способ получения цитохрома с

Формула изобретения

1. Способ получения цитохрома С, включающий обезжиривание сердец свиней крупного рогатого скота или лошадей, удаление из них связок и сосудов, измельчение и экстракцию 2,5%-ным раствором кислоты трихлоруксусной при температуре 10-15°С, при pH 3,9-4,2, отделение экстракта от фарша, сорбцию и элюцию на катионите, осаждение балластных белков сульфатом аммония, концентрирование и очистку его диализом до полного удаления ионов сульфата аммония, отличающийся тем, что сорбцию целевого продукта проводят непосредственно из отфильтрованного экстракта при pH экстракта на катионите UNOsphere S, уравновешенном стартовым буферным раствором при pH 3,9-4,2, после завершения сорбции катионит промывают стартовым буферным раствором, балластные белки удаляют с катионита UNOsphere S 80 мМ раствором трис и затем проводят элюцию цитохрома С с катионита UNOsphere S раствором сульфата аммония с концентрацией 0,3 М, после стадии элюции осуществляют осаждение балластных белков путем добавления сухого сульфата аммония из расчета 0,270 г/мл.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве уравновешивающего стартового раствора используют буферный раствор, содержащий 2 мМ лимонной кислоты и 1,5 мМтрис.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что очистку цитохрома С от ионов сульфата аммония проводят диафильтрацией в тангенциальном потоке через мембраны с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрирование цитохрома С проводят ультрафильтрацией в тангенциальном потоке через мембраны с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, к области получения лекарственных белковых препаратов, а именно к способу получения цитохрома С из мышц сердца млекопитающих - свиней, крупного рогатого скота и лошадей.

Цитохром С представляет собой фермент, катализирующий окислительно-восстановительные реакции, в качестве простетической группы содержит гем-атом железа. Благодаря гему цитохром С служит переносчиком электронов (Ю.А.Овчинников. Биоорганическая химия. М.: Химия, 1987, с.815).

Цитохром С широко используется в медицине и ветеринарии в качестве лекарственного препарата, а также в виде реактива в биохимии и биотехнологии.

Изобретение может использоваться при получении цитохрома С в промышленных масштабах.

Цитохром С может быть выделен из разнообразных видов природного сырья: дрожжей, риса, мышц сердца млекопитающих (лошадей, крупного рогатого скота, свиней, собак, кроликов, человека), птиц (голубей, пингвинов), сердец лососевых и других. Известны способы получения цитохрома С, включающие выделение из мышц сердца млекопитающих, предпочтительно крупного рогатого скота, путем экстракции и сорбционной очистки экстракта с использованием алюмосиликата магния (F.Okumura and al. Chem. Soc. Japan. V.49, № 1, p.65, 1975) или карбоксильных катионитов типа Амберлит ХЕ-64 (В.Hagihara and al. J. Biochem. V.45, № 8, p.551, 1975) и КМДМ (Л.К.Шатаева, Н.Н.Кузнецова, Г.Э.Елькин. Карбоксильные катиониты в биологии. - Л.: Наука, 1979, с.285). Данные сорбенты характеризуются малой емкостью и сложностью при промышленном применении карбоксильных катионитов из-за разницы в степени набухания в Н⁺ и Na⁺-форме.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения цитохрома С из мышц сердца крупного рогатого скота (RU 2096464, опубл. 20.11.97, бюл. № 32), включающий экстракцию предварительно обезжиренных и измельченных сердец крупного рогатого скота разбавленным раствором сильной кислоты при pH 3,9-4,2 в течение 1,5-2 ч при 10-15°С с последующей фильтрацией. Экстракт после фильтрации подщелачивают до pH 6,8-7.4, отделяют образовавшийся осадок. Непосредственно из него ведут сорбцию на карбоксильном катионите в Na⁺ -форме. Элюцию целевого продукта ведут 10-12% водным раствором сульфата аммония с pH 9,0-9,8. Из элюата при pH 7,2-7,5 осаждают балластные белки добавлением сульфата аммония в количестве 0,5 г/мл. Из надосадочной жидкости осаждают цитохром С действием 20% раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ) с получением осадка, который отделяют, растворяют в минимальном количестве воды и диализуют против изотонического раствора хлористого натрия до полного удаления иона SO₄ ^2-.

В прототипе используют катионит, представляющий собой сополимер метакриловой кислоты и N,N-гексаметилендиметакриламида, получаемый в виде блоков, который перед использованием требует предварительной обработки: измельчения, обработки 1 н. едким натром, затем 1 н. соляной кислотой, отмывки и сушки. Коэффициент набухания в воде Кнаб.=5,0, в буферном растворе с pH 6,8 Кнаб.=10,0, при переходе в слабокислую область Кнаб.=4,0. Полученный карбоксильный катионит хранится в H⁺-форме. Для выделения цитохрома С его необходимо переводить в Na⁺-форму действием избытка 1 н. едкого натра с последующим отмыванием водой до pH на выходе колонки 7,0-8,5 и уравновешиванием солевым раствором ионной силы 0,1 (5,6 г/л хлористого натрия или 5 г/л сульфата аммония). При этом набухаемость сорбента меняется в несколько раз (2-3 раза), что приводит к значительным неудобствам при промышленном выделении цитохрома С, так как требует использования колонн увеличенного размера.

Указанный сорбент имеет невысокую емкость сорбции по целевому продукту и низкую механическую прочность.

Отсутствие правильной сферической формы гранул катионита замедляет скорость проведения процесса в динамическом режиме сорбции и десорбции.

Кроме того, в описанном способе отсутствует сорбция цитохрома С непосредственно из экстракта при pH 3,9-4,2, так как карбоксильные катиониты в этой области не диссоциируют. Поэтому требуется дополнительная стадия - подщелачивание экстракта до pH 6,8-7,4.

Недостатком указанного способа получения цитохрома С является также невысокая степень чистоты цитохрома С, показатель чистоты (Е_550/280) цитохрома С в элюате (отношение экстинкции раствора цитохрома С при длине волны 550 нм и раствора цитохрома С при длине волны 280 нм) составляет около 0,58, это требует использования повышенного количества сульфата аммония (0,5 г/мл) для осаждения балластных белков при дополнительном подкислении элюата до pH 7,2-7,5, что значительно сокращает эффективность и экономичность технологического процесса.

Таким образом, задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ получения цитохрома С из экстракта с использованием высокостабильных гранульных макропористых сорбентов, обеспечивающих высокую емкость и обратимость сорбции, что делает их наиболее предпочтительными при использовании в промышленных масштабах.

Результатом настоящего изобретения является: сокращение технологического процесса, увеличение емкости по целевому продукту, повышение степени чистоты цитохрома С.

Согласно настоящему изобретению предложен сорбционный способ получения цитохрома С из экстракта с использованием катионита нового поколения UNOsphere S (UNOsphere Polymer Technology, производства «Bio-Rad» USA) - имеющий в качестве функциональных групп SO₃ -группы. На заключительных стадиях получения цитохрома С применяют диафильтрацию и ультрафильтрацию в тангенциальном потоке на мембранах с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа фирмы Millipore или Sartorius.

Для достижения указанного результата предложен способ, который включает в себя следующие стадии.

Из сердец свиней, крупного рогатого скота или лошадей после обезжиривания и удаления из них связок, сосудов путем измельчения получают фарш. Полученный фарш экстрагируют 2,5% раствором кислоты трихлоруксусной при температуре 10-15°С, при pH 3,9-4,2. После отделения от фарша непосредственно ведут сорбцию целевого продукта из отфильтрованного экстракта на катионите UNOsphere S, уравновешенном стартовым буферным раствором при pH 3,9-4,2. После завершения сорбции катионит UNOsphere S промывают стартовым буферным раствором. Удаление балластных белков с колонки проводят 80 мМ раствором трис (Трис (гидроксиметил)аминометан). Элюцию цитохрома С с катионита UNOsphere S проводят раствором сульфата аммония с концентрацией 0,3 М. Из элюата осаждают балластные белки добавлением сухого сульфата аммония из расчета 0,270 г/мл. Для отделения цитохрома С от сульфата аммония проводят диализ против воды или диафильтрацию в тангенциальном потоке на мембранах с пределом исключения 5 кДа, на этих же мембранах ультрафильтрацией осуществляют концентрирование цитохрома С.

Для уравновешивания колонки наиболее оптимальным оказался буферный раствор, содержащий 2 мМ лимонной кислоты и 1,5 мМ трис, также возможно использование других буферных растворов при данном значении pH. Для удаления балластных белков с катионита оптимальным является раствор триса с концентрацией 80 мМ, при более низких концентрациях не полностью вымываются балластные белки, более высокие концентрации не оказывают существенного влияния на количество удаленных балластных белков. Установлено, что для элюции цитохрома С с катионита наиболее оптимальным является раствор сульфата аммония с концентрацией 0,3 М, низкие концентрации сульфата аммония не полностью элюируют целевой продукт с катионита, при более высоких концентрациях с катионита частично элюируются примесные белки, что существенно снижает степень чистоты целевого продукта.

Использование указанного катионита UNOsphere S позволяет непосредственно вести сорбцию цитохрома С из экстракта (при pH экстракта), позволяет значительно сократить технологический процесс за счет увеличения скорости процесса сорбции и десорбции, использовать меньший объем катионита за счет большей емкости и существенно повысить степень чистоты цитохрома С. Использование диафильтрации и концентрирования цитохрома С ультрафильтрацией на заключительных стадиях очистки позволяет значительно повысить эффективность и экономичность процесса за счет снижения расхода реактивов и времени проведения процесса.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

2,6 кг фарша, полученного из сердечных мышц свиней после удаления сосудов, связок и измельчения, отмывают водой от остатков крови, экстрагируют 2,5% кислоты трихлоруксусной. Экстракцию ведут 2 ч при 10-15°С. Экстракт отделяют от исходного сырья фильтрованием через ватно-марлевый фильтр с последующим центрифугированием при n=3000 об/мин в течение 10 мин; pH полученного экстракта 4,1. Всего получают 2750 мл экстракта. Полученный экстракт пропускают через катионит UNOsphere S уравновешенным стартовым буферным раствором, содержащим 2 мМ лимонной кислоты и 1,5 мМ трис, pH 4,0. Объем колонки 49 мл (диаметр 2,5 см, высота слоя сорбента 7,5 см, количество сорбента 37 мл). Сорбцию ведут при скорости пропускания раствора 2240 мл/ч. Время сорбции около 1,2 ч. Затем катионит UNOsphere S промывают 230 мл стартовым буферным раствором. Время промывки 0,1 ч. Для удаление балластных белков с колонки пропускают 750 мл 80 мМ раствора трис при скорости 750 мл/час. Время промывки 1 ч. Элюцию цитохрома С проводят раствором сульфата аммония с концентрацией 0,3 М. Скорость подачи элюирующего раствора 75 мл/ч. Время элюции 1,2 ч. Элюат отбирают фракциями. Фракции, окрашенные в красный цвет, объединяют. Объем фракций около 46 мл. Показатель чистоты цитохрома С (E_550/280) составляет 0,92, выход 220 мг цитохрома С или 84,7 мг/кг исходного сырья.

В объединенные фракции при перемешивании порциями добавляют сухой сульфат аммония в количестве 12,42 г. Раствор выдерживают 15-30 мин. Центрифугированием удаляют осадок балластных белков. На этой стадии показатель чистоты цитохрома С составляет (E_550/280) выход 212 мг цитохрома С или 81,62 мг/кг исходного сырья.

Пример 2

Выполняется в условиях примера 1. Для отделения цитохрома С от ионов сульфата аммония проводят диализ против воды. Показатель чистоты цитохрома С (E_550/280) - 1,15. Выход 205 мг цитохрома С или 78,9 мг/кг исходного сырья.

Пример 3

Выполняется в условиях примера 1. После удаления балластных белков, для отделения цитохрома С от ионов сульфата аммония проводят диафильтрацию. Для этого раствор цитохрома С в количестве 138 мл (объединенные фракции 3^хзагрузок) пропускают на ультрафильтрационной установке в режиме диафильтрации в тангенциальном потоке через мембраны фирмы Millipore (кассета типа Pellicon XL) или Sartorius (кассета типа Vivaflow 50) с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа. Собирают 150 мл раствора, содержащего целевой продукт.

Показатель чистоты цитохрома С (E_550/280) - 1,2. Выход 210 мг цитохрома С или 80,7 мг/кг исходного сырья (в пересчете на одну загрузку).

Пример 4

Выполняется в условиях примера 1 и 2. Раствор цитохрома С после диализа концентрируют методом ультрафильтрации. Для этого раствор цитохрома С в количестве 180 мл (объединенные фракции 3^х загрузок после диализа) пропускают на ультрафильтрационной установке в тангенциальном потоке через мембраны фирмы Millipore (кассета типа Pellicon XL) или Sartorius (кассета типа Vivaflow 50) с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа. Получают 50 мл раствора, содержащего целевой продукт.

Показатель чистоты цитохрома С (E_550/280) - 1,18. Выход 200 мг цитохрома С или 77,0 мг/кг исходного сырья (в пересчете на одну загрузку).

Пример 5

Выполняется в условиях примера 1 и 3. Цитохром С после диафильтрации концентрируют методом ультрафильтрации. 150 мл раствор цитохрома С (объединенные фракции 3^х загрузок после диафильтрации) пропускают на ультрафильтрационной установке в тангенциальном потоке через мембраны фирмы Millipore (кассета типа Pellicon XL) или Sartorius (кассета типа Vivaflow 50) с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа. Получают 50 мл раствора, содержащего целевой продукт.

Показатель чистоты цитохрома С (E_550/280 ) - 1,21. Выход 208 мг цитохрома С или 80,0 мг/кг исходного сырья (в пересчете на одну загрузку).

Примеры 6-15 по стадиям выполнены в условиях примера 1, 2, 3, 4 и 5. Все экспериментальные данные представлены в таблице.

При этом индекс А означает сырье из сердечных мышц свиньи по примеру 1, 2, 3, 4 и 5; Б -. сырье из сердечных мышц крупного рогатого скота; В - сырье из сердечных мышц лошади.