идиопатический легочный фиброз, кистозный фиброз, эндофтальмит, стойкую возвышающуюся эритему, эритробластоз плода, эозинофильный фациит, синдром Шульмана, синдром Фелти, флариаз, циклит, такой как хронический циклит, гетерохронный циклит, иридоциклит (острый или хронический) или циклит Фуха, пурпура Шенлейн-Геноха, инфекцию вирусом иммунодефицита человека (HIV), SCID, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), эховирусную инфекцию, сепсис (синдром системного воспалительного ответа (SIRS)), эндотоксикоз, панкреатит, тироксикоз, парвовирусную инфекцию, инфекцию вирусом краснухи, поствакционные синдромы, врожденную инфекцию краснухи, инфекцию вирусом Эпштейна-Барр, инфекционный паротит, синдром Эвана, аутоиммунное поражение гонад, хорея Сиденгама, постстрептококковый нефрит, облитерирующий тромбангиит, тиреотоксикоз, сухотку спинного мозга, хориоидит, гигантоклеточную полимиалгию, хронический гиперчувствительный пневмонит, конъюнктивит, такой как весенний катар, сухой кератоконъюнктивит и эпидемический кератоконъюнктивит, идиопатический почечный синдром, нефропатия с минимальными изменениями, мягкое семейное повреждение и повреждение вследствие ишемии-реперфузии, реперфузия трансплантированного органа, аутоиммунная реакция на сетчатку, воспаление суставов, бронхит, хроническая легочная непроходимость/непроходимость дыхательных путей, силикоз, афты, афтозный стоматит, артериосклеротические нарушения (церебральная сосудистая недостаточность), такие как артериосклеротическая энцефалопатия и артериосклеротическая ретинопатия, аспермиогенез, аутоиммунный гемолиз, болезнь Бека, криоглобулинемию, контрактуру Дюпюитрена, факоанафилактическую эндофтальмию, аллергический энтерит, лепрозную узелковую эритему, идиопатический лицевой паралич, синдром хронической усталости, ревматическую лихорадку, болезнь Хаммена-Рича, сенсоневральную потерю слуха, пароксизмальную гемоглобинурию, гипогонадизм, региональный илеит, лейкопению, инфекционный мононуклеоз, поперечный миелит, первичную идиопатическую микседему, нефроз, симпатический офтальмит, неонатальный офтальмит, оптический неврит, гранулематозный орхит, панкреатит, острый множественный радикулит, гангренозную пиодермию, тиреоидит Квервайна, приобретенную атрофию селезенки, незлокачественную тимому, лимфофолликулярный тимит, витилиго, синдром токсического шока, пищевое отравление, состояния, включающие инфильтрацию T-клеток, недостаточность адгезии лейкоцитов, иммунный ответ, ассоциированный с острой или замедленной гиперчувствительностью, опосредованной цитокинами и T-лимфоцитами, заболевания, включающие лейкоцитарный диапедез, синдром полиорганной недостаточности, заболевания, опосредованные комплексами антиген-антитело, заболевание, обусловленное антителами к базальной мембране клубочков, аутоиммунные полиэндокринопатии, оофорит, первичную микседему, аутоиммунный атрофический гастрит, ревматические заболевания, смешанное поражение соединительной ткани, нефротический синдром, инсулит, полиэндокринная недостаточность, аутоиммунные полигландулярные синдромы, включая полигландулярный синдром типа I, идиопатический гипопаратиреоз взрослых (AOIH), кардиомиопатию, такую как распространенную кардиомиопатию, приобретенный буллезный эпидермолиз (EBA), гемохроматоз, миокардит, нефротический синдром, первичный склерозирующий холангит, гнойный или негнойный синусит, острый или хронический синусит, этмоидный, фронтальный, максиллярный или сфеноидный синусит, аллергический синусит, связанное с эозинофилами нарушение, такое как эозинофилия, легочная инфильтрирующая эозинофилия, синдром эозинофилии-миалгии, синдром Лефлера, хроническая эозинофильная пневмония, тропическая легочная эозинофилия, бронхопневмонический аспергиллез, аспергиллему или гранулемы, содержащие эозинофилы, анафилаксию, спондилоартропатии, серонегативные спондилоартриты, полиэндокринное аутоиммунное заболевание, склерозирующий холангит, склерозный, эписклерозный, хронический кожно-слизистый кандидоз, синдром Брутона, преходящую гипогаммаглобулинемию детского возраста, синдром Вискотта-Олдрича, синдром атаксии-телеангиэктазии, ангиэктазию, аутоиммунные нарушения, ассоциированные с коллагеновым заболеванием, ревматизм, такой как хронический артроревматизм, лимфаденит, ответ снижением кровяного давления, сосудистую дисфункцию, повреждение тканей, кардиососудистую ишемию, гипералгезию, почечную ишемию, ишемию головного мозга и заболевание, сопровождающее васкуляризацию, нарушения в виде аллергической гиперчувствительности, гломерулонефриты, реперфузионное повреждение, ишемическое реперфузионное повреждение, реперфузионное повреждение миокардиальной или других тканей, лимфоматозный трахеобронхит, воспалительные дерматозы, дерматозы с острыми воспалительными компонентами, полиорганную недостаточность, буллезные заболевания, почечный кортикальный некроз, острый гнойный менингит или другие воспалительные нарушения центральной нервной системы, окулярные и орбитальные воспалительные нарушения, ассоциированные с трансфузией гранулоцитов синдромы, индуцированную цитокинами токсичность, нарколепсию, острое тяжелое воспаление, хроническое не поддающееся лечению воспаление, пиелит, эндартериальную гиперплазию, пептическую язву, вальвулит и эндометриоз. Такие заболевания рассматривают в настоящем документе как подлежащие лечению посредством введения антител, которые связываются с поверхностным маркером B-клеток, таким как CD22, а лечение включает введение неконъюгированного ("свободного") антитела или антитела, конъюгированного с цитотоксическим средством, как описано в настоящем документе. Такие заболевания также рассматривают в настоящем документе как подлежащие лечению посредством комбинированного лечения, включающего антитело к CD22 или конъюгат антитела к CD22-лекарственное средство по изобретению в сочетании с другим антителом или конъюгатом антитело-лекарственное средство, другим цитотоксическим средством, радиацией или другим лекарственным средством, вводимым одновременно или последовательно.

Как применяют в настоящем документе, "лечение" (и варианты, такие как "лечить" или "подвергать лечению") относится к клиническому вмешательству с целью изменения естественного течения заболевания у индивидуума или изменения клетки, подвергаемой лечению, и его можно проводить или для профилактики или в течение клинического патологического процесса. Желательные эффекты лечения включают предотвращение возникновения или рецидива заболевания, облегчения симптомов, уменьшение любых прямых или непрямых патологических последствий заболевания, предотвращение метастазирования, снижение скорости прогрессирования заболевания, облегчение или временное ослабление состояния при заболевании и ремиссию или улучшенный прогноз. В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению используют для задержки развития заболевания или нарушения или для замедления прогрессирования заболевания или нарушения.

"Индивидуум" представляет собой позвоночное. В определенных вариантах осуществления позвоночное представляет собой млекопитающее. Млекопитающие включают в качестве неограничивающих примеров сельскохозяйственных животных (таких как коровы), спортивных животных, домашних животных (таких как коровы, собаки и лошади), приматов, мышей и крыс. В определенных вариантах осуществления млекопитающее представляет собой человека.

"Эффективное количество" относится к количеству, эффективному при дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического или профилактического результата.

"Терапевтически эффективное количество" вещества/молекулы по изобретению может варьировать в зависимости от таких факторов, как стадия заболевания, возраст, пол и масса индивидуума, и способности вещества/молекулы вызывать желаемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество включает количество, при котором любые токсические или вредные эффекты вещества/молекулы перевешиваются терапевтически положительным воздействием. "Профилактически эффективное количество" относится к количеству, эффективному при дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого профилактического результата. Как правило, но необязательно, так как профилактическую дозу используют у субъектов до или на ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество будет меньшим, чем терапевтически эффективное количество.

Как применяют в настоящем документе, термин "цитотоксическое средство" относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает функцию клеток и/или вызывает гибель или разрушение клеток. Термин предназначен для включения радиоактивных изотопов (например, At²¹¹, I¹³¹ , I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸ , Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb ²¹² и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтических средств (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин C, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркаляторы, ферменты и их фрагменты, такие как нуклеазы, антибиотики и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или варианты, токсины, ингибирующие рост средства, молекулы лекарственных средств и различные противоопухолевые или противораковые средства, описанные ниже. Ниже описаны другие цитотоксические средства. Противоопухолевое средство вызывает разрушение опухолевых клеток.

"Токсин" представляет собой любое вещество, способное оказывать разрушительное действие на рост или пролиферацию клетки.

"Химиотерапевтическое средство" представляет собой химическое соединение, пригодное для лечения злокачественной опухоли. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклофосфамид CYTOXAN® (цитоксан®); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилолмеламин; ацетогенины (особенно буллатацин и буллатацинон); дельта-9-тетрагидроканнабинол (дронабинол, MARINOL® (маринол®)); бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновую кислоту; камптотецин (включая синтетический аналог топотекан (HYCAMTIN® (гикамтин®)), CPT-11 (иринотекан, CAMPTOCAR® (камптосар®)), ацетилкамптотецин, скополектин и 9-аминокамптотецин); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); подофиллотоксин; подофиллиновую кислоту; тенипозид; криптофицины (особенно криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги, KW-2189 и CB1-TM1); элеутеробин; панкретистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, гидрохлорид оксида мехлоретамина, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как ендииновые антибиотики (например, калихимицин, особенно калихимицин гамма1I и калихимицин омегаI1 (см., например, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин A; эсперамицин; а также неокарциностатиновый хромофор и родственные хромопротеиновые ендииновые антибиотические хромофоры), аклациномицины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин ADRIAMYCIN® (включая морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин C, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, порфиромицин, пиромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, пропионат дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадреналиновые средства, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; компенсаторы фолиевой кислоты, такие как фролиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновую кислоту; енилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бизантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; эльфорнитин; ацетат эллиптиния; эпофилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидамин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и анзамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2"-трихлортриэтиламин; трихотецены (особенно токсин T-2, верракурин A, роридин A и ангуидин); уретан; виндезин (ELDISINE®, FILDESIN®); дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ara-C"); тиотепа; таксоиды, например, паклитаксел TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE без кремофора, сконструированный с альбумином наночастичный препарат паклитаксела (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) и доцетаксел TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлоранбуцил; гемцитабин (GEMZAR®); 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин (VELBAN®); платину; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин (ONCOVIN®); оксалиплатин; лейкововин; винорелбин (NAVELBINE®); новантрон; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин (XELODA®); фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанного выше; а также сочетания двух или более из указанных выше, такие как CHOP, сокращение для комбинированной терапии циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизолоном, и FOLFOX, сокращение для схемы лечения оксалиплатином (ELOXATIN ) в сочетании с 5-FU и лейкововином.

Также в это определение включены противогормональные средства, которые действуют для регуляции, снижения, блокирования или ингибирования действия гормонов, которые могут стимулировать рост злокачественной опухоли и их часто назначают в форме системного или общего лечения. Они могут представлять собой сами гормоны. Примеры включают антиэстрогены и селективные модуляторы эстрогеновых рецепторов (SERM), включая, например, тамоксифен (включая тамоксифен NOLVADEX®), ралоксифен EVISTA®, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон, и торемифен FARESTON®; противопрогестероновые средства; негативные регуляторы эстрогеновых рецепторов (ERD); средства, функционирующие с подавлением или выключением яичников, например, агонисты релизинг-фактор лютеинизирующего гормона (LHRH), такие как ацетат лейпролида LUPRON® и ELIGARD®, ацетат гозерелина, ацетат бузерилина и триптерелин; другие антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид и бикалутамид; и ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу, регулирующую продукцию эстрогенов в надпочечниках, например, такие как 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, ацетат мегестрола MEGASE®, экземестан AROMASIN®, форместанин, фадрозол, ворозол RIVISOR®, летрозол FEMARA® и анастрозол ARIMIDEX®. Кроме того, такое определение химиотерапевтических средств включает бисфосфонаты, такие как клодронат (например, BONEFOS® или OSTAC®), этидронат DIDROCAL®, NE-58095, золедроновая кислота/золедронат ZOMETA®, алендронат FOSAMAX®, памидронат AREDIA®, тилудронат SKELID® или ризедронат ACTONEL®; а также троксацитабин (1,3-диоксолановый аналог нуклеозида цитозина); антисмысловые олигонуклеотиды, особенно такие, которые ингибируют экспрессию генов в пути передачи сигнала, вовлеченном в аберантной клеточной пролиферации, например, такие как PKC-альфа, Raf, H-Ras и рецептор эпидермального фактора роста (EGF-R); вакцины, такие как вакцина THERATOPE® и генотерапевтические вакцины, например, вакцина ALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN® и вакцина VAXID®; ингибитор топоизомеразы 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; дитозилат лапатиниба (низкомолекулярный ингибитор двух тирозинкиназ ErbB-2 и EGFR, также известный как GW572016); и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанного выше.

"Ингибирующее рост средство" при использовании в данном документе относится к соединению или композиции, которые ингибируют рост клетки (такой как клетка, экспрессирующая CD22) in vitro или in vivo . Таким образом, ингибирующее рост средство может представлять собой средство, которое значительно снижает процент клеток (таких как клетки, экспрессирующие CD22) в S-фазе. Примеры ингибирующих рост средств включают средства, которые блокируют прохождение клеточного цикла (в месте, отличном от S-фазы), такие как средства, индуцирующие арест в G1 и арест в фазе M. Классические блокаторы M-фазы включают барвинок (винкристин и винбластин), таксаны и ингибиторы топоизомеразы II, такие как доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Те же средства, которые осуществляют арест в G1, также дают побочным результатом арест в S-фазе, например, алкилирующие ДНК средства, такие как тамоксифен, преднизон, дакарбазин, мехлоретамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил и ara-C. Дополнительную информацию можно найти в The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs", Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), особенно на стр.13. Таксаны (паклитаксел и доцетаксел) представляют собой противораковые лекарственные средства, полученные из тисового дерева. Доцетаксел (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), полученный из европейского тиса, представляет собой полусинтетический аналог паклитаксела (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Паклитаксел и доцетаксел стимулируют сборку микротрубочек из димеров тубулина и стабилизируют микротрубочки, предотвращая деполимеризацию, что приводит к ингибированию митоза в клетках.

Термин "внутриклеточный метаболит" относится к соединению, являющемуся результатом метаболического процесса или метаболической реакции внутри клетки из конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC). Метаболический процесс или метаболическая реакция могут представлять собой ферментативный процесс, такой как протеолитическое отщепление пептидного линкера ADC или гидролиз функциональной группы, такой как гидразон, сложный эфир или амид. Внутриклеточные метаболиты включают в качестве неограничивающих примеров антитела и свободное лекарственное средство, которое претерпевает внутриклеточное расщепление после вхождения, диффузии, захвата или транспорта в клетку.

Термины "внутриклеточно отщепленный" и "внутриклеточное отщепление" относятся к метаболическому процессу или реакции внутри клетки с конъюгатом антитело-лекарственное средство (ADC), посредством которого разрушается ковалентное соединение, т.е. линкер, между молекулой лекарственного средства (D) и антителом (Ab), что приводит к отделению свободного лекарственного средства от антитела внутри клетки. Таким образом, отщепленные группы ADC являются внутриклеточными метаболитами.

Термин "биодоступность" относится к системной доступности (т.е. уровни в крови/плазме) данного количества лекарственного средства, вводимого пациенту. Биодоступность представляет собой безусловный термин, который означает измерение времени (скорости) и общего количества (величины) лекарственного средства, которое достигает общего кровотока из введенной лекарственной формы.

Термин "цитотоксическая активность" относится к уничтожающему клетки, цитостатическому или ингибирующему рост действию конъюгата антитело-лекарственное средство или внутриклеточного метаболита конъюгата антитело-лекарственное средство. Цитотоксическую активность можно выразить как значение IC₅₀, которое представляет собой концентрацию (молярную или массовую) на единицу объема, при которой выживает половина клеток.

"Алкил" представляет собой C₁-C₁₈ -углеводород, содержащий нормальные, вторичные, третичные или циклические атомы углерода. Примеры представляют собой метил (Me, -CH₃), этил (Et, -CH₂CH₃ ), 1-пропил (n-Pr, н-пропил, -CH₂CH₂CH ₃), 2-пропил (i-Pr, изопропил, -CH(CH₃) ₂), 1-бутил (n-Bu, н-бутил, -CH₂CH₂ CH₂CH₃), 2-метил-1-пропил (i-Bu, изобутил, -CH₂CH(CH₃)₂), 2-бутил (s-Bu, втор-бутил, -CH(CH₃)CH₂CH₃), 2-метил-2-пропил (t-Bu, трет-бутил, -C(CH₃) ₃), 1-пентил (н-пентил, -CH₂CH₂CH ₂CH₂CH₃), 2-пентил (-CH(CH₃ )CH₂CH₂CH₃), 3-пентил (-CH(CH ₂CH₃)₂), 2-метил-2-бутил (-C(CH ₃)₂CH₂CH₃), 3-метил-2-бутил (-CH(CH₃)CH(CH₃)₂), 3-метил-1-бутил (-CH₂CH₂CH(CH₃)₂), 2-метил-1-бутил (-CH₂CH(CH₃)CH₂ CH₃), 1-гексил (-CH₂CH₂CH ₂CH₂CH₂CH₃), 2-гексил (-CH(CH₃)CH₂CH₂CH₂ CH₃), 3-гексил (-CH(CH₂CH₃)(CH ₂CH₂CH₃)), 2-метил-2-пентил (-C(CH ₃)₂CH₂CH₂CH₃ ), 3-метил-2-пентил (-CH(CH₃)CH(CH₃)CH ₂CH₃), 4-метил-2-пентил (-CH(CH₃)CH ₂CH(CH₃)₂), 3-метил-3-пентил (-C(CH ₃)(CH₂CH₃)₂), 2-метил-3-пентил (-CH(CH₂CH₃)CH(CH₃)₂ ), 2,3-диметил-2-бутил (-C(CH₃)₂CH(CH ₃)₂), 3,3-диметил-2-бутил (-CH(CH₃ )C(CH₃)₃.

Как применяют в настоящем документе, термин "C₁-C₈ -алкил" относится к насыщенному или ненасыщенному углеводороду с прямолинейной или разветвленной цепью с количеством атомов углерода от 1 до 8. Репрезентативные "C₁-C ₈-алкильные" группы включают в качестве неограничивающих примеров -метил, -этил, -н-пропил, -н-бутил, -н-пентил, -н-гексил, -н-гептил, -н-октил, -н-нонил и -н-децил; тогда как разветвленные C₁-C₈-алкилы включают в качестве неограничивающих примеров -изопропил, -втор-бутил, -изобутил, -трет-бутил, -изопентил, 2-метилбутил, ненасыщенные C₁-C₈ -алкилы включают в качестве неограничивающих примеров -винил, -аллил, -1-бутенил, -2-бутенил, -изобутиленил, -1-пентенил, -2-пентенил, -3-метил-1-бутенил, -2-метил-2-бутенил, -2,3-диметил-2-бутенил, 1-гексил, 2-гексил, 3-гексил, -ацетиленил, -пропинил, -1-бутинил, -2-бутинил, -1-пентинил, -2-пентинил, -3-метил-1-бутинил, метил, этил, пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет -бутил, н-пентил, изопентил, неопентил, н-гексил, изогексил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 2,2-диметилбутил, 2,3-диметилбутил, 2,2-диметилпентил, 2,3-диметилпентил, 3,3-диметилпентил, 2,3,4-триметилпентил, 3-метилгексил, 2,2-диметилгексил, 2,4-диметилгексил, 2,5-диметилгексил, 3,5-диметилгексил, 2,4-диметилпентил, 2-метилгептил, 3-метилгептил, н-гептил, изогептил, н-октил и изооктил. C₁-C ₈-алкильная группа может быть незамещенной или замещенной одной или несколькими группами, включающими в качестве неограничивающих примеров -C₁-C₈-алкил, -O-(C₁ -C₈-алкил), -арил, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH₂, -C(O)NHR', -C(O)N(R')₂ -NHC(O)R', -SO₃R', -S(O)₂R', -S(O)R', -OH, -галоген, -N₃, -NH₂, -NH(R'), -N(R')₂ и -CN; где каждый R' независимо выбран из H, -C₁-C₈-алкила и арила.

"Алкенил" представляет собой C₂-C₁₈-углеводород, содержащий нормальные, вторичные, третичные или циклические атомы углерода, по меньшей мере, с одним участком ненасыщенности, т.е. двойной связью sp ² углерод-углерод. Примеры включают в качестве неограничивающих примеров этилен или винил (-CH=CH₂), аллил (-CH ₂CH=CH₂), циклопентенил (-C₅H ₇) и 5-гексенил (-CH₂CH₂CH₂ CH₂CH=CH₂).

"Алкинил" представляет собой C₂-C₁₈-углеводород, содержащий нормальные, вторичные, третичные или циклические атомы углерода, по меньшей мере, с одним участком ненасыщенности, т.е. тройной связью sp углерод-углерод. Примеры включают в качестве неограничивающих примеров ацетилен (-C=CH) и пропаргил (-CH ₂C=CH).

"Алкилен" относится к насыщенному, разветвленному или прямолинейному или циклическому углеводородному радикалу из 1-18 атомов углерода и обладающему двумя моновалентными радикальными центрами, образующимися при удалении двух атомов водорода от одного и того же или двух различных атомов углерода в исходном алкане. Типичные алкиленовые радикалы включают в качестве неограничивающих примеров метилен (-CH ₂-), 1,2-этил (-CH₂CH₂-), 1,3-пропил (-CH₂CH₂CH₂-), 1,4-бутил (-CH ₂CH₂CH₂CH₂-) и т.п.

"C₁-C₁₀-алкилен" представляет собой прямолинейную насыщенную углеводородную группу формулы -(CH₂)_1-10-. Примеры C₁ -C₁₀-алкилена включают метилен, этилен, пропилен, бутилен, пентилен, гексилен, гептилен, октилен, нонилен и декален.

"Алкенилен" относится к ненасыщенному разветвленному или неразветвленному углеводородному радикалу из 2-18 атомов углерода и обладающему двумя моновалентными радикальными центрами, образующимися при удалении двух атомов водорода от одного и того же или двух различных атомов углерода в исходном алкене. Типичные алкениленовые радикалы включают в качестве неограничивающих примеров 1,2-этилен (-CH=CH-).

"Алкинилен" относится к ненасыщенному, разветвленному или неразветвленному углеводородному радикалу из 2-18 атомов углерода и обладающему двумя моновалентными радикальными центрами, образующимися при удалении двух атомов водорода от одного и того же или двух различных атомов углерода в исходном алкине. Типичные алкиниленовые радикалы включают в качестве неограничивающих примеров ацетилен (-С C-), пропаргил (-CH₂C C-) и 4-пентинил (-CH₂CH₂CH₂ C C-).

"Арил" относится к карбоциклической ароматической группе. Примеры арильных групп включают в качестве неограничивающих примеров фенил, нафтил и антраценил. Карбоциклическая ароматическая группа или гетероциклическая ароматическая группа может быть незамещенной или замещенной одной или несколькими группами, включающими в качестве неограничивающих примеров -C ₁-C₈-алкил, -O-(C₁-C₈-алкил), -арил, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH₂ , -C(O)NHR', -C(O)N(R')₂-NHC(O)R', -S(O) ₂R', -S(O)R', -OH, -галоген, -N₃, -NH ₂, -NH(R'), -N(R')₂ и -CN; где каждый R' независимо выбран из H, -C₁-C₈-алкила и арила.

"Арилен" представляет собой арильную группу, которая обладает двумя ковалентными связями и может находиться в орто-, мета- или пара-конфигурациях, как показано на следующих структурах:

в которых фенильная группа может быть незамещенной или замещенной до 4 группами, включая в качестве неограничивающего примера -C₁-C₈-алкил, -O-(C₁-C₈-алкил), -арил, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH₂, -C(O)NHR', -C(O)N(R') ₂-NHC(O)R', -S(O)₂R', -S(O)R', -OH, -галоген, -N₃, -NH₂, -NH(R'), -N(R') ₂ и -CN; где каждый R' независимо выбран из H, -C ₁-C₈-алкила и арила.

"Арилалкил" относится к ациклическому алкильному радикалу, в котором один из атомов водорода, связанных с атомом углерода, как правило, с концевым или sp³-атомом углерода, замещен арильным радикалом. Типичные арилалкильные группы включают в качестве неограничивающих примеров бензил, 2-фенилэтан-1-ил, 2-фенилэтен-1-ил, нафтилметил, 2-нафтилэтан-1-ил, 2-нафтилэтен-1-ил, нафтобензил, 2-нафтофенилэтан-1-ил и т.п. Арилалкильная группа содержит от 6 до 20 атомов углерода, например, алкильная группа, включая алканильную, алкенильную или алкинильную группы, арилалкильная группа состоит из 1-6 атомов углерода, а арильная группа состоит из 5-14 атомов углерода.

"Гетероарилалкил" относится к ациклическому алкильному радикалу, в котором один из атомов водорода, связанных с атомом углерода, как правило, с концевым или sp³-атомом углерода, замещен гетероарильным радикалом. Типичные гетероарилалкильные группы включают в качестве неограничивающих примеров 2-бензимидазолилметил, 2-фурилэтил и т.п. Гетероарилалкильная группа содержит от 6 до 20 атомов углерода, например, алкильная группа, включая алканильную, алкенильную или алкинильную группы, гетероарилалкильная группа состоит из 1-6 атомов углерода, а гетероарильная группа состоит из 5-14 атомов углерода и из 1-3 гетероатомов, выбранных из N, O, P и S. Гетероарильная группа гетероарилалкильной группы может представлять собой моноцикл с количеством кольцевых членов от 3 до 7 (от 2 до 6 атомов углерода) или бицикл с количеством кольцевых членов от 7 до 10 (от 4 до 9 атомов углерода и от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из N, O, P и S), например, система бицикло [4,5], [5,5], [5,6] или [6,6].

"Замещенный алкил", "замещенный арил" и "замещенный арилалкил" означают алкил, арил и арилалкил, соответственно, в которых один или несколько атомов водорода, каждый независимо, замещены заместителем. Типичные заместители включают в качестве неограничивающих примеров -X, -R, -O^-, -OR, -SR, -S^-, -NR₂ , -NR₃, =NR, -CX₃, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO₂, =N₂, -N₃, NC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NR₂, -SO₃ ^-, -SO₃H, -S(=O)₂R, -OS(=O) ₂OR, -S(=O)₂NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)₂ , -P(=O)(OR)₂, -PO₃ ^-, -PO₃H₂, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -CO₂R, -CO₂ ^-, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR ₂, -C(=S)NR₂, -C(=NR)NR₂, где каждый из X независимо представляет собой галоген: F, Cl, Br или I; а каждый R независимо представляет собой -H, C₂-C ₁₈-алкил, C₆-C₂₀-арил, C₃ -C₁₄-гетероцикл, защитная группа или молекула пролекарственного средства. Алкиленовая, алкениленовая и алкиниленовая группы, как описано выше, также могут быть замещены подобным образом.

"Гетероарил" и "гетероцикл" относятся к циклической системе, в которой один или несколько кольцевых атомов являются гетероатомами, например, азотом, кислородом и серой. Гетероциклический радикал содержит от 1 до 20 атомов углерода и от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из N, O, P и S. Гетероцикл может представлять собой моноцикл с количеством кольцевых членов от 3 до 7 (от 2 до 6 атомов углерода и от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из N, O, P и S) или бицикл с количеством кольцевых членов от 7 до 10 (от 4 до 9 атомов углерода и от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из N, O, P и S), например, система бицикло [4,5], [5,5], [5,6] или [6,6].

Гетероциклы описаны в Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968), конкретно в главах 1, 3, 4, 6, 7 и 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, с 1950 до настоящего времени), в конкретных томах 13, 14, 16, 19 и 28; и J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566.

Примеры гетероциклов включают в качестве примера, а не ограничения, пиридил, дигидропиридил, тетрагидропиридил (пиперидил), тиазолил, тетрагидротиофенил, окисленный серой тетрагидротиофенил, пиримидинил, фуранил, тиенил, пирролил, пиразолил, имидазолил, тетразолил, бензофуранил, тианафталинил, индолил, индоленил, хинолинил, изохинолинил, бензимидазолил, пиперидинил, 4-пиперидонил, пирролидинил, 2-пирролидонил, пирролинил, тетрагидрофуранил, бис-тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, бис-тетрагидропиранил, тетрагидрохинолинил, тетрагидроизохинолинил, декагидрохинолинил, октагидроизохинолинил, азоцинил, триазинил, 6H-1,2,5-тиадизинил, 2H,6H-1,5,2-дитиазинил, тиенил, тиантренил, пиранил, изобензофуранил, хроменил, ксантенил, феноксатинил, 2H-пирролил, изотиазолил, изоксазолил, пиразинил, пиридазинил, индолизинил, изоиндолил, 3H-индолил, 1H-индазолил, пуринил, 4H-хинолизинил, фталазинил, нафтиридинил, хиноксалинил, хиназолинил, циннолинил, птеридинил, 4aH-карбазолил, карбазолил, -карболинил, фенантридинил, акридинил, пиримидинил, фенантролинил, феназинил, фенотиазинил, фуразанил, феноксазинил, изохроманил, хроманил, имидазолидинил, имидазолинил, пиразолидинил, пиразолинил, пиперазинил, индолинил, изоиндолинил, хинуклидинил, морфолинил, оксазолидинил, бензотриазолил, бензизоксазолил, охиндолил, бензоксазолинил и изатиноил.

В качестве примера, а не ограничения, связанные по углероду гетероциклы связаны в положении 2, 3, 4, 5 или 6 пиридина, положении 3, 4, 5 или 6 пиридазина, положении 2, 4, 5 или 6 пиримидина, положении 2, 3, 5 или 6 пиразина, положении 2, 3, 4 или 5 фурана, тетрагидрофурана, тиофурана, тиофена, пиррола или тетрагидропиррола, положении 2, 4 или 5 оксазола, имидазола или тиазола, положении 3, 4 или 5 изоксазола, пиразола или изотиазола, положении 2 или 3 азиридина, положении 2, 3 или 4 азетидина, положении 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 хинолина или положении 1, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 изохинолина. Даже более типично, связанные по углероду гетероциклы включают 2-пиридил, 3-пиридил, 4-пиридил, 5-пиридил, 6-пиридил, 3-пиридазинил, 4-пиридазинил, 5-пиридазинил, 6-пиридазинил, 2-пиримидинил, 4-пиримидинил, 5-пиримидинил, 6-пиримидинил, 2-пиразинил, 3-пиразинил, 5-пиразинил, 6-пиразинил, 2-тиазолил, 4-тиазолил или 5-тиазолил.

В качестве примера, а не ограничения, связанные по азоту гетероциклы связаны в положении 1 азиридина, азетидина, пиррола, пирролидина, 2-пирролина, 3-пирролина, имидазола, имидазолидина, 2-имидазолина, 3-имидазолина, пиразола, пиразолина, 2-пиразолина, 3-пиразолина, пиперидина, пиперазина, индола, индолина, 1H-индазола, положении 2 изоиндола или изоиндолина, положении 4 морфолина и положении 9 карбазола или -карболина. Даже более типично, связанные по азоту гетероциклы включают 1-азиридил, 1-азетедил, 1-пирролил, 1-имидазолил, 1-пиразолил и 1-пиперидинил.

"C₃-C₈ -гетероцикл" относится к ароматическому или неароматическому C₃-C₈ карбоциклу, в котором от одного до четырех циклических атомов углерода независимо замещены гетероатомом из группы, состоящей из O, S и N. Репрезентативные примеры C ₃-C₈-гетероцикла включают в качестве неограничивающих примеров бензофуранил, бензотиофен, индолил, бензопиразолил, кумаринил, изохинолинил, пирролил, тиофенил, фуранил, тиазолил, имидазолил, пиразолил, триазолил, хинолинил, пиримидинил, пиридинил, пиридонил, пиразинил, пиридазинил, изотиазолил, изоксазолил и тетразолил. C₃-C₈-гетероцикл может быть незамещенным или замещенным группами в количестве до семи, включая в качестве неограничивающих примеров, -C₁-C₈ -алкил, -O-(C₁-C₈-алкил), -арил, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH₂, -C(O)NHR', -C(O)N(R')₂ -NHC(O)R', -S(O)₂R', -S(O)R', -OH, -галоген, -N₃, -NH₂, -NH(R'), -N(R')₂ и -CN; где каждый R' независимо выбран из H, -C₁-C₈-алкила и арила.

"C₃-C₈-гетероцикло" относится к C₃-C₈-гетероциклической группе, определенной выше, где один из атомов водорода гетероциклической группы замещен связью. C₃-C₈-гетероцикло может быть незамещенной или замещенной группами в количестве до шести, включая в качестве неограничивающих примеров, -C ₁-C₈-алкил, -O-(C₁-C₈-алкил), -арил, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH₂ , -C(O)NHR', -C(O)N(R')₂ -NHC(O)R', -S(O) ₂R', -S(O)R', -OH, -галоген, -N₃, -NH ₂, -NH(R'), -N(R')₂ и -CN; где каждый R' независимо выбран из H, -C₁-C₈-алкила и арила.

"Карбоцикл" означает насыщенную или ненасыщенную циклическую систему с количеством атомов углерода от 3 до 7 в виде моноцикла или с количеством атомов углерода от 7 до 12 в виде бицикла. Моноциклические карбоциклы содержат от 3 до 6 циклических атомов, даже более типично - 5 или 6 циклических атомов. Бициклические карбоциклы содержат от 7 до 12 циклических атомов, например, расположенных в виде системы бицикло [4,5], [5,5], [5,6] или [6,6], или 9 или 10 циклических атомов, расположенных в виде системы бицикло [5,6] или [6,6]. Примеры моноциклических углеродных циклических систем включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, 1-циклопент-1-енил, l-циклопент-2-енил, 1-циклопент-3-енил, циклогексил, 1-циклогекс-1-енил, 1-циклогекс-2-енил, 1-циклогекс-3-енил, циклогептил и циклооктил.

"C₃ -C₈-карбоцикл" представляет собой 3-, 4-, 5-, 6-, 7- или 8-членную насыщенную или ненасыщенную неароматическую карбоциклическую кольцевую систему. Репрезентативные C₃ -C₈-карбоциклы включают в качестве неограничивающих примеров -циклопропил, -циклобутил, -циклопентил, -циклопентадиенил, -циклогексил, -циклогексенил, -1,3-циклогексадиенил, -1,4-циклогексадиенил, -циклогептил, -1,3-циклогептадиенил, -1,3,5-циклогептатриенил, -циклооктил и -циклооктадиенил. Группа C₃-C₈ -карбоцикла может быть незамещенной или замещенной одной или несколькими группами, включающими в качестве неограничивающих примеров -C₁-C₈-алкил, -O-(C₁ -C₈-алкил), -арил, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH₂, -C(O)NHR', -C(O)N(R')₂ -NHC(O)R', -S(O)₂R', -S(O)R', -OH, -галоген, -N₃, -NH₂, -NH(R'), -N(R') ₂ и -CN; где каждый R' независимо выбран из H, -C ₁-C₈-алкила и арила.

"C ₃-C₈-карбоцикло" относится к группе C ₃-C₈-карбоцикла определенной выше, где один из атомов водорода группы карбоцикла замещен связью.

"Линкер" относится к химической группе, содержащей ковалентную связь или цепь атомов, которые ковалентно присоединяют антитело к молекуле лекарственного средства. В различных вариантах осуществления линкеры включают двухвалентный радикал, такой как алкилдиил, арилдиил, гетероарилдиил, группы, такие как -(CR ₂)_nO(CR₂)_n-, повторяющиеся единицы алкилокси (например, полиэтиленокси, PEG, полиметиленокси) и алкиламино (например, полиэтиленамино, Jeffamine ); и сложные эфиры и амиды двухосновных кислот, включая сукцинат, сукцинамид, дигликолат, малонат и капроамид.

Термин "хиральный" относится к молекулам, которые обладают свойством несовместимости со своим зеркальным отображением, тогда как термин "ахиральный" относится к молекулам, которые являются совместимыми со своим зеркальным отображением.

Термин "стереоизомеры" относится к соединениям, которые обладают одинаковым химическим составом, но отличаются по расположению атомов или групп в пространстве.

"Диастереомер" относится к стереоизомеру с двумя или более центрами хиральности и молекулы которого не являются зеркальными отражениями друг друга. Диастереомеры обладают различными физическими свойствами, например температурой плавления, температурой кипения, спектральными свойствами и реактивностями. Смеси диастереомеров можно разделять аналитическими способами с высоким разрешением, такими как электрофорез и хроматография.

"Энантиомеры" относятся к стереоизомерам соединений, которые являются неналагающимися зеркальными изображениями друг друга.

Стереохимические определения и соглашения, используемые в настоящем документе, в основном согласуются с S.P.Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; и Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York. Многие органические соединения существуют в оптически активных формах, т.е. они обладают способностью вращать плоскость плоскополяризованного света. При описании оптически активного соединения для обозначения абсолютной конфигурации молекулы рядом с ее хиральным центром(ами) используют префиксы D и L или R и S. Префиксы d и l или (+) и (-) используют для обозначения знака вращения плоскополяризованного света соединением, где (-) или l означает, что соединение является левовращающим. Соединение с префиксом (+) или d является правовращающим. Для данной химической структуры эти стереоизомеры являются идентичными за исключением того, что они являются зеркальными отображениями друг друга. Конкретный стереоизомер также можно обозначить как энантиомер, а смесь таких изомеров часто называют энантиомерной смесью. Смесь энантиомеров 50:50 обозначают как рацемическую смесь или рацемат, который может образовываться, когда при химической реакции или процессе нет стереоселективности или стереоспецифичности. Термины "рацемическая смесь" и "рацемат" относятся к эквимолярной смеси двух энантиомерных молекул, лишенной оптической активности.

"Уходящая группа" относится к функциональной группе, которую можно замещать другой функциональной группой. В данной области хорошо известны некоторые уходящие группы, а примеры включают в качестве неограничивающих примеров галогениды (например, хлорид, бромид, йодид), метансульфонил (мезил), п-толуолсульфонил (тозил), трифторметилсульфонил (трифлат) и трифторметилсульфонат.

Сокращения

ЛИНКЕРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ:

MC = 6-малеимидокапроил

Val-Cit или "vc" = валин-цитруллин (иллюстративный дипептид в расщепляемом протеазой линкере)

Цитруллин = 2-амино-5-уреидопентановая кислота

PAB = п-аминобензилоксикарбонил (пример "саморазрушающегося" линкерного компонента)

Me-Val-Cit = N-метил-валин-цитруллин (где линкерная пептидная связь модифицирована для предотвращения ее расщепления катепсином B)

MC(PEG)6-OH = малеимидокапроил-полиэтиленгликоль (может быть присоединен к цистеинам антитела)

SPP = N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат

SPDP = N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат

SMCC = сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат

IT = иминотиолан

ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА:

MMAE = монометилауристатин E (MW 718)

MMAF = вариант ауристатина E (MMAE) с фенилаланином на C-конце лекарственного средства (MW 731,5)

MMAF-DMAEA = MMAF с DMAEA (диметиламиноэтиламин) в амидной связи с C-концевым фенилаланином (MW 801,5)

MMAF-TEG = MMAF с тетраэтиленгликолем, находящимся в сложноэфирной связи с фенилаланином

MMAF-NtBu = N-трет-бутил, присоединенный в виде амида к C-концу MMAF

DM1 = N(2')-деацетил-N(2')-(3-меркапто-1-оксопропил)майтанзин

DM3 = N(2')-деацетил-N2-(4-меркапто-1-оксопентил)майтанзин

DM4 = N(2')-деацетил-N2-(4-меркапто-4-метил-1-оксопентил)майтанзин.

Дополнительные сокращения представляют собой следующее: AE представляет собой ауристатин E, Boc представляет собой N-( трет-бутоксикарбонил), cit представляет собой цитруллин, dap представляет собой долапроин, DCC представляет собой 1,3-дициклогексилкарбодиимид, DCM представляет собой дихлорметан, DEA представляет собой диэтиламин, DEAD представляет собой диэтилазодикарбоксилат, DEPC представляет собой диэтилфосфорилцианидат, DIAD представляет собой диизопропилазодикарбоксилат, DIEA представляет собой N,N-диизопропилэтиламин, dil представляет собой долаизолейцин, DMA представляет собой диметилацетамид, DMAP представляет собой 4-диметиламинопиридин, DME представляет собой диметиловый эфир этиленгликоля (или 1,2-диметоксиэтан), DMF представляет собой N,N-диметилформамид, DMSO представляет собой диметилсульфоксид, doe представляет собой долафенин, dov представляет собой N,N-диметилвалин, DTNB представляет собой 5,5'-дитиобис(2-нитробензойную кислоту), DTPA представляет собой диэтилентриаминпентауксусную кислоту, DTT представляет собой дитиотреитол, EDCI представляет собой гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида, EEDQ представляет собой 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин, ES-MS представляет собой электроспрейную масс-спектрометрию, EtOAc представляет собой этилацетат, Fmoc представляет собой N-(9-флуоренилметоксикарбонил), gly представляет собой глицин, HATU представляет собой гексафторфосфат O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония, HOBt представляет собой 1-гидроксибензотриазол, ВЭЖХ представляет собой высокоэффективную жидкостную хроматографию, ile представляет собой изолейцин, lys представляет собой лизин, MeCN (CH₃ CN) представляет собой ацетонитрил, MeOH представляет собой метанол, Mtr представляет собой 4-анизилдифенилметил (или 4-метокситритил), nor представляет собой (1S,2R)-(+)-норэфедрин, PBS представляет собой фосфатно-солевой буфер (pH 7,4), PEG представляет собой полиэтиленгликоль, Ph представляет собой фенил, Pnp представляет собой п-нитрофенил, MC представляет собой 6-малеимидокапроил, phe представляет собой L-фенилаланин, PyBrop представляет собой гексафторфосфат бром-трис-пирролидинфосфония, SEC представляет собой эксклюзионную хроматографию, Su представляет собой сукцинимид, TFA представляет собой трифторуксусную кислоту, TLC представляет собой тонкослойную хроматографию, UV представляет собой ультрафиолет и val представляет собой валин.

КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ

Изобретение относится к антителам, которые связывают CD22. Также к иммуноконъюгатам, содержащим анти-CD22 антитела. Антитела и иммуноконъюгаты по изобретению могут использоваться, например, для диагностики или лечения расстройств, связанных с измененной экспрессией, например повышенной экспрессией, CD22. В конкретных вариантах осуществления антитела или иммуноконъюгаты по настоящему изобретению могут использоваться для диагностики или лечения расстройств, связанных с нарушением клеточной пролиферации, например, злокачественных опухолей.

Анти-CD22 антитела

В одном из аспектов изобретение относится к антителам, связывающимся с CD22. В некоторых вариантах осуществления предоставлены антитела, которые связываются со взрослой формой CD22 человека и яванского макака (cyno). В одном таком варианте осуществления зрелая форма CD22 человека обладает аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 27. Основная зрелая изоформа человека содержит внеклеточный домен, содержащий семь Ig-подобных доменов, и имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28. В другом варианте осуществления минорная изоформа CD22 человека с отсутствующими внеклеточными доменами 3 и 4 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29. Аминокислотная последовательность внеклеточного домена минорной изоформы представляет собой SEQ ID NO: 30. CD22 cyno имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD22 связывается со зрелой формой CD22, экспрессируемой на клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления антитело, связывающееся со зрелой формой CD22, экспрессируемой на клеточной поверхности, ингибирует рост клетки. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD22 связывается со зрелой формой CD22, экспрессируемой на клеточной поверхности, и ингибирует клеточную пролиферацию. В определенных вариантах осуществления антитело к CD22 связывается со зрелой формой CD22, экспрессируемой на клеточной поверхности, и индуцирует гибель клетки. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD22 связывается со зрелой формой CD22, экспрессируемой на поверхности злокачественных клеток. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD22 связывается со зрелой формой CD22, которая сверхэкспрессирована на поверхности злокачественных клеток по сравнению с нормальными клетками того же тканевого происхождения. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD22 является конъюгированным с цитотоксином или детектируемой меткой и связывается с CD22 на клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитело-токсин ингибирует рост клетки. В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитело-детектируемая метка обусловливает то, что клетка, экспрессирующая на своей поверхности CD22, становится детектируемой in vitro или in vivo.

В одном из аспектов антитело к CD22 представляет собой моноклональное антитело. В одном из аспектов антитело к CD22 представляет собой фрагмент антитела, например, фрагмент Fab, Fab'-SH, Fv, scFv или (Fab') ₂. В одном из аспектов антитело к CD22 представляет собой химерное, гуманизированное антитело или антитело человека. В одном из аспектов любое из антител к CD22, описываемых в настоящем документе, является очищенным.

В настоящем документе предоставлены иллюстративные моноклональные антитела, полученные из фаговой библиотеки. Антигеном, используемым для скрининга библиотеки, являлся полипептид с последовательностью из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 28 или SEQ ID NO: 30, соответствующих внеклеточным доменам (ECD) CD22 бета и альфа. Антитела, полученные на основании скрининга библиотеки, являются аффинно зрелыми.

В одном из аспектов предоставлены моноклональные антитела, которые конкурируют с 10F4.4.1 мыши, гуманизированными 10F4v1 и v3, и 5E8.1.8 мыши за связывание с CD22. Также предоставлены моноклональные антитела, которые связывают тот же эпитоп, что и 10F4.4.1 мыши, гуманизированные 10F4v1 и v3, и 5E8.1.8 мыши.

В одном аспектов изобретения предоставлены полинуклеотиды, кодирующие антитела к CD22. В определенных вариантах осуществления предоставлены векторы, содержащие полинуклеотиды, кодирующие антитела к CD22. В определенных вариантах осуществления предоставлены клетки-хозяева, содержащие такие векторы. В другом аспекте изобретения предоставлены композиции, содержащие антитела к CD22 или полинуклеотиды, кодирующие антитела к CD22. В определенных вариантах осуществления композиция по изобретению представляет собой фармацевтический препарат для лечения клеточного пролиферативного нарушения, такого как перечисленные в настоящем документе нарушения.

Введение и препарат антитела

В одном из вариантов осуществления антитело к CD22 или конъюгат антитело к CD22-лекарственное средство (включая в качестве неограничивающих примеров, конъюгат тиомаб к CD22-лекарственное средство по изобретению) по изобретению вводят в сочетании с антагонистом поверхностного антигена B-клеток. Введение "в сочетании с" одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами включает одновременное (параллельное) и последовательное введение в любом порядке. В одном из вариантов осуществления введение является последовательным или поочередным. В другом варианте осуществления введение является одновременным, параллельным или совмещенным в одном и том же препарате. В одном из вариантов осуществления антагонист поверхностного антигена B-клеток представляет собой антитело или его связывающий антиген фрагмент. В одном из вариантов осуществления антагонист поверхности B-клетки представляет собой конъюгат антитело-лекарственное средство.

Препараты по настоящему документу по мере необходимости для конкретного показания, подлежащего лечению, могут содержать более одного активного соединения, предпочтительно активные соединения с дополняющей активностью, которые не влияют друг на друга неблагоприятным образом. Например, в дополнение к антителу к CD22, конъюгату антитело к CD22-лекарственное средство или связывающему CD22 олигопептиду, может являться желательным включить в один препарат дополнительное антитело, например, второе антитело к CD22, которое связывает другой эпитоп на полипептиде CD22, или второе антитело, которое связывает другой поверхностный антиген B-клеток, или антитело к какой-либо другой мишени, такой как фактор роста, который действует на рост конкретной злокачественной опухоли. Альтернативно или дополнительно композиция может дополнительно содержать химиотерапевтическое средство, цитотоксическое средство, цитокин, ингибирующее рост средство, противогормональное средство и/или кардиопротектор. Такие молекулы соответственно находятся в сочетании в количествах, которые эффективны для назначенных целей.

В настоящее время, в зависимости от стадии злокачественной опухоли, лечение злокачественных опухолей включает одну или комбинацию из следующих видов терапии: хирургическое вмешательство для удаления злокачественной ткани, радиационная терапия и химиотерапия. Терапия антителами к CD22, конъюгатом антитело к CD22-лекарственное средство или олигопептиды к CD22 может являться особенно желаемой у пожилых пациентов, кто неудовлетворительно переносит токсичность и побочные эффекты химиотерапии и при метастазирующем заболевании, когда радиационная терапия имеет ограниченную пригодность. Нацеленные на опухоль антитела к CD22, конъюгат антитело к CD22-лекарственное средство или олигопептид к CD22 по изобретению пригодны для облегчения экспрессирующих CD22 злокачественных опухолей при исходном диагнозе заболевания или при рецидиве. Для терапевтического применения антитело к CD22, конъюгат антитело к CD22-лекарственное средство или олигопептид к CD22 можно использовать отдельно или в комбинированном лечении, например, с гормонами, антиангиогенными средствами или радиоактивно меченными соединениями или совместно с хирургией, криотерапией и/или радиотерапией. Лечение антителом к CD22, конъюгатом антитело к CD22-лекарственное средство или олигопептидом к CD22 можно проводить в сочетании с другими формами традиционной терапии, последовательно с традиционной терапией, до или после нее. В настоящем способе по изобретению для лечения или облегчения злокачественной опухоли пациенту со злокачественной опухолью можно вводить антитело к CD22, конъюгат антитело к CD22-лекарственное средство или олигопептид к CD22 в сочетании с лечением одним или несколькими ранее известными химиотерапевтическими средствами. Антитело к CD22, конъюгат антитело к CD22-лекарственное средство или олигопептид к CD22 вводят с терапевтически эффективной дозой химиотерапевтического средства. В другом варианте осуществления антитело к CD22, конъюгат антитело к CD22-лекарственное средство или олигопептид к CD22 вводят в сочетании с химиотерапией для усиления активности и эффективности химиотерапевтического средства. В The Physicians' Desk Reference (PDR) описаны дозировки этих средств, которые используют для лечения различных злокачественных опухолей. Режимы дозирования и дозировки этих указанных выше химиотерапевтических лекарственных средств, которые являются терапевтически эффективными, зависят от конкретной злокачественной опухоли, подлежащей лечению, степени заболевания и других факторов, хорошо известных практикующим специалистам в данной области, и доктор легко может их определить.

В одном конкретном варианте осуществления пациенту вводят конъюгат, содержащий антитело к CD22, конъюгат антитело к CD22-лекарственное средство или олигопептид к CD22, конъюгированный с цитотоксическим средством. Предпочтительно иммуноконъюгат, связанный с белком CD22, интернализуется клеткой, в результате приводя к увеличенной терапевтической эффективности иммуноконъюгата при уничтожении злокачественных клеток, с которыми он связывается. В одном из вариантов осуществления цитотоксическое средство поражает или блокирует нуклеиновую кислоту в злокачественной клетке. Примеры цитотоксических средств описаны выше и включают ауристатины, майтанзиноиды, калихимицины, рибонуклеазы и эндонуклеазы ДНК или их биологически активные производные.

Антитела к CD22, конъюгаты антитело к CD22-лекарственное средство или олигопептиды к CD22 или их конъюгаты с токсинами вводят человеческому пациенту известными способами, такими как внутривенное введение, например, в виде болюсной или непрерывной инфузии в течение периода времени, внутримышечным, интраперитонеальным, интрацереброспинальным, подкожным, внутрисосудистым, интрасиновиальным, интратекальным, пероральным, местным или ингаляционным способами. Предпочтительными являются внутривенное или подкожное введение антитела, конъюгата антитело к CD22-лекарственное средство или олигопептида к CD22.

С введением антитела к CD22, конъюгата антитело к CD22-лекарственное средство или олигопептида к CD22 можно комбинировать другие схемы лечения. Комбинированное введение включает совместное введение с применением отдельных препаратов или одного фармацевтического препарата и последовательное введение в любом порядке, где предпочтительно существует период времени, когда оба (или все) активные средства одновременно проявляют их биологическую активность. Предпочтительно такое комбинированное лечение приводит к синергическому терапевтическому эффекту.

Также может быть желательным комбинировать введение антитела к CD22 или антител, конъюгатов антитело к CD22-лекарственное средство или олигопептидов к CD22 с введением антител, направленных к другому антигену опухоли или поверхностному антигену B-клеток, ассоциированному с конкретной злокачественной опухолью.

В еще одном варианте осуществления способы терапевтического лечения по настоящему изобретению включают комбинированное введение анти-CD22 антитела (или антител), конъюгата(ов) анти-CD22 антитела и лекарственного средства или олигопептида(ов) вместе с одним или несколькими химиотерапевтическими средствами или средствами, ингибирующими рост, включая совместное введение коктейля из различных химиотерапевтических средств. Химиотерапевтические средства включают фосфат эстрамустина, преднимустин, цисплатин, 5-фторурацил, мелфалан, циклофосфамид, гидроксимочевину и гидроксиуретаксаны (такие как паклитаксел и доксетаксел) и/или антрациклиновые антибиотики, а также сочетание средств, таких как, но ими не ограничиваясь, СНОР или FOLFOX. Протоколы получения и дозирования для таких химиотерапевтических средств можно использовать в соответствии с инструкциями производителей или как определено эмпирически практикующими специалистами. Протоколы получения и дозирования для такой химиотерапии также описаны в Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992).

Антитело вводят любым подходящим способом, включая парентеральное, топическое, подкожное, интраперитонеальное, внутрилегочное, интраназальное и/или внутриочаговое введение. Парентеральные введения включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, интраперитонеальное или подкожное введение. Также предусмотрено интратекальное введение (относительно интратекальной доставки антитела к CD20 см., например, патентную заявку США 2002/0009444, Grillo-Lopez, A). Предпочтительно, дозирование проводят внутривенно или подкожно.

Второе лекарственное средство можно вводить с первоначальным воздействием и/или более поздним воздействием терапевтического антитела или иммуноадгезина, где комбинированное введение включает совместное введение с использованием раздельных препаратов или одного фармацевтического препарата, и последовательное введение в любом порядке, где предпочтительно существует период времени, когда оба (или все) активные средства одновременно проявляют их биологическую активность.

Хотя терапевтическое антитело к CD22, конъюгат антитело к CD22-лекарственное средство, иммуноадгезин или другое биологическое средство для лечения аутоиммунного заболевания можно вводить в качестве единственного средства, как правило, терапевтическое антитело или иммуноадгезин сочетают с одним или несколькими вторичными лекарственными средствами. Например, для RA и других аутоиммунных заболеваний, антитело, иммуноадгезин или другое биологическое лекарственное средство предпочтительно комбинируют с любым одним или несколькими из иммуносупрессирующих средств, химиотерапевтических средств, антагонистами BAFF, антагонистами или антителами к интегринам и/или цитокинами, перечисленными в разделе определений выше; с любым одним или несколькими модифицирующими заболевание антиревматическими лекарственными средствами (DMARD), такими как гидроксихлороквин, сульфасалазин, метотрексат, лефлюномид, азатиоприн, D-пеницилламин, золото (перорально), золото (внутримышечно), миноциклин, циклоспорин; иммуноадсорбцией стафилококкового белка A; внутривенным иммуноглобулином (IVIG); нестероидными противовоспалительными лекарственными средствами (NSAID); глюкокортикоидом (например, посредством инъекции в сосуды); кортикостероидом (например, метилпреднизолон и/или преднизон); фолатом; антагонистом к антителу к фактору некроза опухоли (TNF), например, этанерцепт/ENBREL , инфликсимаб/REMICADE , D2E7 (Knoll) или CDP-870 (Celltech); антагонистом IL-1R (например, кинерет); антагонистом 1L-10 (например, илодекакин); модулятором свертывания крови (например, WinRho); антагонистом IL-6/антителом к TNF (CBP 1011); антагонистом CD40 (например, IDEC 131); антагонистом Ig-Fc-рецептора (MDX33); иммуномодулятором (например, талидомид или ImmuDyn); антителом к CD5 (например, H5g1.1); ингибитором макрофагов (например, MDX 33); костимулирующим блокатором (например, BMS 188667 или толеримаб); ингибитором комплемента (например, h5G1.1, 3E10 или антитело к ускоряющему распад фактору (DAF)); антагонистом IL-2 (zxSMART); ингибитором EGFR (см. определение выше); ингибитором тирозинкиназы (см. определение выше); антиангиогенным средством (например, антитело к VEGF, такое как бевацизумаб); антителами к CD22, такими как LL2 или эпратузумаб (LYMFOCIDE®; Immunomedics), включая эпратузумаб Y-90 (Juweid et al., Cancer Res 55(23 Suppl):5899s-5907s (1995)), антителом к CD22 Abiogen (Abiogen, Italy), CMC 544 (Wyeth/Celltech), комботоксом (UT Soutwestern), BL22 (NIH) и LympoScan Tc99 (Immunomedics); антителом к EpCAM, таким как 17-1A (PANOREX®); антителом v 3 (например, VITAXIN®; Medimmune); антителом к CD37, таким как TRU016 (Trubion); антителом к IL-21 (Zymogenetics/Novo Nordisk); антителом к B-клеткам (Impheron); направленным на B-клетки MAb (Immunogen/Aventis); 1D09C3 (Morphosys/GPC); LymphoRad 131 (HGS); антителом к Lym-1 Y-90 (USC); LIF 226 (Enhanced Lifesci.); антителом к BAFF (например, WO 03/33658); антителом к рецептору BAFF (например, WO 02/24909); антителом BR3; антителом Blys, таким как белимумаб; LYMPHOSCD22-B ; онколимом к Lym-1 (USC/Peregrine); ISF 154 (UCSD/Roche/Tragen); гомиликсимой (Idec 152; Biogen Idec); антителом к рецептору IL-6, таким как атлизумаб (ACTEMRA ; Chugai/Roche); антителом к IL-15, таким как HuMax-Il-15 (Genmab/Amgen); антителом к рецептору хемокинов, таким как антитело к CCR2 (например, MLN1202; Millieneum); антителом к комплементу, таким как антитело к C5 (например, экулизумаб, 5G1.1; Alexion); пероральным препаратом иммуноглобулина человека (например, IgPO; Protein Therapeutics); антителом к IL-12, таким как ABT-874 (CAT/Abbott); тенеликсимабом (BMS-224818); B-клеточной вакциной; DN-BAFF (Xencor); CRx-119 (CombinatoRx); антагонист BAFF Amgen; пентостатином (Pfizer); IC-485 (ICOS); антагонистом хемокинов, таким как T-487 (туларик) или ретикулоза (AVR-118); SCO-323 (SCIOS); антагонистом интегринов 683699, танабе, NGD-2001-1 (Neurogen); SCIO-469 (SCIOS); BIRB-796 (Boehringer Ingelheim); VX702, VX850 (Vertex); антагонистом лейкотриена B-4 (таким как амелубунт, BIIL-284; BI); модулятором микротрубочек (Paxceed; Angiotech); ингибитором протеаз (MBS561392; BMS); AGIX-4207 (Atherogenics); ISIS-104838 (ISIS/Elan); MFG-IRAP (Univ. Pitt.); ловушкой IL-1 (RGN-303; Regeneron/Novartis); опрелвекином (Wyeth); эверолимусом (цертикан; Novartis); амевивом (Biogen Idec); ORG-39141 (Organon); FK-506 (Fujisawa); и антагонистом IL-2 (такролимус; Fujisawa).

Подробное описание иллюстративных антител к CD22 представляет собой следующее:

1. Конкретные варианты осуществления антител к CD22

В одном из аспектов изобретение относится к антителу, содержащему, по меньшей мере, один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; (b) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (c) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6; (d) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность из любого одного из SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 21, 22, 23; (e) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 и (f) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14.

В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две, или все три последовательности HVR VH, выбранные из (a) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; (b) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (c) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6. В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6.

В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6, и HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2.

В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6, и HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4.

В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; и HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три последовательности HVR VL, выбранные из (a) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10; (b) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; и (c) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14. В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 9. В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 10. В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 19-23. В одном из аспектов HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, где N28 замещен на V (аминокислотная замена N28V, дающая последовательность SEQ ID NO: 10). В одном из аспектов HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, где N28 замещен на A (аминокислотная замена N28A, дающая SEQ ID NO: 19). В одном из аспектов HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, где N28 замещен на Q (аминокислотная замена N28Q, дающая SEQ ID NO: 20). В одном из аспектов HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, где N28 замещен на S (аминокислотная замена N28S, дающая SEQ ID NO: 21). В одном из аспектов HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, где N28 замещен на D (аминокислотная замена N28D, дающая SEQ ID NO: 22). В одном из аспектов HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, где N28 замещен на I (аминокислотная замена N28I, дающая SEQ ID NO: 23). В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность из любого одного из SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 21, 22, 23. В одном из аспектов HVR-L1 представляют собой любую одну из SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 21, 22 или 23 и аминокислота в положении N30 (аспарагин в положении 30) замещена на A (аминокислотная замена N30A). В одном из аспектов HVR-L1 представляют собой любую одну из SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 21, 22 или 23 и аминокислота в положении N30 (аспарагин в положении 30) замещена на Q (аминокислотная замена N30Q).

В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему (a) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и (b) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD22 дополнительно содержит (a) HVR-H1, содержащую SEQ ID NO: 2, и HVR-H2, содержащую SEQ ID NO: 4.

В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему (a) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и (b) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD22 дополнительно содержит (a) HVR-H1, содержащую SEQ ID NO: 2, и HVR-H2, содержащую SEQ ID NO: 4.

В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему (a) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и (b) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 21, 22 и 23. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD22 дополнительно содержит (a) HVR-H1, содержащую SEQ ID NO: 2, и HVR-H2, содержащую SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 21, 22 или 23 содержит аминокислотную замену N30A или N30Q. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD22 дополнительно содержит HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD22 дополнительно содержит HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 21, 22, 23; (e) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; и HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления изобретение дополнительно относится к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 21, 22 или 23, выбранной как HVR-L1, модифицированной аминокислотной заменой N30A или N30Q.

В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 16 (см. фиг.2A, h10F4v1). В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему вариабельный домен легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 17 (см. фиг.2B, h10F4v1). В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему вариабельный домен легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 18 (см. фиг.2B, h10F4v3).

В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 34 (см. фиг.2A, m10F4). В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 35 (см. фиг.2B, m10F4).

В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему 1, 2, 3, 4, 5 или 6 из последовательностей HVR антитела 10F4.4.1, полученного посредством гибридомы, депонированной в ATCC и имеющей инвентарный номер PTA-7621.

В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему 1, 2, 3, 4, 5 или 6 из последовательностей HVR антитела 5E8.1.8, полученного посредством гибридомы, депонированной в ATCC и имеющей инвентарный номер PTA-7620.

Антитело к CD22 может содержать любую каркасную последовательность вариабельного домена при условии, что антитело сохраняет способность связывать CD22. Например, в некоторых вариантах осуществления антитела к CD22 по изобретению содержат консенсусную каркасную последовательность тяжелой цепи подгруппы III человека. В одном из вариантов осуществления этих антител консенсусная каркасная последовательность тяжелой цепи содержит замену(ы) в положениях 71, 73 и/или 78.

В одном из вариантов осуществления этих антител положение 71 представляет собой A, положение 73 представляет собой T и/или положение 78 представляет собой A. В одном из вариантов осуществления эти антитела содержат каркасную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи huMAb4D5-8, например, SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 (FR-H1, FR-H2, FR-H3, FR-H4, соответственно). huMAb4D5-8 коммерчески известно как GERCEPTIN® антитело к HER2, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA; также указанное в патентах США № 6407213 и 5821337 и Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93. В одном таком варианте осуществления эти антитела дополнительно содержат консенсусную каркасную последовательность легкой цепи человека I. В одном таком варианте осуществления эти антитела содержат каркасную последовательность вариабельного домена легкой цепи huMAb4D5-8, например, SEQ ID NO: 8, 1, 13, 15 (FR-L1, FR-L2, FR-L3, FR-L4, соответственно).

В одном из вариантов осуществления антитело к CD22 содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий каркасную последовательность и гипервариабельные области, где каркасная последовательность содержит последовательности FR-H1-FR-H4 SEQ ID NO: 1, 3, 5 и 7, соответственно; HVR H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; HVR-H2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 и HVR-H3 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6. В одном из вариантов осуществления антитело к CD22 содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий каркасную последовательность и гипервариабельные области, где каркасная последовательность содержит последовательности FR-L1-FR-L4 SEQ ID NO: 8, 11, 13 и 15, соответственно; HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 21, 22 и 23, где любая из SEQ ID NO: 9-10 или 19-23 может содержать аминокислотную замену N30A или N30Q; HVR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 и HVR-L3 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14. В одном из вариантов осуществления этих антител вариабельный домен тяжелой цепи содержит SEQ ID NO: 16, а вариабельный домен легкой цепи содержит SEQ ID NO: 17 или 18.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к антителу к CD22, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность, по меньшей мере, с 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности содержит замены, инсерции или делеции по отношению к референсной последовательности, но антитело, содержащее данную аминокислотную последовательность, сохраняет способность связываться с CD22. В некоторых вариантах осуществления в последовательности SEQ ID NO: 16 замещены, вставлены или удалены всего от 1 до 10 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления замены, вставки и удаления проводят в областях вне HVR (т.е. в FR). В некоторых вариантах осуществления антитело к CD22 содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к антителу к CD22, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи, как приведено ниже.

1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Glu Phe Ser Arg Ser Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Ser Ser Trp Asp Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 113 (SEQ ID NO: 16) (остатки HVR подчеркнуты).

В некоторых вариантах осуществления последовательности HVR и FR тяжелой цепи содержат следующее:

HVR-H1 (Gly Tyr Glu Phe Ser Arg Ser Trp Met Asn, SEQ ID NO: 2)

HVR-H2 (Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser Gly Lys Phe Lys Gly, SEQ ID NO: 4)

HVR-H3 (Asp Gly Ser Ser Trp Asp Try Tyr Phe Asp Tyr, SEQ ID NO: 6)

FR-H1 (Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser, SEQ ID NO: 1)

FR-H2 (Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val, SEQ ID NO: 3)

FR-H3 (Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg, SEQ ID NO: 5)

FR-H4 (Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser, SEQ ID NO: 7)

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к антителу к CD22, содержащему вариабельный домен легкой цепи, как приведено ниже.

1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Phe Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gln Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 108 (SEQ ID NO: 17) (остатки HVR подчеркнуты, а положение N28 напечатано полужирным шрифтом)

или

1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Val Gly Asn Thr Phe Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gln Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 108 (SEQ ID NO: 18) (остатки HVR подчеркнуты, а положение N28 напечатано полужирным шрифтом).

В некоторых вариантах осуществления последовательности HVR легкой цепи содержат следующее:

HVR-L1 (Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Phe Leu Glu, SEQ ID NO: 9)

HVR-L1 (Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Val Gly Asn Thr Phe Leu Glu, SEQ ID NO: 10)

HVR-L1 (Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Ala Gly Asn Thr Phe Leu Glu, SEQ ID NO: 19)

HVR-L1 (Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Gln Gly Asn Thr Phe Leu Glu, SEQ ID NO: 20)

HVR-L1 (Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Ser Gly Asn Thr Phe Leu Glu, SEQ ID NO: 21)

HVR-L1 (Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asp Gly Asn Thr Phe Leu Glu, SEQ ID NO: 22)

HVR-L1 (Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Ile Gly Asn Thr Phe Leu Glu, SEQ ID NO: 23)

HVR-L1 (Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Ile Gly Ala Thr Phe Leu Glu, SEQ ID NO: 32)

HVR-L1 (Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Ile Gly Gln Thr Phe Leu Glu, SEQ ID NO: 33)

HVR-L2 (Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser, SEQ ID NO: 12)

HVR-L3 (Phe Gln Gly Ser Gln Phe Pro Tyr Thr, SEQ ID NO: 14).

В некоторых вариантах осуществления последовательности FR легкой цепи содержат следующее:

FR-L1 (Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys, SEQ ID NO: 8);

FR-L2 (Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr, SEQ ID NO: 11);

FR-L3 (Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys, SEQ ID NO: 13)

FR-L4 (Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg, SEQ ID NO: 15).

В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичную с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 17 или 18. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность, по меньшей мере, с 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности содержит замены, добавления или делеции относительно референсной последовательности, но антитело, содержащее эту аминокислотную последовательность, сохраняет способность связываться с CD22. В некоторых вариантах осуществления в последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 17 или 18, замещены, вставлены или удалены всего от 1 до 10 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления замены, вставки и удаления проводят в областях вне HVR (т.е. в FR). В некоторых вариантах осуществления антитело к CD22 содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 17 или 18.

В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему (a) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 16; и (b) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 17 или 18. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность, по меньшей мере, с 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности содержит замены, добавления или делеции относительно референсной последовательности, но антитело, содержащее эту аминокислотную последовательность, сохраняет способность связываться с CD22. В некоторых вариантах осуществления в референсной последовательности замещены, вставлены или удалены всего от 1 до 10 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления замены, вставки и удаления проводят в областях вне HVR (т.е. в FR). В некоторых вариантах осуществления антитело к CD22 содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 18.

В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему (a) одну, две или три HVR VH, выбранных из HVR VH, представленных на фиг.2A, и/или (b) одну, две или три HVR VL, выбранных из HVR VL, представленных на фиг.2B. В одном из аспектов изобретение относится к антителу к CD22, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи, выбранный из вариабельных доменов тяжелой цепи, представленных на фиг.2A, и вариабельный домен легкой цепи, выбранный из вариабельных доменов легкой цепи, представленных на фиг.2B.

В одном из аспектов антитело к CD22 по изобретению содержит 1, 2, 3, 4, 5 или 6 из гипервариабельных областей антитела 5E8.1.8, получаемого посредством гибридомы, депонированной в ATCC и имеющей инвентарный номер PTA-7620.

2. Фрагменты антител

Настоящее изобретение относится к фрагментам антител. Фрагменты антител можно получать традиционными способами, такими как ферментативное расщепление, или рекомбинантными способами. При определенных обстоятельствах существуют преимущества использования фрагментов антител, а не целых антител. Меньший размер фрагментов обеспечивает быстрый клиренс и может приводить к улучшенному доступу к солидным опухолям. Для обзора некоторых фрагментов антител см. Hudson et al., (2003) Nat. Med. 9:129-134.

Для получения фрагментов антител разработаны различные способы. Традиционно эти фрагменты получают посредством протеолитического расщепления исходных антител (например, см. Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); и Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Однако эти фрагменты в настоящее время можно получать непосредственно посредством рекомбинантных клеток-хозяев. Все фрагменты антител Fab, Fv и ScFv можно экспрессировать в E.coli и секретировать из E.coli, таким образом, обеспечивая легкое получение больших количеств этих фрагментов. Фрагменты антител можно выделять из фаговых библиотек антител, обсуждаемых выше. Альтернативно, фрагменты Fab'-SH можно непосредственно восстанавливать из E.coli и химически связывать с формированием фрагментов (Fab')₂ (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). В соответствии с другим подходом фрагменты (Fab')₂ можно непосредственно выделять из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. В патенте США № 5869046 описан фрагмент Fab и (Fab')₂ с увеличенным временем полужизни in vivo, содержащий остатки эпитопа связывания рецептора спасения. Практикующим специалистам очевидны другие способы получения фрагментов антител. В определенных вариантах осуществления антитело представляет собой одноцепочечный фрагмент Fv (scFv). См. WO 93/16185; патенты США № 5571894 и 5587458. Только Fv и scFv представляют собой молекулы с интактными антигенсвязывающими участками, лишенными константных областей; таким образом, они могут подходить для сниженного неспецифического связывания при использовании in vivo. Можно конструировать слитые белки scFv с получением слияния эффекторного белка с амино- или C-концом scFv. См. Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, выше. Фрагмент антитела также может представлять собой "линейное" антитело, например, как описано в патенте США № 5641870. Такие линейные антитела могут быть моноспецифичными или биспецифичными.

3. Гуманизированные антитела

Данное изобретение относится к гуманизированным антителам. В данной области известны различные способы гуманизирования антител, не принадлежащих человеку. Например, гуманизированное антитело может содержать один или несколько аминокислотных остатков, введенных в него из источника, который не принадлежит человеку. Эти не принадлежащие человеку аминокислотные остатки часто обозначают как "импортные" остатки, которые, как правило, берут из "импортного" вариабельного домена. По существу, гуманизирование можно проводить способом Winter с коллегами (Jones et al., (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., (1988) Science 239:1534-1536), замещая последовательностями гипервариабельной области соответствующие последовательности антитела человека. Таким образом, такие "гуманизированные" антитела представляют собой химерные антитела (патент США № 4816567), где по существу менее одного интактного вариабельного домена человека замещено соответствующей последовательностью из не являющихся человеком видов. На практике гуманизированные антитела, как правило, представляют собой антитела человека, в которых некоторые остатки гипервариабельной области и возможно некоторые остатки FR замещены остатками из аналогичных участков антител грызунов.

Выбор вариабельных доменов человека, легкой и тяжелой цепей, для использования в получении гуманизированных антител может быть важен для снижения антигенности. В соответствии с так называемым способом "наилучшего приближения" последовательность вариабельного домена антитела грызуна скринируют относительно полной библиотеки известных последовательностей вариабельных доменов человека. Затем последовательность человека, наиболее близкую к последовательности грызуна, принимают как каркас для гуманизированного антитела (Sims et al., (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901). В другом способе используют конкретный каркас, полученный из консенсусной последовательности всех антител человека конкретной подгруппы легких или тяжелых цепей. Тот же каркас можно использовать для некоторых других гуманизированных антител (Carter et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al., (1993) J. Immunol, 151:2623).

Как правило, также важно, чтобы антитела гуманизировали с сохранением высокой аффинности к антигену и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели в соответствии с одним из способов гуманизированные антитела получают способом анализа исходных последовательностей и различных воображаемых гуманизированных продуктов с применением трехмерных моделей исходной и гуманизированной последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов являются общедоступными и хорошо известны специалистам в данной области. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных возможных последовательностей иммуноглобулинов. Исследование этих изображений позволяет проводить анализ возможной роли остатков в функционировании возможной последовательности иммуноглобулина, т.е. анализ остатков, влияющих на способность иммуноглобулина-кандидата связывать его антиген. Таким образом, можно выбрать и объединить остатки FR из реципиентной и импортируемой последовательностей так, чтобы добиться желательной характеристики антитела, такой как увеличенная аффинность к антигену(ам)-мишени. Как правило, остатки гипервариабельной области непосредственно и наиболее значительно вовлечены в воздействие на связывание антигена.

4. Антитела человека

Антитела человека к CD22 по изобретению можно конструировать, комбинируя последовательность(и) вариабельного домена клона Fv, выбранные из полученных от человека библиотек фагового дисплея, с известными последовательностями константных доменов человека, как описано выше. Альтернативно, гибридомным способом, можно получать моноклональные антитела человека к CD22 по изобретению. Клеточная линия миеломы человека и гетеромиеломная клеточная линия мыши-человека для получения моноклональных антител человека описана, например, в Kozbor J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); и Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).

В настоящее время можно получать трансгенных животных (например, мышей), которые после иммунизации способны к продукции полного спектра антител человека в отсутствие продукции эндогенных иммуноглобулинов. Например, описано, что гомозиготная делеция гена соединительной области (J_H) тяжелой цепи антитела у химерных и мутантных по зародышевой линии мышей приводит к полному ингибированию продукции эндогенных антител. Перенос набора генов иммуноглобулинов зародышевой линии человека таким мутантным по зародышевой линии мышам приводит при стимуляции антигеном к продукции антител человека. Например, см., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993).

Также для получения антител человека из антител, не принадлежащих человеку, например, грызуна, где антитело человека обладает сходными аффинностями и специфичностями относительно исходного, не принадлежащего человеку антитела, можно использовать перестановку генов. В соответствии с этим способом, который также называют "отпечаток эпитопа", вариабельную область тяжелой или легкой цепи фрагмента не принадлежащего человеку антитела, полученного способом фагового дисплея, как описано в настоящем документе, заменяют репертуаром генов V-домена человека, получая группу химерных scFv или Fab с не принадлежащей человеку цепью/цепью человека. Отбор с антигеном приводит к выделению химерного scFv или Fab с не принадлежащей человеку цепью/цепью человека, где репертуар цепей человека восстанавливает антигенсвязывающий участок, разрушенный при удалении соответствующей не принадлежащей человеку цепи в первичном клоне из фагового дисплея, т.е. эпитоп обусловливает (отпечатывает) выбор партнера цепи человека. Когда процесс повторяют для замещения оставшейся не принадлежащей человеку цепи, получают антитело человека (см. PCT WO 93/06213, опубликованный 1 апреля 1993 года). В отличие от традиционного гуманизирования не принадлежащих человеку антител, посредством прививания CDR, этот способ обеспечивает полностью человеческое антитело, которое не содержит остатков FR или CDR, происходящих не от человека.

5. Биспецифические антитела

Биспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, которые обладают специфичностью связывания, по меньшей мере, для двух различных антигенов. В определенных вариантах осуществления биспецифические антитела представляют собой антитела человека или гуманизированные антитела. В определенных вариантах осуществления одна из специфичностей связывания является специфичностью связывания для CD22, а другая специфичность связывания является специфичностью связывания для любого другого антигена. В определенных вариантах осуществления биспецифические антитела могут связывать два различных эпитопа CD22. Биспецифические антитела также можно использовать для локализации цитотоксических средств в клетках, экспрессирующих CD22. Эти антитела несут плечо, связывающее CD22, и плечо, связывающее цитотоксическое средство, например, такое как сапорин, анти-интерферон- , алкалоид барвинка, цепь рицина A, метотрексат или гаптен радиоактивного изотопа. Биспецифические антитела можно получать в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (например, биспецифические антитела (Fab')₂).

Способы получения биспецифических антител известны в данной области. Традиционно рекомбинантное получение биспецифических антител основано на совместной экспрессии двух пар тяжелых цепей-легких цепей иммуноглобулина, где две тяжелые цепи обладают различными специфичностями (Milstein and Cuello, Nature, 305:537 (1983)). Вследствие случайной сортировки легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов эти гибридомы (квадромы) продуцируют потенциальную смесь 10 различных молекул антител, из которых только одна обладает правильной биспецифической структурой. Очистка правильной молекулы, которую, как правило, проводят на стадиях аффинной хроматографии, является довольно трудной, и выход продукта является низким. Подобные способы описаны в WO 93/08829, опубликованной 13 мая 1993 года, и в Traunecker et al., EMBO J., 10:3655 (1991).

В соответствии с другим подходом вариабельные домены антител с желаемыми специфичностями связывания (антигенсвязывающие участки антитело-антиген) сливают с константным доменом последовательности иммуноглобулина. Слияние, например, проводят с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащей, по меньшей мере, часть областей шарнира, CH2 и CH3. В определенных вариантах осуществления, по меньшей мере, в одном из слияний присутствует первая константная область тяжелой цепи (CH1), содержащая участок, необходимый для связывания легкой цепи. ДНК, кодирующая слияния тяжелой цепи иммуноглобулина и, при желании, легкой цепи иммуноглобулина, вставляют в раздельные экспрессирующие векторы и совместно трансфицируют в подходящий организм-хозяина. Это обеспечивает большую гибкость в регулировке соответствующих пропорций трех полипептидных фрагментов в вариантах осуществления, когда неравные отношения трех полипептидных цепей, используемых в конструкции, обеспечивают оптимальный выход. Однако когда экспрессия, по меньшей мере, двух полипептидных цепей в равных отношениях приводит к высоким выходам или когда отношения не имеют особой значимости, кодирующие последовательности для двух или всех трех полипептидных цепей можно вставлять в один экспрессирующий вектор.

В одном из вариантов осуществления этого подхода биспецифические антитела состоят из гибридной тяжелой цепи иммуноглобулина с первой специфичностью связывания на одном плече и с парой гибридных тяжелой цепи-легкой цепи иммуноглобулина (обеспечивающих вторую специфичность связывания) на другом плече. Выявлено, что эта асимметричная структура облегчает отделение желаемого биспецифического соединения от нежелательных сочетаний цепей иммуноглобулина, так как присутствие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине биспецифической молекулы обеспечивает легкий путь разделения. Этот подход описан в WO 94/04690. Более подробно о получении биспецифических антител см., например, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210(1986).

В соответствии с другим подходом можно сконструировать поверхность контакта между парой молекул антитела для максимизации процента гетеродимеров, которые восстанавливаются из культуры рекомбинантных клеток. Поверхность контакта содержит, по меньшей мере, часть домена CH3 константного домена антитела. В данном способе одну или несколько небольших боковых цепей аминокислот из поверхности контакта молекулы первого антитело замещают большими боковыми цепями (например, тирозином или триптофаном). На поверхности контакта молекулы второго антитела создают компенсаторные "углубления" идентичного или меньшего размера относительно большой боковой цепи(ей) посредством замены больших боковых цепей аминокислот меньшими (например, аланином или треонином). Это обеспечивает механизм для увеличения выхода гетеродимера по сравнению с другими нежелательными конечными продуктами, такими как гомодимеры.

Биспецифические антитела включают перекрестно-связанные или "гетероконъюгированные" антитела. Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть связано с авидином, а другое с биотином. Такие антитела предложены, например, для направления клеток иммунной системы к нежелательным клеткам (патент США № 4676980) и для лечения ВИЧ-инфекции (WO 91/00360, WO 92/00373 и EP 03089). Гетероконъюгированные антитела можно получать с использованием подходящего способа перекрестного связывания. Подходящие связывающие средства хорошо известны в данной области и описаны в патенте США № 4676980 вместе с рядом способов перекрестного связывания.

Методики получения биспецифических антител из фрагментов антител также описаны в литературе. Например, биспецифические антитела могут быть получены, используя химическое связывание.

В статье Brennan et al., Science, 229: 81 (1985), описана методика, в которой интактные антитела протеолитически обрабатывают с получением фрагментов F(ab')₂. Эти фрагменты восстанавливают в присутствии дитиольного сложного агента арсенита натрия для стабилизации соседних диолов и предотвращения образования дисульфидной связи. Фрагменты Fab' образуются после преобразования в тионитробензоатные (TNB) производные. Один из производных Fab'-TNB затем преобразуют в Fab'-тиол путем восстановления меркаптоэтиламином и смешивают с эквимолярным количеством другого производного Fab'-TNB с образованием биспецифического антитела. Полученные биспецифические антитела могут использоваться в качестве агентов для селективной иммобилизации ферментов.

Недавний прогресс облегчил прямое восстановление фрагментов Fab'-SH, которые можно химически связать с формированием биспецифических антител, из E.coli . В Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) описано получение полностью гуманизированной молекулы биспецифического антитела (Fab')₂. Каждый фрагмент Fab' отдельно секретировали из E.coli и подвергали прямому химическому связыванию in vitro с формированием биспецифического антитела. Сформированное таким образом биспецифическое антитело было способно связываться с клетками, сверхэкспрессирующими рецептор HER2, и нормальными T-клетками человека, а также запускать литическое действие цитотоксических лимфоцитов человека против мишеней рака молочной железы человека.

Также описаны различные способы получения и выделения фрагментов биспецифических антител непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, биспецифические антитела получали с использованием лейциновых молний. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Пептиды лейциновых молний из белков Fos и Jun связывали с фрагментами Fab' двух различных антител посредством слияния генов. Гомодимеры антител восстанавливали в шарнирной области с формированием мономеров, а затем снова окисляли с формированием гетеродимеров антител. Этот способ также можно применять для получения гомодимеров антител. Технология "диател", описанная Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993), предоставила альтернативный механизм для получения фрагменты биспецифических антител. Фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) посредством линкера, который является слишком коротким, чтобы позволить связывание двух доменов на одной цепи. Таким образом, домены VH и VL одного фрагмента принуждают образовывать пару с комплементарными доменами VL и VH другого фрагмента, таким образом формируя два антигенсвязывающих участка. Также сообщалось о другой стратегии для получения фрагментов биспецифических антител посредством использование димеров одноцепочечных Fv (sFv). См. Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994).

Рассматривают антитела более чем с двумя валентностями. Например, можно получать триспецифические антитела. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).

6. Поливалентные антитела

Клетка, экспрессирующая антиген, с которым связываются антитела, может интернализировать (и/или катаболизировать) поливалентное антитело быстрее, чем бивалентное антитело. Антитела по настоящему изобретению могут представлять собой поливалентные антитела (которые отличаются от класса IgM) с тремя или более антигенсвязывающими участками (например, тетравалентные антитела), которые можно легко получать посредством рекомбинантной экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептидные цепи антитела. Поливалентное антитело может содержать домен димеризации и три или более антигенсвязывающих участка. В определенных вариантах осуществления домен димеризации содержит (или состоит из) Fc-область или шарнирную область. В этом варианте антитело содержит Fc-область и три или более антигенсвязывающих участка с N-конца Fc-области. В определенных вариантах осуществления поливалентное антитело содержит (или состоит из) от трех до приблизительно восьми антигенсвязывающих участков. В одном таком варианте осуществления поливалентное антитело содержит (или состоит из) четыре антигенсвязывающих участка. Поливалентное антитело содержит, по меньшей мере, одну полипептидную цепь (например, две полипептидных цепи), где полипептидная цепь(и) содержит два или более вариабельных домена. Например, полипептидная цепь(и) может содержать VD1-(X1)_n-VD2-(X2) _n-Fc, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен, VD2 представляет собой второй вариабельный домен, Fc представляет собой одну полипептидную цепь Fc-области, X1 и X2 представляют собой аминокислоту или полипептид, а n представляет собой 0 или 1. Например, полипептидная цепь(и) могут содержать цепь VH-CH1-гибкий линкер-VH-CH1-Fc-область или цепь VH-CH1-VH-CH1-Fc-область. Поливалентное антитело по настоящему документу может дополнительно содержать, по меньшей мере, два (например, четыре) полипептида вариабельных доменов легкой цепи. Поливалентное антитело по настоящему документу может, например, содержать от приблизительно двух до приблизительно восьми полипептидов вариабельных доменов легкой цепи. Рассматриваемые в настоящем разделе полипептиды вариабельных доменов легкой цепи содержат вариабельный домен легкой цепи и, необязательно, дополнительно содержат домен CL.

7. Однодоменные антитела

В некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению представляет собой однодоменное антитело. Однодоменное антитело представляет собой цепь из одного полипептида, содержащую весь вариабельный домен тяжелой цепи или его часть или весь вариабельный домен легкой цепи или его часть антитела. В определенных вариантах осуществления однодоменное антитело представляет собой однодоменное антитело человека (Domantis, Inc., Waltham, MA; например, см. патент США № 6248516 B1). В одном из вариантов осуществления однодоменное антитело состоит из всего или части вариабельного домена тяжелой цепи антитела.

8. Варианты антител

В некоторых вариантах осуществления предусмотрена модификация(и) аминокислотной последовательности антител, описываемая в настоящем документе. Например, может быть желательным улучшить аффинность связывания и/или другие биологические свойства антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела можно получать, проводя соответствующие изменения нуклеотидной последовательности, кодирующей антитело или посредством пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции остатков из аминокислотных последовательностей, и/или вставки остатков в аминокислотные последовательности, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антител. Для получения конечной конструкции можно осуществлять любое сочетание делеций, вставок и замен, при условии, что финальная конструкция обладает желательными характеристиками. Изменения аминокислот можно проводить в указанной аминокислотной последовательности антитела во время получения последовательности.

Подходящий способ идентификации определенных остатков или областей антитела, которые представляют собой предпочтительным места для мутагенеза, называется "мутагенез со сканированием аланином", как описано в Cunningham and Wells (1989) Science, 244: 1081-1085. В этом способе для влияния на взаимодействие аминокислот с антигеном определяют остаток или группу намеченных остатков (например, заряженные остатки, такие как arg, asp, his, lys и glu) и замещают нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (например, аланин или полиаланин). Затем те положения аминокислот, которые демонстрируют функциональную чувствительность к заменам, улучшают посредством введения дополнительных или других вариантов в участки замены или для участков замены. Таким образом, хотя участок осуществления изменения аминокислотной последовательности предопределен, предопределять природу мутации по существу не нужно. Например, для анализа свойств мутации в данном участке, в намеченном кодоне или намеченной области проводят ala-сканирование или случайный мутагенез и экспрессируемые иммуноглобулины подвергают скринингу на желательную активность.

Вставки в аминокислотную последовательность включают N- и/или C-концевые слияния в диапазоне длины от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки одного или нескольких аминокислотных остатков внутри последовательности. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым остатком метионина. Другие варианты молекулы антитела с инсерциями включают слияние N- или C-конца антитела с ферментом (например, для ADEPT) или полипептидом, который увеличивает время полужизни антитела в сыворотке.

В определенных вариантах осуществления антитело по изобретению изменяют для увеличения или уменьшения степени гликозилирования антитела. Гликозилирование полипептидов, как правило, является или N-сцепленным или O-сцепленным. N-сцепленное относится к присоединению молекулы углевода к боковой цепи аспарагинового остатка. Распознаваемыми последовательностями для ферментативного присоединения молекулы углевода к боковой цепи аспарагина являются трипептидные последовательности аспарагин-X-серин и аспарагин-X-треонин, где X представляет собой любую аминокислоту за исключением пролина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный участок гликозилирования. O-сцепленное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, как правило, серину или треонину, хотя также можно использовать 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.

Добавление или делецию участков гликозилирования антитела удобно проводить, изменяя аминокислотную последовательность так, чтобы создавалась или удалялась одна или несколько из описанных выше трипептидных последовательностей (для N-сцепленных участков гликозилирование). Изменение также можно осуществлять добавлением, удалением или заменой в последовательности исходного антитела (для O-сцепленных участков гликозилирования) одного или нескольких остатков серина или треонина.

Когда антитело содержит Fc-область, можно изменять связанный с ней углевод. Например, в патентной заявке США № US 2003/0157108 (Presta, L.) описаны антитела со зрелой углеводной структурой, в которых отсутствует присоединенная к Fc-области антитела фукоза. Также см. US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). В WO 2003/011878, Jean-Mairet et al., и патенте США № 6602684, Umana et al., указаны антитела с разделяющим пополам N-ацетилглюкозамином (GlcNAc) в углеводе, присоединенном к Fc-области антитела. В WO 1997/30087, Patel et al., сообщается об антителах, по меньшей мере, с одним остатком галактозы в олигосахариде, присоединенном к Fc-области антитела. Также относительно антител с измененным углеводом, присоединенным к его Fc-области, см. WO 1998/58964 (Raju, S.) и WO 1999/22764 (Raju, S.). Об антигенсвязывающих молекулах с модифицированным гликозилированием см. также US 2005/0123546 (Umana et al.).

В определенных вариантах осуществления вариант гликозилирования включает Fc-область, где в структуре углевода, присоединенного к Fc-области, отсутствует фукоза. Такие варианты обладают улучшенной функцией ADCC. Необязательно Fc-область дополнительно содержит в себе одну или несколько аминокислотных замен, которые дополнительно улучшают ADCC, например, замены в положениях 298, 333 и/или 334 Fc-области (нумерация остатков по Eu). Примеры публикаций, относящихся к "дефукозилированным" или "фукозодефицитным" антителам включают US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004). Примеры клеточных линий, продуцирующих дефукозилированные антитела, включают клетки CHO Lec13 с недостатком фукозилирующего белка (Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); патентная заявка США № US 2003/0157108 A1, Presta, L. и WO 2004/056312 A1, Adams et al., особенно в примере 11) и клеточные линии с нокаутом, такие как клетки CHO с нокаутом гена альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8 (Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614(2004)).

В одном из вариантов осуществления антитело изменяют для улучшения времени полужизни в сыворотке. Для увеличения времени полужизни антитела в сыворотке в антитело (особенно во фрагмент антитела) можно встраивать один эпитоп связывания рецептора спасения, как описано, например, в патенте США 5739277. Как применяют в настоящем документе, термин "эпитоп связывания рецептора спасения" относится к эпитопу Fc-области молекулы IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), который отвечает за увеличение времени полужизни молекулы IgG в сыворотке in vivo (патент США 2003/0190311, US6821505; патент США 6165745; патент США 5624821; патент США 5648260; патент США 6165745; патент США 5834597).

Другим типом варианта является замена варианта аминокислоты. Эти варианты содержат, по меньшей мере, один аминокислотный остаток в молекуле антитела, замещенный другим остатком. Представляющие интерес для замещающего мутагенеза участки включают гипервариабельные области, но также предусмотрены изменения FR. Консервативные замены представлены в таблице 1 под заголовком "предпочтительные замены". Если такие замены приводят к желательному изменению биологической активности, тогда можно провести более значительные изменения, обозначенные в таблице 1 как "иллюстративные замены", или как дополнительно описано ниже в отношении классов аминокислот, и провести скрининг продуктов.

Таблица 1
Исходный остаток	Иллюстративные замены	Предпочтительные замены
Ala (A)	Val; Leu; Ile	Val
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn (N)	Gln; His; Asp, Lys; Arg	Gln
Asp (D)	Glu; Asn	Glu
Cys (C)	Ser; Ala	Ser
Gln (Q)	Asn; Glu	Asn
Glu (E)	Asp; Gln	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile (I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; Норлейцин	Leu
Leu (L)	Норлейцин; Ile; Val; Met; Ala; Phe	Ile
Lys (K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe (F)	Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Val; Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val (V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Норлейцин	Leu

Существенные модификации биологических свойств антитела проводят посредством выбора замен, которые значительно отличаются по их действию на поддержание (a) структуры каркаса полипептида в области замены, например, конформация в виде слоя или спирали, (b) заряда или гидрофобности молекулы в участке-мишени или (c) размеров боковой цепи. Аминокислоты можно сгруппировать по сходству свойств их боковых цепей (в A.L. Lehninger, в Biochemistry, second ed., pp.73-75, Worth Publishers, New York (1975)):

(1) неполярные: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)

(2) незаряженные полярные: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)

(3) кислые: Asp (D), Glu (E)

(4) основные: Lys (K), Arg (R), His (H).

Альтернативно встречающиеся в природе остатки можно разделить на группы на основе общих свойств боковых цепей:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислотные: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

Неконсервативные замены приводят к замене представителя одного из этих классов на другой класс. Такие замещенные остатки также можно вводить в участки консервативных замен или в оставшиеся (неконсервативные) участки.

Один из типов замещенных вариантов включает замену одного или нескольких остатков гипервариабельной области исходного антитела (например, гуманизированного антитела или антитела человека). Как правило, полученный вариант(ы), отбираемый для дальнейшего усовершенствования, содержит измененные (например, улучшенные) биологические свойства относительно исходного антитела, из которого их получают. Удобный способ получения таких замещенных вариантов включает созревание аффинности с применением фагового дисплея. В кратком изложении несколько участков гипервариабельных областей (например, 6-7 участков) подвергают мутированию с получением всех возможных аминокислотных замен в каждом участке. Полученные таким образом антитела экспонируют на частицах нитевидного фага в виде слияний, по меньшей мере, с частью белка оболочки фага (например, продукт гена III M13), упакованного в каждой частице. Затем экспонированные на фаге варианты подвергают скринингу на их биологическую активность (например, аффинность связывания). Для идентификации участков-кандидатов гипервариабельных областей для модификации можно проводить сканирующий мутагенез (например, сканирование аланином) для определения остатков гипервариабельной области, вносящих значительный вклад в связывание антигена. Альтернативно или дополнительно может быть выгодным анализировать кристаллическую структуру комплекса антигена-антитело для определения точек контакта антитела и антигена. Такие контактирующие остатки и соседние остатки являются кандидатами на замену известными в данной области способами, включая способы, представленные в настоящем документе. После получения таких вариантов панель вариантов подвергают скринингу с применением известных в данной области способов, включая способы, описываемые в настоящем документе, и антитела с наилучшими свойствами в одном или нескольких релевантных анализах можно отобрать для дальнейшего усовершенствования.

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты аминокислотной последовательности антитела, получают множеством известных в данной области способов. Эти способы включают в качестве неограничивающих примеров выделение из природного источника (в случае встречающихся в природе вариантов аминокислотной последовательности) или получение посредством опосредованного олигонуклеотидами (или сайт-специфического) мутагенеза, мутагенеза ПЦР и кассетного мутагенеза ранее полученного варианта или безвариантной версии антитела.

Может быть желательным провести одну или несколько модификаций аминокислот в Fc-области антител по изобретению, получая, как правило, вариант Fc-области. Вариант Fc-области может содержать последовательность Fc-области человека (например, Fc-область IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека), содержащую аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или нескольких положениях аминокислот, включая положение цистеина в шарнире.

В соответствии с описанием и способами в данной области предусмотрено, что в некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению может содержать одно или несколько изменений по сравнению с соответствующим антителом дикого типа, например, в Fc-области. Тем не менее эти антитела будут сохранять по существу те же характеристики, необходимые для терапевтического применения, по сравнению с их аналогом дикого типа. Например, полагают, что в Fc-области можно проводить определенные изменения, которые приведут к измененным (т.е. или улучшенным или сниженным) связыванию C1q и/или обусловленной комплементом цитотоксичностью (CDC), например, как описано в WO 99/51642. Относительно других примеров вариантов Fc-области также см. Duncan & Winter Nature 322: 738-40 (1988); патент США № 5648260; патент США № 5624821 и WO 94/29351. В WO 00/42072 (Presta) и WO 2004/056312 (Lowman) описаны варианты антител с улучшенным или сниженным связыванием с FcR. Содержания этих патентных публикаций включены в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. Также см. Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001). В US 2005/0014934A1 (Hinton et al.) описаны антитела с увеличенным временем полужизни и улучшенным связыванием с неонатальным рецептором Fc (FcRn), который отвечает за перенос материнских IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)), как описано в US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Эти антитела содержат Fc-область с одной или несколькими заменами в ней, которые улучшают связывание Fc-области с FcRn. В патенте США № 6194551B1, WO 99/51642 описаны варианты полипептидов с измененными аминокислотными последовательностями Fc-области и способностью к увеличенному или сниженному связыванию C1q. Содержания этих патентных публикаций включены в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. Также см. Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

В одном из аспектов изобретение относится к антителам, содержащим модификации на поверхности контакта полипептидов Fc, содержащих Fc-область, где модификации облегчают и/или стимулируют гетеродимеризацию. Эти модификации включают введение выступа в первый полипептид Fc и полости во второй полипептид Fc, где выступ располагается в полости так, чтобы стимулировать образование комплекса первого и второго полипептидов Fc. Способы получения антител с этими модификациями известны в данной области, например, как описано в патенте США № 5731168.

9. Производные антител

Антитела по настоящему изобретению можно дополнительно модифицировать так, чтобы они содержали дополнительные небелковые группы, которые хорошо известны в данной области и легкодоступны. Предпочтительно группы, подходящие для дериватизации антител, представляют собой водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают в качестве неограничивающих примеров полиэтиленгликоль (PEG), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (или гомополимеры или статистические сополимеры) и декстран или поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры полипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Пропионовый альдегид полиэтиленгликоля может обладать преимуществами при производстве вследствие его стабильности в воде. Полимер может быть любой молекулярной массы и быть разветвленным или неразветвленным. Количество присоединенных к антителу полимеров может варьировать, и если присоединено более одного полимера, они могут являться одинаковыми или различными молекулами. Как правило, количество и/или тип используемых для дериватизации полимеров можно определить на основании представлений, включающих в качестве неограничивающих примеров, конкретные свойства и функции антитела для улучшения, будут ли производное антитело использовать для терапии в определенных условиях и т.д.

В другом варианте осуществления предоставлены конъюгаты антитела и небелковой молекулы можно селективно нагревать под воздействием излучения. В одном из вариантов осуществления небелковая молекула представляет собой углеродную нанотрубку (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 11600-11605 (2005)). Излучение может быть любой волны и включает в качестве неограничивающих примеров длины волн, которые не приносят вреда обычным клеткам, но которые нагревают небелковую молекулу до температуры, при которой клетки рядом с антителом-небелковой молекулой погибают.

Некоторые способы получения антител

1. Некоторые основанные на гибридомах способы

Моноклональные антитела к CD22 по изобретению можно получать гибридомным способом, впервые описанным Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), или можно получать способами рекомбинантных ДНК (патент США № 4816567).

В гибридомном способе мышь или другое подходящее животное-хозяина, такое как хомяк, иммунизируют для стимуляции лимфоцитов, продуцирующих или способных продуцировать антитела, которые специфически связываются с белком, используемым при иммунизации. Антитела к CD22, как правило, индуцируют у животного посредством нескольких подкожных (sc) или интраперитонеальных (ip) инъекций CD22 и адъюванта. CD22 можно получать хорошо известными в данной области способами, некоторые из которых дополнительно описаны в настоящем документе. Например, CD22 можно получать рекомбинантным способом. В одном из вариантов осуществления животных иммунизируют производным CD22, которое содержит внеклеточную часть CD22, слитую с Fc-частью тяжелой цепи иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления животных иммунизируют слитым белком CD22-IgG1. В одном из вариантов осуществления животных иммунизируют иммуногенными производными CD22 в растворе с монофосфориллипидом A (MPL)/дикриномиколатом трегалозы (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT) и раствор инъецируют интрадермально в несколько участков. Через две недели животных повторно иммунизируют. Через период от семи до четырнадцати суток у животных забирают кровь и сыворотку анализируют на титр антител к CD22. Животных продолжают иммунизировать до выхода титра на плато.

Альтернативно, лимфоциты можно иммунизировать in vitro. Затем лимфоциты сливают с миеломными клетками с применением подходящего средства для слияния, такого как полиэтиленгликоль, с формированием гибридомной клетки (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, p.59-103 (Academic Press, 1986)).

Полученные таким образом гибридомные клетки высевают и растят в подходящей среде для культивирования, например, среде, содержащей одно или несколько веществ, ингибирующих рост или выживание неслитых исходных миеломных клеток. Например, если в исходных миеломных клетках отсутствовал фермент гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфераза (HGPRT или HPRT), среда для культивирования гибридом, как правило, будет содержать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда HAT), которые предотвращают рост клеток с дефицитом HGPRT.

В определенных вариантах осуществления миеломные клетки представляют собой клетки, которые эффективно сливаются, поддерживают стабильный высокий уровень продукции антител выбранными продуцирующими антитело клетками и чувствительны к среде, такой как среда HAT. Иллюстративные миеломные клетки включают в качестве неограничивающих примеров линии миеломы мышей, такие как линии, полученные из опухолей мышей MOPC-21 и MPC-11, доступные от Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, и клетки SP-2 или X63-Ag8-653, доступные от American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Также для получения моноклональных антител человека описаны клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломные клеточные линии мышь-человек (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

Среду для культивирования, в которой растут гибридомные клетки, анализируют на продукцию моноклональных антител, связывающихся с CD22. Предпочтительно специфичность связывания продуцируемых гибридомными клетками моноклональных антител определяют посредством иммунопреципитации или посредством анализа связывания in vitro , такого как радиоиммунологический анализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Например, аффинность связывания моноклонального антитела можно определять посредством анализа Скэтчарда из Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980).

После определения того, что гибридомные клетки продуцируют антитела желаемой специфичности, аффинности и/или активности, клоны можно субклонировать посредством серийных разведений и растить стандартными способами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, p.59-103 (Academic Press, 1986)). Подходящие среды для культивирования для этой цели включают, например, среду D-MEM или RPMI-1640. Кроме того, гибридомные клетки можно растить in vivo в виде асцитных опухолей у животного. Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, подходящим способом выделяют из среды для культивирования, асцитной жидкости или сыворотки общепринятыми способами очистки иммуноглобулинов, например, таких как белок A-сефароза, хроматография на гидроксиапатите, электрофорез в геле, диализ или аффинная хроматография.

2. Некоторые способы скрининга библиотек

Антитела к CD22 по изобретению можно получать с применением комбинаторных библиотек для скрининга на антитела с желательным видом активности или видами активности. Например, в данной области известно множество способов получения библиотек фагового дисплея и скрининга таких библиотек на антитела, обладающие желаемыми характеристиками связывания. Такие способы описаны в основном в Hoogenboom et al., (2001) in Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ) и в определенных вариантах осуществления в Lee et al., (2004) J. Mol. Biol. 340: 1073-1093.

В принципе, синтетические клоны антител выбирают посредством скрининга фаговых библиотек, содержащих фаг, экспонирующий различные фрагменты вариабельной области (Fv) антитела, слитые с белком оболочки фага. Такие фаговые библиотеки подвергают аффинной хроматографии с желаемым антигеном. Клоны, экспрессирующие фрагменты Fv, способные связываться с желаемым антигеном, адсорбируются на антигене и, таким образом, отделяются от несвязывающихся клонов в библиотеке. Затем связывающиеся клоны элюируют с антигена и их можно обогащать посредством дополнительных циклов адсорбции антигена/элюции. Любое из антител к CD22 по изобретению можно получать, разработав подходящий способ скрининга для отбора представляющего интерес фагового клона с последующим конструированием клона полноразмерного антитела к CD22 с использованием последовательностей Fv из представляющего интерес фагового клона и подходящей последовательности константной области (Fc) последовательности, описанной в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3.

В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен антитела получают из двух вариабельных (V) областей приблизительно из 110 аминокислот, по одной из каждой легкой (VL) и тяжелой (VH) цепей, где на обеих присутствуют три гипервариабельные петли (HVR) или определяющие комплементарность области (CDR). Вариабельные домены могут функционально экспонироваться на фаге в виде одноцепочечных фрагментов Fv (scFv), в которых VH и VL ковалентно связаны через короткий, гибкий пептид, или в виде Fab-фрагментов, в которых каждый из них слит с константным доменом, и они взаимодействуют нековалентно, как описано в Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Как используют в настоящем документе, кодирующие scFv фаговые клоны и кодирующие Fab фаговые клоны в совокупности обозначают как "фаговые клоны Fv" или "клоны Fv".

Репертуар генов VH и VL можно по отдельности клонировать полимеразной цепной реакцией (ПЦР) и случайным образом рекомбинировать в фаговые библиотеки, в которых затем можно искать антигенсвязывающие клоны, как описано в Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Библиотеки из иммунизированных источников предоставляют высокоаффинные антитела к иммуногенам без необходимости конструирования гибридом. Альтернативно можно клонировать исходный репертуар для обеспечения одного источника антител ч4