способ выделения гепатоцитов птиц вида columba livia

Формула изобретения

Способ выделения гепатоцитов птиц вида Columba livia, включающий в себя вскрытие брюшной полости, канюлирование v.portae, через которую осуществляют двухэтапное перфузирование, механическую обработку печени, очистку гепатоцитов, фильтрацию и дифференциальное центрифугирование, предварительную инкубацию и высевание гепатоцитов в чашки Петри с определением количества жизнеспособных гепатоцитов в камере Горяева, при этом первичное перфузирование печени проводят бескальциевым раствором Хэнкса для отмывки крови и удаления ионов кальция, а вторичное перфузирование печени проводят трех-четырехкратно раствором Хэнкса, содержащим ионы кальция и коллагеназу 1 типа в концентрации 0,02-0,05% по 20 мин при температуре перфузата 15-16°С, трех-четырехкратную очистку гепатоцитов в фиколловом градиенте по 15 мин на центрифуге 1000 об/мин при температуре 20°С с добавлением 0,5-1,15 М сахарозы, дифференциальное центрифугирование осуществляют при 700 об/мин с экспозицией в 2 мин, а предварительную инкубацию гепатоцитов проводят при 37°С в течение 20 мин.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для изучения механизмов функционирования клеток, управления клеточными процессами, такими как пролиферация и дифференцировка, для изучения основ межклеточных взаимодействий и модификации метаболизма в условиях физиологической нормы и в эксперименте, при диагностике вирусных инфекций с целью изучения спектра чувствительности культур гепатоцитов различных животных к вирусам, в биотехнологических процессах при производстве вакцин, замещении, восстановлении, корректировке функций поврежденных тканей печени путем имплантации или трансплантации выращенных in vitro гепатоцитов.

К настоящему времени нам не известны способы выделения гепатоцитов птиц вида Columba livia, имеющие признаки, общие с заявляемым способом.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа, который обеспечил бы выделение гепатоцитов птиц вида Columba livia с высоким процентом выхода жизнеспособных гепатоцитов. Следует особо подчеркнуть, что высокий процент жизнеспособных гепатоцитов является необходимым условием для успешного проведения медико-биологических исследований, а следовательно, получения значимых (достоверных) исследуемых показателей.

Поставленная задача решается благодаря тому, что заявляемый способ включает в себя такие признаки, как: вскрытие брюшной полости, канюлирование v.portae, через которую осуществляют двухэтапное перфузирование, механическую обработку печени, очистку гепатоцитов, фильтрацию и дифференциальное центрифугирование, предварительную инкубацию и высевание гепатоцитов в чашки Петри с определением количества жизнеспособных гепатоцитов в камере Горяева, при этом первичное перфузирование печени проводят бескальциевым раствором Хэнкса для отмывки крови и удаления ионов кальция, а вторичное перфузирование печени проводят трех-четырехкратно раствором Хэнкса, содержащим ионы кальция и коллагеназу I типа в концентрации 0,02-0,05% по 20 мин при температуре перфузата 15-16°С, трех-четырехкратную очистку гепатоцитов в фиколловом градиенте по 15 мин на центрифуге при 1000 об/мин и температуре 20°С с добавлением 0,5-1,15 М углеводов - сахарозы, дифференциальное центрифугирование осуществляют при 700 об/мин с экспозицией в 2 мин, а предварительную инкубацию гепатоцитов проводят при 37°С в течение 20 мин.

Заявляемый способ выделения гепатоцитов птиц вида Columba livia реализуется следующим образом.

Под эфирным наркозом у птицы проводят вскрытие брюшной полости, канюлирование v.portae, через которую осуществляют первичное перфузирование печени бескальциевым раствором Хэнкса для отмывки крови и удаления ионов кальция, затем трех-четырехкратно проводят вторичное перфузирование печени раствором Хэнкса, содержащим ионы кальция и коллагеназу I типа в восходящей концентрации (от 0,02 до 0,05%) по 20 мин при температуре перфузата 15-16°С. Затем после удаления Глиссоновой капсулы и крупных кровеносных сосудов печень измельчают в пенициллиновом флаконе ножницами на кусочки весом 1-2 г, которые переносят в колбу, содержащую среду Игла, которую затем помещают на магнитную мешалку, например типа MS3000, Biosan (Латвия), на 5 минут. После чего проводят трех-четырехкратную очистку полученной тканевой взвеси в фиколловом градиенте по 15 мин на центрифуге, например ОПН-3, (Киргизия), при 1000 об/мин и температуре 20°С с добавлением 0,5-1,15 М углеводов, например сахарозы, с целью удаления клеточного детрита, элементов крови, гемопоэтических клеток и крупных фрагментов. Затем полученный осадок ресуспензируют в инкубационной среде, а далее полученную клеточную суспензию фильтруют через нейлоновые фильтры в колбу и оставляют для предварительной инкубации на 20 мин при температуре 37°С на шейкере, например типа BS-010108-AK, UP-12, Biosan (Латвия), с целью удаления дебриса поврежденных клеток.

Для получения популяции паренхимных клеток проводят фильтрацию через нейлоновые фильтры и дифференциальное центрифугирование, например типа VAC-601, в течение 2 мин при 700 об/мин. После чего в камере Горяева 1% раствором трипанового синего определяют количество жизнеспособных гепатоцитов при концентрации клеток в 3×10⁶ кл/мл. Далее клеточную суспензию разливают в чашки Петри, на дно которых помещают покровные стекла, предварительно обработанные 0,2% раствором желатина (Sigma, США). Инкубировали гепатоциты в среде F12, которая содержала 0,2 мг/мл альбумина (Sigma, США) и 0,5 мкг/мл инсулина (Sigma, США), а также содержащей 40 мкг/мл гентамицина, 10% фетальной сыворотки (РАА, Австрия), 25 ед/мл фактора LIF (Sigma, США). Далее чашки Петри помещают в термостат, например типа BS-010410-BAA, СП-100, Biosan (Латвия), для культивирования при температуре 37°С.

Приводим конкретные примеры реализации заявляемого способа.

Пример 1. Влияние дробной перфузии и температурных режимов на процент выхода жизнеспособных гепатоцитов птиц Columba livia

Животному вскрывали брюшную полость, затем проводили канюлирование v.portae, через которую осуществляют первичное перфузирование печени бескальциевым раствором Хэнкса для отмывки крови и удаления ионов кальция.

Вторичное перфузирование печени проводят согласно сформированным группам дробно раствором Хэнкса, содержащим ионы кальция и коллагеназу I типа в восходящей концентрации (от 0,02 до 0,05%). Для опыта сформировали три группы птиц:

1 группа - перфузию проводили однократно раствором Хэнкса, содержащим ионы кальция и 0,05% коллагеназу I типа, 5 мин при комнатной температуре;

2 группа - 10 мин трехкратно раствором Хэнкса, содержащим ионы кальция и коллагеназу I типа в восходящей концентрации при температуре перфузата 10-15°С;

3 - группа 20 мин трехкратно раствором Хэнкса, содержащим ионы кальция и коллагеназу I типа в восходящей концентрации при температуре перфузата 15-16°С.

Таблица 1
Влияние дробной перфузии и температурных режимов на процент выхода гепатоцитов (% жизнеспособных клеток)
№ группы	Птицы вида Columba livia
1 группа	86
2 группа	89
3 группа	98

Таблица 1 подтверждает, что для птиц, печень которых отличается высокой плотностью, дробное перфузирование коллагеназой трехкратно по 20 мин при температуре перфузата 15-16°С (3 группа) является оптимальным и обеспечивает максимальный процент выхода жизнеспособных гепатоцитов в сравнении с первой и второй группой.

Затем печень измельчали ножницами, как этап механической обработки, тканевую взвесь помещали на магнитную мешалку, после чего проводили трех-четырехкратную очистку тканевой взвеси в фиколловом градиенте 15 мин на центрифуге 1000 об/мин при температуре 20°С с добавлением 0,5-1,15 М углеводов, например сахарозы, получали клеточную суспензию гепатоцитов путем сочетания фильтрации и дифференциального центрифугирования 2 мин при 700 об/мин, последующую предварительную инкубацию гепатоцитов проводят на шейкере в термостате при температуре 37°С 20 мин. Полученную клеточную суспензию гепатоцитов в количестве 3 мл (3×10⁶ гепатоцитов) разливают в чашки Петри, на дне которых находятся покровные стекла, покрытые желатином. После чего в камере Горяева 1% раствором трипанового синего определяют количество жизнеспособных гепатоцитов при концентрации клеток в 3×10⁶ кл/мл. Далее чашки Петри помещают в термостат, для культивирования при температуре 37°С.

Пример 2. Получение клеточной суспензии и очистка в фиколловом градиенте с добавлением углеводов у птиц Columba livia

Животному вскрывали брюшную полость, затем проводили канюлирование v.portae, через которую осуществляют первичное перфузирование печени бескальциевым раствором Хэнкса для отмывки крови и удаления ионов кальция. Вторичное перфузирование проводят раствором Хэнкса, содержащим ионы кальция и коллагеназу I типа в восходящей концентрации (от 0,02 до 0,05%) по 20 мин при температуре перфузата 15-16°С. Далее печень измельчали ножницами, как этап механической обработки, полученную тканевую взвесь помещали на магнитную мешалку.

Проводили очистку тканевой взвеси в фиколловом градиенте. Для опыта сформировали три группы птиц:

1 группа - очистка в фиколловом градиенте однократная;

2 группа - очистка в фиколловом градиенте трех-четырехкратная;

3 группа - очистка в фиколловом градиенте трех-четырехкратная с добавлением 0,5-1,15 М углеводов.

Из таблицы 2 видно, что добавление углеводов и трех-четырехкратная очистка в фиколловом градиенте повышает выход жизнеспособных гепатоцитов в 3 группе на 19% по сравнению с первой группой и на 11% - по сравнению со второй. Предлагаемая углеводная метаболическая коррекция способствует сохранности и стабилизации мембран и энергетического обмена митохондрий, обеспечивая сохранность жизнеспособных гепатоцитов.

Таблица 2
Влияние дробной очистки в фиколловом градиенте с добавлением углеводов на процент выхода гепатоцитов (% жизнеспособных клеток)
№ группы	Птицы вида Columba livia
1 группа	78
2 группа	86
3 группа	97

Далее получали клеточную суспензию гепатоцитов путем сочетания фильтрации и дифференциального центрифугирования 2 мин при 700 об/мин, последующую предварительную инкубацию гепатоцитов на шейкере проводят 20 мин в термостате при температуре 37°С. Полученную клеточную суспензию гепатоцитов в количестве 3 мл (3×10⁶ гепатоцитов) разливают в чашки Петри, на дне которых находятся покровные стекла, покрытые желатином. После чего в камере Горяева 1% раствором трипанового синего определяют количество жизнеспособных гепатоцитов при концентрации клеток в 3×10⁶ кл/мл. Далее чашки Петри помещают в термостат для культивирования при температуре 37°С.

Пример 3. Получение паренхимной клеточной суспензии птиц Columba livia

Животному вскрывали брюшную полость, затем проводили канюлирование v.portae, через которую осуществляют первичное перфузирование печени бескальциевым раствором Хэнкса для отмывки крови и удаления ионов кальция. Вторичное перфузирование проводят раствором Хэнкса, содержащим ионы кальция и коллагеназу I типа в восходящей концентрации (от 0,02 до 0,05%) по 20 мин при температуре перфузата 15-16°С. Далее печень измельчали ножницами, как этап механической обработки, полученную тканевую взвесь помещали на магнитную мешалку. Проводили очистку тканевой взвеси в фиколловом градиенте трех-четырехкратно по 15 мин на центрифуге 1000 об/мин при температуре 20°С с добавлением 0,5-1,15 М углеводов, например сахарозы.

Для получения паренхимной клеточной суспензии экспериментально подбирали режимы дифференциального центрифугирования:

I режим - 5 мин при 200 об/мин;

II режим - 5 мин при 700 об/мин;

III режим - 2 мин при 700 об/мин.

Из таблицы 3 видно, что самый высокий выход жизнеспособных гепатоцитов наблюдался при 3 режиме (2 мин при 700 об/мин) - 97%, которые является оптимальным, так как этим режимом достигается минимальное механическое воздействие на гепатоциты и дифференцированное разделение паренхимных и непаренхимных клеток печени.

Таблица 3
Влияние различных режимов дифференциального центрифугирования на процент выхода гепатоцитов (% жизнеспособных клеток)
№ группы	Птицы вида Columba livia
1 группа	74
2 группа	83
3 группа	97

Последующую предварительную инкубацию гепатоцитов на шейкере проводят 20 мин в термостате при температуре 37°С. Полученную клеточную суспензию гепатоцитов в количестве 3 мл (3×10⁶ гепатоцитов) разливают в чашки Петри, на дне которых находятся покровные стекла, покрытые желатином. После чего в камере Горяева 1% раствором трипанового синего определяют количество жизнеспособных гепатоцитов при концентрации клеток в 3×10⁶ кл/мл. Далее чашки Петри помещают в термостат для культивирования при температуре 37°С.

Полученные культуры представляет собой морфологически однородную популяцию клеток, сохраняющую стабильный кариотип, свободную от посторонних агентов. Монослойная культура имеет вид морфологически однородного слоя клеток, прикрепленных к стеклу и покрытых прозрачной питательной средой красно-оранжевого цвета. Работу с препаратом проводят в стерильных условиях. До вскрытия бутылок с клетками обращают внимание на их целостность и концентрацию ионов в среде (pH) не ниже 7,0.

Таким образом, заявляемый способ обеспечивает выделение гепатоцитов птиц вида Columba livia с высоким (до 97) процентом выхода жизнеспособны гепатоцитов.