n-концевое полисиалилирование

Формула изобретения

1. Композиция, содержащая популяцию полисахаридных производных белка, где белок представляет собой инсулин или подобный инсулину белок, а полисахарид является полисиаловой кислотой, которая содержит от 20 до 125 единиц сиаловой кислоты, и где, по меньшей мере, 85% производных белка модифицированы только на N-конце В-цепи.

2. Композиция по п.1, где полисиаловая кислота состоит в основном только из единиц сиаловой кислоты.

3. Композиция по п.1, где инсулин или подобный инсулину белок модифицирован полисахаридом в редуцирующей концевой единице полисахарида.

4. Композиция по п.2, где полисахаридные производные имеют общую формулу (I):



где HNB происходит из B-NH₂, что является N-концом В-цепи инсулина или подобного инсулину белка;

L обозначает связь, соединяющую группу или содержит полипептид или синтетический олигомер;

GlyO представляет собой единицу сиаловой кислоты;

причем соединяющая группа, если она присутствует, имеет общую формулу -Y-C(O)-R¹-C(O)-;

где Y представляет собой NR² или NR² -NR²; R¹ представляет собой бифункциональный органический радикал, выбранный из группы, состоящей из алкандиила, арилена, алкарилена, гетероарилена и алкилгетероарилена, любой из которых может быть замещен и/или прерван карбонильной, сложно-эфирной, сульфидной, простой эфирной, амидной и/или аминной связями;

и R² представляет собой Н или C_1-6 алкил.

5. Композиция по п.4, где L обозначает связь или группу

.

6. Композиция по п.2, где полисахарид содержит 20-60 единиц сиаловой кислоты, наиболее предпочтительно 40-50 единиц сиаловой кислоты.

7. Композиция по п.1, где полидисперсность анионного полисахарида меньше 1,3, предпочтительно меньше 1,2, наиболее предпочтительно меньше 1,1.

8. Композиция по п.1, которая является фармацевтической композицией и содержит один или более из фармацевтически приемлемых наполнителей.

9. Композиция по п.1 для применения в терапии.

10. Композиция по п.1, где по меньшей мере 90% производных белка модифицированы только на N-конце В-цепи.

11. Композиция по п.1, где по меньшей мере 95% производных белка модифицированы только на N-конце В-цепи.

12. Способ получения полисахаридного производного инсулина или подобного инсулину белка, где анионный полисахарид, представляющий собой полисиаловую кислоту, содержащую 20-125 единиц сиаловой кислоты, химически реагирует в первом водном растворе с кислотным рН с N-концевым амином В-цепи инсулина или подобного инсулину белка, и полученные полисахаридные производные очищают во втором водном растворе, имеющем более высокий рН относительно первого водного раствора, где по меньшей мере 85% получаемых производных модифицированы только на N-конце В-цепи.

13. Способ по п.12, где рН первого водного раствора составляет 4,0-6,5.

14. Способ по п.12, где рН второго водного раствора составляет 6,5-9,0.

15. Способ по п.12, где анионный полисахарид имеет реакционно-способную альдегидную группу, которая реагирует с инсулином или с подобным инсулину белком, и реакцию модификации проводят при восстанавливающих условиях.

16. Способ по п.15, где реакционно-способная альдегидная группа находится на нередуцирующем конце полисахарида.

17. Способ по п.15, где реакционно-способный альдегид находится на редуцирующем конце полисахарида, а нередуцирующий конец был сделан пассивным, так что он не реагирует с инсулином или с подобным инсулину белком.

18. Способ по п.12, где анионный полисахарид или промежуточный продукт реакции взаимодействует с концевой аминогруппой инсулина или подобного инсулину белка в первом водном растворе с кислотным рН в диапазоне 4,0-6,0, и полученное полисахаридное производное очищают во втором водном растворе с более высоким рН, чем у первого водного раствора в диапазоне 6,5-8,5.

19. Способ по п.12, который осуществляется в присутствии добавки к рецептуре, предпочтительно фосфата натрия.

20. Способ по п.12, где по меньшей мере 90% полученных производных модифицированы только на N-конце В-цепи.

21. Способ по п.12, где по меньшей мере 95% полученных производных модифицированы только на N-конце В-цепи.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым полисахаридным производным инсулина и способам получения таких производных. Производные полезны для повышения стабильности и улучшения фармакокинетики и фармакодинамики инсулина.

Диабет представляет собой нарушение метаболизма углеводов и является следствием недостаточной продукции инсулина или сниженной чувствительности к инсулину. Инсулин синтезируется бета-клетками островков Лангерганса в поджелудочной железе и необходим для нормального усвоения глюкозы в большинстве клеток тела. У индивидуумов с диабетом подавлена нормальная способность усваивать глюкозу, что повышает уровень сахара в крови (гипергликемия).

Существуют две разновидности диабета. Тип I - это зависимый от инсулина diabetes mellitus (insulin-dependent diabetes mellitus, IDDM). Вначале IDDM называли диабетом начального периода юношества. При IDDM инсулин не секретируется поджелудочной железой и должен вводиться извне. Начинающийся во взрослом состоянии диабет II типа обычно можно контролировать диетой, хотя в некоторых случаях развитого заболевания необходим инсулин.

До выделения инсулина в 1920-е годы большинство пациентов умирали вскоре после начала заболевания. При отсутствии лечения диабет приводит к кетозу, то есть к накоплению в крови кетонов (продуктов разрушения жиров); после него начинается ацидоз (накопление в крови кислоты) с тошнотой и рвотой. По мере накопления токсических продуктов метаболизма расщепленного углевода и жира, пациент впадает в диабетическую кому.

Для лечения диабета обычно необходимы регулярные инъекции инсулина. Это приводит к резкому клиническому улучшению и сохранению жизни. Однако, из-за неудобства инъекций инсулина, были предприняты многочисленные попытки улучшить его введение и биологическое усвоение.

Молекула инсулина состоит из двух аминокислотных цепей, соединенных дисульфидными связями (молекулярный вес 5804). Бета-клетки островков поджелудочной железы секретируют одноцепочечный предшественник инсулина, известный как проинсулин. Протеолиз проинсулина приводит к отщеплению четырех основных аминокислот (номера 31, 32, 64 и 65 в цепи проинсулина: это соответственно Arg, Arg, Lys, Arg) и соединительного («С») полипептида. В образующейся двухцепочечной молекуле инсулина А-цепь имеет на амино-конце глицин, а В-цепь имеет на амино-конце фенилаланин.

Инсулин может существовать в виде мономера, димера или гексамера, образованного тремя димерами. Гексамер координирован с двумя атомами Zn²⁺. Биологическую активность проявляет мономер. Хотя до недавнего времени для лечения диабета у людей применяли почти исключительно бычий и свиной инсулин, известны многочисленные вариации инсулина у различных видов. Свиной инсулин больше всего подобен человеческому инсулину, от которого он отличается только тем, что имеет в С-конце В-цепи остаток аланина вместо остатка треонина. Несмотря на эти различия, большинство инсулинов млекопитающих имеют сопоставимую удельную активность. До сих пор весь инсулин для лечения заболевания получали из животных экстрактов. Появление рекомбинантной технологии позволяет осуществить на коммерческом уровне производство человеческого инсулина (например, инсулин Humulin , производимый фирмой Eli Lilly and Company, Indianapolis, Ind.).

Были сделаны попытки модифицировать инсулин, чтобы улучшить его фармако-кинетические свойства. На рынке имеется продукт ПЭГ-инсулин (Nektar Therapeutics). ПЭГ (полиэтиленгликоль) - это нейтральный, водорастворимый, нетоксичный полимер, содержащий любое число повторяющихся единиц этиленоксида. «ПЭГилирование» предназначено для увеличения размера активной молекулы и в конченом счете для улучшения характеристик лекарства путем оптимизации фармакокинетики, повышения биологической доступности, уменьшения иммуногенности и снижения частоты дозировок. Конструирование и усовершенствование ПЭГ-инсулина описано дополнительно в WO 2004091494.

Известно большое число способов получения ПЭГилированных производных инсулина. Davis et al. (патент США № 4179337) описывают синтез конструкции ПЭГ-инсулина с использованием трихлор-s-триазина (цианурхлорида) в качестве мостика между ПЭГ и белком. Они следуют схеме синтеза, в которой большой избыток (50-кратный) активированного цианурхлоридом ПЭГ (2000 Да) реагировал с инсулином в боратном буфере (pH 9,2) в течение 2 ч. Заявители смогли получать частично активные (приблизительно 50%) конъюгаты ПЭГ-инсулин, которые были неиммуногенны и неантигенны. Obermeier et al. (канадский патент № 1156217) обнаружили, что приготовление конъюгатов ПЭГ-инсулин согласно указанному выше патенту Davis давало неоднородную смесь конъюгатов, содержащих приблизительно 50% три-ПЭГ-инсулина, а другие возможные комбинации производных ПЭГ-инсулина (моно- и ди-ПЭГ-инсулины) не были замещены в положении PheB1.

Obermeier et al. (канадский патент № 1156217) описывают синтез конхюгатов ПЭГ-инсулин, специфически модифицированных по остатку PheB1. Основа их изобретения включает защиту реакционно-способных аминов у остатков GlyA1 и LysB29 трет-бутилоксикарбонильной (t-boc) или метилсульфонилэтоксикарбонильной (Msc) группами в органических растворителях (например, ДМФ, ДМСО, пиридине и т.д.) в щелочных условиях. Из сложной смеси (моно-, ди- и три-) защищенных инсулинов был выделен с помощью обычной хроматографической техники вид N- -А1,N- -В29-бис-защищенный инсулин. После выделения проводили реакцию чистого N- -A1,N- -В29-бис-защищенного инсулина с активированным (например, кислым хлоридом или изоцианатом) производным ПЕГ с последующим удалением защитных групп известными в пептидной химии методами. Заявители обнаружили, что реакционная способность аминогрупп GlyA1 и LysB29 была выше, чем у аминогруппы PheB1 при щелочных условиях реакции. Они установили, что их сайт-специфические конъюгаты мПЭГ(1500)-В1-инсулин имели 100% активности инсулина (в расчете на молярные количества) в снижении уровней сахара в крови кроликов.

Geiger et al. (1980) и Ehrat et al. (1983) описали специфически модифицированные в остатке PheB1 аддукты ПЭГ-инсулин, приготовленные по схеме защита/конъюгация/снятие защиты, подобной многостадийному методу, описанному Obermeier et al, Geiger et al. и Ehrat et al., и установили, что конъюгат ПЭГ(1500)-В1-инсулин имел меньшую антигенность и был намного более устойчив (к ферментам печени), чем нативный инсулин. Другие попытки приготовления ПЭГ-инсулина (Caliceti et al., 1999; Uchio et al., 1999; Hinds et al., 2002): 1) были основаны на отмеченных выше базовых трехстадийных схемах защита/конъюгация/снятие защиты, 2) приводили к неспецифической модификации молекулы инсулина или 3) не давали наиболее эффективных конъюгатов, а именно ПЭГ-В1-инсулинов.

Liu et al. (патент США № 6323311 В1) описывают полезный способ синтеза конъюгатов ПЭГ-В1-инсулин. Этот способ является развитием трехстадийной схемы Obermeier (защита/конъюгация/снятие защиты), но он не требует выделения промежуточных продуктов реакции между стадиями (то есть это синтез «в одном горшке»). Итак, инсулин защищают в остатках GlyA1 и LysB29, немедленно проводят реакцию с ПЭГ и затем снимают защиту до какого-либо выделения соединений. В заявке авторов говорится, что их реакция «в одном горшке» может дать до 50% изомера с правильной позицией модификации (например, ПЭГ-В1-инсулина) и 30% непрореагировавшего инсулина, который может быть возвращен для последующей модификации. Если даже предположить, что приготовление этих конструкций происходит быстро, для завершения потребуется по меньшей мере пять дней. Кроме того, для способа по этому изобретению требуются большие избытки реагента ПЭГ для достижения приемлемых результатов. Хотя продукты согласно этому изобретению могут быть эффективными, их приготовление все еще требует, чтобы белок претерпел три стадии реакции в неблагоприятных для белка окружениях (высокий и низкий pH) в течение длительных периодов времени.

Изобретение в US 2007083006 направлено на преодоление недостатков предшествующих способов получения ПЭГилированных инсулинов путем предоставления способа для простого приготовления производных инсулина высокой степени чистоты, специфически ПЭГилированных на N-конце В-цепи инсулина (PheB1) в одной стадии. В отличие от предшествующего опыта (например, Caliceti et al., 1999, см. выше), указывающего на то, что ПЭГилированный в остатке PheB1 инсулин является по меньшей мере вероятным продуктом реакции, в данном способе использованы специфические условия: регулирование pH, применение хелатора ионов металлов и добавление органического растворителя для усиления относительной реакционной способности аминогруппы PheB1 до такой степени, что она становится преобладающим сайтом для ПЭГилирования. Если иметь в виду многочисленные полезные свойства, приданные инсулину (например, сниженные иммуногенность/антигенность, повышенную протеолитическую, химическую и физическую стабильность, увеличенное время полужизни в кровотоке, повышенную растворимость в воде и органических растворителях, полную биологическую активность) сайт-специфическим ПЭГилированием в остатке PheB1, то простой, дешевый и легко масштабируемый способ для достижения такого результата был бы существенным достижением в данной области.

В свете предшествующего опыта, существует потребность в получении усовершенствованных производных инсулина, которые могут быть использованы для лечения человека и животных и имеют оптимизированные стабильность, время полужизни и низкую токсичность. Авторы настоящего изобретения установили, что присоединение к инсулину полисиаловых кислот придает ему такие свойства.

Полисиаловые кислоты (ПСК) - это существующие в природе неразветвленные полимеры сиаловой кислоты, продуцируемые определенными бактериальными штаммами и некоторыми клетками млекопитающих. Они могут быть получены с различными степенями полимеризации от приблизительно n=80 или более остатков сиаловой кислоты до n=2 путем ограниченного кислотного гидролиза или путем расщепления нейраминидазами, или путем фракционирования природных форм полимера бактериального происхождения.

В последние годы биологические свойства полисиаловых кислот, в частности свойства гомополимерной сиаловой кислоты со связью -2,8, использовали для модификации фармакокинетических свойств белков и молекул лекарств с низким молекулярным весом. Модификация полисиаловой кислотой дает резкое повышение времени полужизни в кровотоке для большого числа терапевтических белков, включая каталазу и аспарагиназу, и позволяет также использовать такие белки при наличии повышения содержания предсуществующих антител, являющегося нежелательным (и иногда неизбежным) следствием предшествующего применения терапевтического белка (Fernandes and Gregoriadis, 1996, 1997). Полисиаловая кислота со связью -2,8 является привлекательной альтернативой ПЭГ, поскольку она представляет собой иммунологически «невидимый» биодеструктируемый полимер, который является естественной частью человеческого тела, и который расщепляется тканевыми нейраминидазами до сиаловой кислоты, то есть нетоксичного сахарида.

Заявители ранее описали методы присоединения полисахаридов (в частности, ПСК) к терапевтическим средствам - таким, как белки (патентные документы US-A-5846951; WO-A-0187922). В некоторых из этих методов требуется химическая модификация «нередуцирующего» конца полимера для создания способной для реакции с белком альдегидной части молекулы, которая реагирует с первичными аминогруппами. Концевая единица нередуцирующей сиаловой кислоты, поскольку она содержит смежные диолы, может быть легко (и селективно) окислена периодатом с образованием моноальдегидной формы, которая имеет гораздо более высокую реакционную способность по отношению к белкам и которая содержит подходящим образом реагирующий элемент для присоединения белков путем восстановительного аминирования и других химических реакций. Реакция иллюстрирована фигурами 1 и 2, где

Фиг.1 показывает окисление периодатом натрия коломиновой кислоты (полисиаловая кислота со связями -2,8 из Е coli) с образованием на нередуцирующем конце способного к реакции с белком альдегида; и

Фиг.2,показывает селективное восстановление шиффова основания цианоборгидридом натрия с образованием стабильной необратимой ковалентной связи с аминогруппой белка.

Заявители описали в предыдущих публикациях, например в Biochimica et Biophysica Acta (2003), синтез полисалилированного инсулина. В этой работе коломиновые кислоты с молекулярным весом 22 кДа и 39 кДа были окислены и реагировали с аминогруппами рекомбинатного человеческого инсулина. Полидисперсность использованных коломиновых кислот составляет 1,33 и 1,40, что слишком велико для терапевтического применения.

В предыдущей патентной заявке, опубликованной как WO 2005/016974, авторы описали также синтез конъюгатов инсулина с коломиновой кислотой. Однако в этой заявке не все конъюгаты являлись специфически N-концевыми, и были получены разнообразные конъюгаты.

В ходе описанных выше обычных реакций конъюгации, например, при реакции коломиновой кислоты с боковыми цепями аминокислот, могут образовываться непредусмотренные побочные продукты. Этого может быть достаточно, чтобы создать трудности в производстве химически идентифицированных конъюгатов, наличия которых требуют контролирующие органы для терапевтического применения у человека и животных.

Непросто очистить требуемый продукт реакции (например, монополисиалилированный продукт) от различных нежелательных продуктов, так как физико-химические характеристики большинства продуктов реакции похожи. Это означает, что такие методы, как ионообменная хроматография и гель-проникающая хроматография (которые обеспечивают разделение на основе соответственно заряда и размера), дают плохую очистку.

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения авторы предоставляют композицию, содержащую популяцию полисахаридных производных белка, где белок - это инсулин или подобный инсулину белок, а полисахарид является анионным и содержит от 2 до 125 сахаридных единиц, и где популяция состоит в основном только из N-концевых производных белка.

Здесь далее, если используется термин «инсулин», авторы подразумевают также подобные инсулину белки. Подобный инсулину белок обозначает белок с активностью, эквивалентной активности инсулина. Инсулин, как правило, снижает концентрацию глюкозы в крови. Он также повышает проницаемость клеток для моносахаридов, аминокислот и жирных кислот и ускоряет гликолиз, пентозо-фосфатный цикл и синтез гликогена в печени. Предпочтительно, чтобы подобный инсулину белок имел по меньшей мере 35%, более предпочтительно - по меньшей мере 50% активности человеческого инсулина, соответствующего банку данных Swissprot, № доступа Р01308.

Могут также использоваться мутантные формы инсулина, которые имеют необходимую активность, как подробно пояснено выше. «Подобный инсулину» белок может быть также назван «гомологом инсулина». Являются ли две последовательности гомологичными, обычно рассчитывают с использованием процента подобия или идентичности (хорошо известные в данной области термины). Последовательности следует сопоставлять с последовательностью SEQ I.D. No. 1, которая является последовательностью не подвергшегося процессингу предшественника человеческого инсулина. Остатки 25-54 соответствуют В-цепи инсулина, а остатки 90-110 соответствуют А-цепи инсулина. Последовательности гомологов можно также сопоставлять с последовательностью активной формы человеческого инсулина.

Предпочтительно гомологи имеют степень подобия или идентичности на уровне нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности 50% или более, более предпочтительно 60%, 70%, 80% или более, еще предпочтительнее 90% или более, как степень идентичности или подобия 95% или 99% на уровне нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности. Для расчета степени подобия или идентичности имеется много программ; предпочтительны программы BLASTn, BLASTp и BLASTx, которые используют с параметрами, доступными в сайте www.ncbi.nlm.nih.gov. Например, 2 аминокислотные последовательности можно сопоставить с помощью программы BLASTn со следующими параметрами: отсчет = 100, длина слова = 11, величина ожидания = 11, фильтрование малой сложности включено (score = 100, word length = 11, expectation value = 11, low complexity filtering = on). Указанные выше уровни гомологии рассчитаны с использованием этих параметров.

Инсулин может быть природным, то есть полученным от человека или животного, или синтетическим, например, полученным рекомбинантным способом.

Как хорошо известно в данной области, инсулин состоит из двух пептидных цепей. В настоящем изобретении инсулин предпочтительно модифицирован полисахаридом на N-конце его В-цепи.

Под «популяцией» авторы подразумевают, что в композиции имеется более одной полисахаридной производной. Производные могут содержать одинаковое или различное число сахаридных единиц. Предпочтительно, чтобы полидисперсность полисахарида в композиции была менее 1,3, предпочтительнее - менее 1,1.

В популяции все белки в основном модифицированы только на N-конце. Поскольку в инсулине имеются две пептидные цепи, имеются и две N-концевые области. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 85%, более предпочтительно - по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно - по меньшей мере 95% В-цепей в популяции были модифицированы на N-конце анионным полисахаридом. N-концы А-цепей не нуждаются в модификации.

Степень модификации на N-конце может быть определена с помощью стандартных методов, известных в данной области, - таких как пептидное картирование или расщепление по Edman.

Предпочтительно, чтобы полисахарид имел по меньшей мере 2, более предпочтительно - по меньшей мере 5, наиболее предпочтительно - по меньшей мере 10, как, например, по меньшей мере 50 сахаридных единиц.

Анионный полисахарид предпочтительно выбран из полисиаловой кислоты, гепарина, гиалуроновой кислоты и хондроитин-сульфата. Предпочтительно полисахарид является полисиаловой кислотой и состоит в основном только из единиц сиаловой кислоты. Однако полисахарид может иметь в молекуле, кроме сиаловой кислоты, другие единицы. Предпочтительно, однако, чтобы полисахарид состоял в основном из единиц сиаловой кислоты.

Предпочтительно, чтобы полисахарид имел в качестве концевой группы сиаловую кислоту и, как детализировано выше, более предпочтительно был полисиаловой кислотой, то есть полисахаридом, содержащим по меньшей мере две единицы сиаловой кислоты, соединенные друг с другом связями -2-8 или -2-9. Подходящая сиаловая кислота имеет средневесовой молекулярный вес в диапазоне от 2 до 100 кДа, предпочтительно в диапазоне от 1 до 35 кДа. Наиболее предпочтительная полисиаловая кислота имеет молекулярный вес в диапазоне 10-20 кДа, обычно приблизительно 14 кДа. Наиболее предпочтительно, чтобы полисиаловая кислота происходила из бактериального источника, например, была полисахаридом В из E. coli K1, N. meningitidis, Maraxella liquefaciens или Pasteurella aeruginosa или полисахаридом К92 из штамма E. coli. Наиболее предпочтительно, чтобы это была коломиновая кислота (КК) из Е coli K1.

Анионный полисахарид, предпочтительно полисиаловая кислота, может быть в форме соли или свободной кислоты. Он может быть в гидролизованной форме, так что молекулярный вес снижен после выделения из бактериального источника. Полисахарид, предпочтительно сиаловая кислота, может быть материалом, имеющим широкое распределение по молекулярным весам, - таким как имеющим полидисперсность более 1,3, например, такую как 2 или более. Предпочтительно, чтобы полидисперсность по молекулярному весу была менее 1,3 или 1,2, предпочтительно менее 1,1, например, такая низкая, как 1,01.

Как правило, соединение согласно настоящему изобретению - это модифицированный полисиаловой кислотой инсулин, содержащий 2-125 единиц сиаловой кислоты. Более типично, что соединение содержит 10-80 единиц сиаловой кислоты, предпочтительно - 20-60 единиц сиаловой кислоты, наиболее предпочтительно - 40-50 единиц сиаловой кислоты.

Полисахаридные производные в первом аспекте настоящего изобретения могут быть конъюгатами с ковалентной связью между N-концом инсулина и анионным полисахаридом. Иное означает ассоциацию между полисахаридом и инсулином, в том числе электростатическое соединение. Однако предпочтительно ковалентное связывание. Ковалентной связью может быть амидная связь между карбоксильной группой и аминогруппой. Другой связью, которой инсулин может быть ковалентно соединен с полисахаридом, может быть связь посредством шиффова основания. Подходящие группы для присоединения к аминам описаны в WO 2006/016168.

В настоящем изобретении полисахаридом может быть природный полисахарид или производное природного полисахарида, например полисахарид, который был модифицирован путем реакции одной или более из активных групп на сахаридных остатках или который был ковалентно присоединен к модифицирующей группе на конце полисахаридной цепи.

Полисахарид может быть присоединен к инсулину своей редуцирующей или нередуцирующей концевой единицей.

Методы присоединения полисахаридов к белкам хорошо известны в данной области и более подробно описаны в WO 92/22331 и WO-A-0187922. Предпочтительные для настоящего изобретения методы более подробно описаны ниже. Методы также описаны на фигурах 1 и 2 данной заявки.

Полисахарид может быть присоединен к инсулину своей редуцирующей или нередуцирующей концевой единицей. Это означает, что одна полисахаридная цепь может быть присоединена к двум белковым молекулам инсулина, то есть она может быть модифицирована как на ее редуцирующем, так и на нередуцирующем конце.

Полисахарид может быть присоединен к пептиду инсулина непосредственно, то есть так, как показано на фигурах 1 и 2, или через мостик. Подходящие мостики могут быть получены из реагентов, содержащих N-малеимид, винилсульфон, N-иодацетамид, ортопиридил или N-оксисукцинимид. Мостик может быть также биологически устойчивым или биодеструктируемым и включать, например, полипептид или синтетический олигомер. Мостик может происходить из бифункциональной части молекулы, как дополнительно описано в WO 2005/016973. Подходящий бифункциональный реагент - это, например, бис-NHS. Реагент может иметь общую формулу Z-R ¹-Z, где каждое Z является бифункциональной группой, они могут быть одинаковыми или различными, а R¹ - это бифункциональный органический радикал. Предпочтительно R ¹ выбран из группы, состоящей из алкандиила, арилена, алкарилена, гетероарилена и алкилгетероарилена, каждый из которых может быть замещен или прерван карбонильной, сложноэфирной, сульфидной, простой эфирной, амидной и/или аминной связями. Особенно предпочтителен С₃-С₆алкандиил. Наиболее предпочтительно, R¹ аналогичен соответствующей части подходящего бифункционального реагента.

Предпочтительно полисахаридное производное имеет общую формулу (I):

где m равно по меньшей мере 1;

HNB получено из аминогруппы B-NH₂ на N-конце инсулина или подобного инсулину пептида;

L - связь, соединяющая группа или представляет собой полипептид или синтетический олигомер;

GlyO - единица сиаловой кислоты;

причем соединяющая группа, если она имеется, имеет общую формулу -Y-C(О)-R ¹-C(O)-;

где Y - это NR² или NR²-NR², R¹ - бифункциональный органический радикал, как он определен выше, а R² - это Н или C_1-6 алкил.

В этом аспекте изобретения инсулин присоединен к нередуцирующему концу полисахарида. Концевой единицей полисахарида является единица сиаловой кислоты. Другие сахаридные единицы в полисахариде представлены GlyO и могут быть одинаковыми или различными. Подходящие сахаридные единицы включают гепарин, гиалуроновую кислоту или хондроитин-сульфат.

Если инсулин присоединен непосредственно к полисахариду, группа L представляет собой связь. Однако в качестве альтернативы группа L может происходить из реагента, содержащего N-малеимид, винилсульфон, N-иодацетамид, ортопиридил или N-оксисукцинимид. Реагент может иметь общую формулу Z-R¹-Z, как она определена выше. В этом варианте осуществления изобретения L обычно представляет собой группу:

.

Другой аспект изобретения представляет собой композицию, как она определена выше, которая является фармацевтической композицией и дополнительно содержит один или более из фармацевтически приемлемых наполнителей.

Фармацевтическая композиция может быть в форме водной суспензии. Водные суспензии содержат новые соединения в смеси с наполнителями, пригодными для производства водных суспензий. Фармацевтические композиции могут быть в форме стерильной пригодной для инъекций водной или гомогенной суспензии. Эта суспензия может быть составлена согласно известным в данной области приемам с использованием подходящих диспергирующих или увлажняющих средств или суспендирующих средств.

Фармацевтические композиции можно вводить пригодным для применения у человека и животных способом: перорально, внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно, интраназально, внутрикожно, поверхностно или внутритрахейно.

Композиции могут дополнительно содержать добавку к рецептуре. Под добавкой к рецептуре понимается наполнитель, который способен стабилизировать инсулин либо внутренне, либо внешне, как описано в работе Wang et al (1999). Наполнителем может быть стабилизатор, солюбилизатор или ион металла. Подходящие примеры добавок к рецептуре включают одно или несколько из буферов, стабилизаторов, поверхностно активных веществ, солей, полимеров, ионов металлов, сахаров, полиолов или аминокислот. Они могут использоваться по отдельности или в комбинации.

Стабилизаторы обычно действуют путем дестабилизации денатурированного состояния белка, приводящей к повышению изменения свободной энергии Гиббса для разворачивания белка. Стабилизатором предпочтительно является сахар или полиол, например сахароза, сорбитол, трегалоза, глицерин, маннитол, лактоза и этилен гликоль. Стабилизирующим буфером является фосфат натрия.

Солюбилизатор - это предпочтительно поверхностно активное вещество, предпочтительно неионное поверхностно активное вещество. Подходящие примеры включают твин-80, твин-20, твин-40, Pluoronic F68, Brij 35 и тритон Х100.

Ион металла предпочтительно двухвалентен. Подходящие ионы металлов включают Zn²⁺, Ni²⁺, Co ²⁺, Sr²⁺, Cu²⁺, Са²⁺, Mg²⁺ и Fe²⁺.

Добавкой к рецептуре может быть также полимер, выбранный из ПСК, ПЭГ или окси- -циклодекстрина.

Могут также использоваться консерванты - такие как м-крезол.

Подходящие аминокислоты и производные аминокислот для использования в качестве добавок к рецептуре включают гистидин, глицин, другие подобные аминокислоты и аспартат натрия.

Дальнейшим аспектом настоящего изобретения является соединение, как оно описано выше, для применения в терапии.

В соответствии с дальнейшим аспектом изобретения, авторы предлагают способ получения полисахаридного производного инсулина или подобного инсулину белка, где анионный полисахарид, содержащий 2-125 сахаридных единиц, химически реагирует в основном только с N-концевым амином инсулина или подобного инсулину белка.

Фраза «химически реагирует в основном только с N-концевым амином» обозначает, что в популяции производных (дериватов) по меньшей мере 85%, более предпочитительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочитительно по меньшей мере 95% белков модифицированы (дериватизированы) только по их N-концевому амину на В цепи инсулина.

Получаемые этим способом полисахаридные производные и любые из предпочтительных вариантов осуществления изобретения, как они детализированы ниже, также являются частью настоящего изобретения.

Авторы разработали новый способ конъюгации полисахаридов с белками, где может быть использована высокая реакционная способность N-концевой части белка, и который позволяет избежать получения сложного состава продукта путем применения разработанного способа (фигуры 1 и 2) восстановительного аминирования белков окисленной периодатом природной коломиновой кислоты.

Полисахарид может также реагировать с модифицированной формой инсулина. Например, одна или более из групп инсулина могут претерпеть химическую трансформацию, например, путем восстановления или окисления. Вместо концевой аминогруппы инсулина может быть создан реакционно-способный карбонил путем использования, например, окисляющих условий.

Подходящими полисахаридами для использования в способе согласно настоящему изобретению являются полисахариды, как они описаны перед этим для новых композиций.

Соединения согласно настоящему изобретению могут производиться любым из пригодных способов, описанных ранее в данной области. Например, типичный способ описан в предыдущей патентной заявке авторов WO 92/22331.

Как правило, анионный полисахарид был активирован перед проведением модификации инсулина. Он может, например, иметь реакционно-способную альдегидную группу, а реакция модификации может быть проведена в восстанавливающих условиях. Реакционно-способная альдегидная группа может быть получена контролируемым окислением гидроксильной группы полисахарида. Более предпочтительно, чтобы эта реакционно-способная альдегидная группа была создана в предварительном этапе, в котором полисахарид реагирует в водном растворе при контролируемых условиях окисления, например, при использовании периодата натрия. Предпочтительно, чтобы окисление было химическим окислением, хотя могут быть также использованы ферменты, способные осуществить этот этап. Реакционно-способная альдегидная группа может быть на нередуцирующем конце или на редуцирующем конце полисахарида. Инсулин, как правило N-концом, может затем реагировать с реакционно-способной альдегидной группой с получением аддукта, который после восстановления дает N-концевое производное инсулина.

Активацию полисахарида следует предпочтительно проводить при таких условиях, что не происходит существенного расщепления скелета полисахарида в середине цепи, то есть нет существенного снижения молекулярного веса. Подходящим окислителем является перрутенат (perrhuthenate) или, предпочтительнее, периодат. Окисление можно проводит периодатом при концентрации в диапазоне от 1 мМ до 1 М, при pH в диапазоне от 3 до 10, при температуре в диапазоне от 0 до 60°С в течение времени в диапазоне от 1 мин до 48 ч.

В подходящих для проведения реакции модификации условиях может быть использован водород с катализаторами или, предпочтительно, гидриды - такие как боргидриды. Они могут быть иммобилизованы в таком виде, как боргидрид на смоле Amberlite . Предпочтительно в качестве восстанавливающего средства используют гидриды щелочных металлов - такие как боргидрид натрия, при концентрации в диапазоне от 1 мкМ до 0,1 М, при pH в диапазоне от 4 до 10, при температуре в диапазоне от 0 до 60°С и в течение периода времени в диапазоне от 1 мин до 72 ч. Условия реакции выбирают таким образом, что подвешенные (pendant) карбоксильные группы на исходном материале не восстанавливаются. Другими подходящими восстанавливающими агентами являются цианоборгидрид при кислотных условиях, например цианоборгидрид на полимерном носителе или цианоборгидрид щелочного металла, L-аскорбиновая кислота, метабисульфит натрия, L-селектид, триацетоксиборгидрид и др.

В настоящем изобретении могут найти применение другие активированные производные полисахаридов, в том числе таковые с подвешенными функциональными группами - такими как NHS, как описано в более ранней патентной заявке авторов WO 06/00540.

В одном из вариантов осуществления изобретения реакционно-способный альдегид находится на редуцирующем конце полисахарида, а нередуцирующий конец сделан пассивным, так что он не реагирует с подвешенными группами на инсулине.

Реакционная способность редуцирующего конца коломиновой кислоты, хотя она и невысока по отношению к белковым мишеням, достаточна, чтобы создать трудности в производстве химически идентифицируемых конъюгатов.

Химические реакции, пригодные для приготовления полисахарида с реакционно-способным альдегидом на редуцирующем конце полисахарида, описаны в более ранней патентной заявке авторов WO 05/016974. Способ включает предварительный этап селективного окисления, за которым следуют восстановление и затем дополнительное окисление, чтобы получить соединение с альдегидом на редуцирующем конце и сделанным пассивным нередуцирующим концом.

WO 2005/016973 описывает производные полисиаловой кислоты, которые полезны для конъюгации с белками, особенно такие, которые имеют свободные сульфгидрильные группы. Проводят реакцию соединения сиаловой кислоты с гетеробифункциональным агентом, чтобы ввести подвешенную функциональную группу для сайт-специфической конъюгации с сульфгидрильными группами. Используемые в настоящем изобретении анионные полисахариды могут также быть модифицированы в такой же манере гетеробифункциональным реагентом.

Полисахарид может быть модифицирован до того, как он прореагирует с инсулином. Например, можно провести реакцию полисахарида с бифункциональным реагентом.

Полисахарид может быть подвергнут этапу предварительной реакции, в которой на концевом сахариде, который предпочтительно является сиаловой кислотой, формируется группа, выбранная из первичной аминогруппы, вторичной аминогруппы и гидразина, после чего следует этап реакции, в которой эта группа реагирует с бифункциональным реагентом с образованием промежуточного продукта реакции, как дополнительно описано в WO 2006/016168. Промежуточный продукт может затем реагировать с инсулином или с подобным инсулину пептидом. Бифункциональный реагент может иметь общую формулу Z-R¹-Z, определено выше.

Авторы обнаружили, что определенные условия реакции способствуют селективной модификации на N-конце инсулина. Чтобы ускорить селективную реакцию на N-конце, реакцию модификации следует проводить в первом водном растворе с кислым pH, а получаемое производное полисахарида следует затем очистить во втором водном растворе с более высоким pH, чем у первого водного раствора. Под кислым pH авторы понимают pH ниже 7. Обычно pH первого водного раствора находится в диапазоне 4,0-6,5, предпочтительно 4,0-6,0, а pH второго водного раствора находится в диапазоне 6,5-9,0, предпочтительно 6,5-8,5 или 6,5-8,0. Низкий pH реакции модификации способствует селективной модификации на N-конце белка, а не на каких-либо сайтах в середине цепи.

Кроме того, авторы установили, что использование некоторых добавок к рецептуре способствует образованию селективного, стабильного полисахаридного производного инсулина. Добавка к рецептуре может быть выбрана из одного или более буферов, стабилизаторов, поверхностно активных веществ, солей, полимеров, ионов металлов, сахаров, полиолов или аминокислот. Они могут быть добавлены в реакционную среду или, в качестве альтернативы, могут быть добавлены как стабилизаторы к композиции с конечным продуктом.

В одном из вариантов осуществления изобретения добавкой к рецептуре является сорбитол, трегалоза или сахароза. В другом варианте осуществления изобретения добавкой к рецептуре является неионное поверхностно-активное вещество. В качестве альтернативы, добавкой к рецептуре может быть полимер, выбранный из ПСК, ПЭГ или окси- -циклодекстрина. В другом варианте осуществления добавкой к рецептуре может быть ион двухвалентного металла. Предпочтительные ионы двухвалентных металлов включают Zn²⁺, Ni ²⁺, Co²⁺, Sr²⁺ или Fe²⁺ .

Добавкой к рецептуре может быть буфер. Если добавкой к рецептуре является буфер, предпочтительным буфером является фосфат натрия или ацетат натрия.

Очистку полисахаридного производного в способе согласно настоящему изобретению можно провести с применением различных методов, известных в данной области. Примеры подходящих методов очистки включают хроматографию с гидрофобными взаимодействиями (ХГВ или HIC, от англ. hydrophobia interaction chromatography), гель-проникающую хроматографию (ГПХ или SEC, от англ. size exclusion chromatography), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ или HPLC, от англ. high performance liquid chromatography) и ионообменную хроматографию (ИОХ или IEC, от англ. ion exchange chromatography).

Популяцию полисиаловых кислот, имеющих широкое молекулярно-весовое распределение, можно фракционировать на фракции, имеющие меньшую полидисперсность, то есть на фракции с различающимся средним молекулярным весом. Фракционирование предпочтительно проводят методом анионообменной хроматографии, используя для элюирования подходящий щелочной буфер, как описано в более ранних патентных заявках авторов WO 2005/016794 и WO 2005/03149. Метод фракционирования пригоден для исходного полисахаридного материала, а также для производных. Поэтому эту технику можно применять до или после необходимых этапов способа согласно настоящему изобретению. Предпочтительно, чтобы конечное полисахаридное производное инсулина имело полидисперсность менее 1,1.

Модификация инсулина в соответствии с настоящим изобретением дает удлинение времени полужизни, повышение стабильности, снижение иммуногенности и/или возможность регулировать растворимость и, следовательно, биологическую доступность и фармакокинетические свойства инсулина. Новый способ имеет особое значение для создания конъюгатов монополисиалилированного инсулина.

Краткое описание чертежей

Изобретение иллюстрировано примерами 1-6 со ссылкой на следующие чертежи:

Фиг.1 показывает окисление коломиновой кислоты (полисиаловая кислота со связями -2,8 из Е. coli) периодатом натрия;

Фиг.2 показывает селективное восстановление шиффова основания цианоборгидридом натрия с образованием стабильной необратимой ковалентной связи с аминогруппой белка;

Фиг.3 - электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) конъюгатов KKO-rh-инсулин с молекулярным весом КК 22 кДа (конъюгатов 22 кДа ККО-гП-инсулин) при различных температурах;

Фиг.4 показывает влияние температуры на степень модификации;

Фиг.5 - электрофорез SDS-PAGE конъюгатов 27 кДа KKO-rh-инсулин при различных молярных соотношениях;

Фиг.6 показывает влияние молярного соотношения на степень модификации;

Фиг.7 электрофорез SDS-PAGE конъюгатов KKO-rh-инсулин с молекулярным весом КК 8 и 11 кДа;

Фиг.8 - ВЭЖХ на сульфоэтильной смоле (SE-HPLC) рецептур с 8 кДа ККО-rh-инсулина и инсулина;

Фиг.9 показывает эффективность in vivo рецептур с ККО-инсулином с молекулярным весом КК 10, 15 и 21,5 кДа;

Фиг.10 показывает экспериментальный режим препаративной ВЭЖХ с ИОХ или ХГВ для очистки конъюгата;

Фиг.11 показывает очистку конъюгата ККО-инсулин с помощью хроматографии с гидрофобными взаимодействиями на колонке HiTrap Butyl FF;

Фиг.12 показывает очистку конъюгата ККО-инсулин из пика 2 хроматографии с ХГВ (в качестве примера взят 13 кДа ККО-инсулин) с помощью анионообменной хроматографии на колонке Hitrap Q FF;

Фиг.13 показывает изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) в геле конъюгата ККО-инсулин с молекулярным весом КК 13 кДа и 27 кДа;

Фиг.14 показывает результаты применения in vivo у мышей конъюгата ККО-инсулин; и

Фиг.15 показывает результаты аминокислотного расщепления по Edman.

Примеры

1. Определение белка и коломиновой кислоты

Количественное определение полисиаловых кислот (как сиаловой кислоты) резорциноловым реагентом проводили в соответствии с резорциноловым методом (Svennerholm, 1957) так, как описано в другом месте (Gregoriadis et al., 1993; Fernandes and Gregoriadis, 1996, 1997). Количество белка измеряли колориметрическим методом ВСА (колориметрический метод Bradford) или по поглощению в УФ области при 280 нм.

2. Активация коломиновой кислоты

Свежеприготовленный 0,02 М раствор метапериодата натрия (NaIO4) (8-кратный молярный избыток) смешивали с КК при 20°С и реакционную смесь перемешивали на магнитной мешалке в течение 15 мин в темноте. Затем к реакционной смеси добавляли двукратный объем этиленгликоля, чтобы нейтрализовать избыток NaIO4, и смесь оставляли перемешиваться при 20°С еще в течение 30 мин. Окисленную коломиновую кислоту (ККО) длительно (24 ч) диализовали (предел отсечения у диализных трубок 3,5 кДа) против 0,01% аммоний-карбонатного буфера (pH 7,4) при 4°С. Для концентрирования раствора ККО из диализной трубки использовали ультрафильтрацию (предел отсечения по молекулярному весу 3,5 кДа). После концентрирования до необходимого объема фильтрат лиофилизовали и хранили до дальнейшего использования при -40°С. В качестве альтернативы, ККО извлекали из реакционной смеси осаждением (дважды) этанолом.

3. Определение окисленного состояния КК и производных

Качественную оценку степени окисления коломиновой кислоты производили с помощью 2,4-динитрофенилгидразина (2,4-ДНФГ), который при взаимодействии с карбонильными соединениями дает слаборастворимые 2,4-динитрофенилгидразоны. К реагенту 2,4-ДГНФ добавляли неокисленную или окисленную КК, растворы встряхивали, после чего оставляли стоять при 37°С до появления кристаллического осадка (Shriner et. al., 1980). Степень (количественную) окисления КК измеряли методом (Park and Johnson, 1949), основанным на восстановлении железосинеродистых ионов в щелочном растворе до ионов железистосинеродистого железа (3) (краситель персидский голубой), количество которого затем измеряют при 630 нм. В этом случае в качестве стандарта используют глюкозу.

4. Гель-проникающая хроматография

Образцы коломиновой кислоты (КК и ККО) растворяли в NaNO₃ (0,2М), CH₃CN (10%; 5 мг/мл) и хроматографировали на колонках 2х GMPWXL с детектированием по показателю преломления (система для ГПХ: насос для растворов VE1121 GPC, детектор VE3580 RI и сравнение с помощью программного обеспечения Trisec 3 software (Viscotek Europe Ltd)). Пробы (5 мг/мл) фильтровали через найлоновую мембрану с размером пор 0,45 мкм и пропускали через колонку со скоростью 0,7 см/мин, в качестве подвижной фазы использовали 0,2 М NaNO₃ и CH₃ CN (10%).

5. Стабильность коломиновой кислоты

Правила для химических процессов ПЭГилирования не могут быть применены к полисиалилированию как таковые, ввиду различия физико-химических свойств этих молекул. ПСК - это полимер, лабильный в присутствии кислоты и стабильный в течение недель при pH вблизи нейтрального (фиг.3). Представленные на фиг.3 результаты показывают, что при pH 6,0 и 7,4 ККО стабильна в течение 8 дней, при pH 5,0 наблюдается медленная деструкция (через 48 ч молекулярный вес составлял 92% от исходного), а при pH 4,0 также наблюдается медленная деструкция (через 48 ч молекулярный вес составлял 70% от исходного). Полисиаловая кислота является в высокой степени гидрофобной, тогда как ПЭГ по своей природе представляет собой амфифильную молекулу. Если проводить полисиалилирование в условиях, используемых для ПЭГилирования, во многих случаях наблюдаются агрегация и осаждение белков.

6. Приготовление N-концевых конъюгатов белок-КК с добавками к рецептуре

6.1. Приготовление конъюгатов инсулин-КК (N-концевой способ)

Инсулин (5804 Да) поставлялся в виде белого твердого вещества. Инсулин растворяли в минимальном количестве 100 мМ HCl, затем pH раствора доводили до нужного значения и помещали раствор в лед. Количество КК, которое необходимо добавить для конъюгации, рассчитывали по формуле:

Взвешивали необходимое количество ККО. ККО растворяли в 10 мМ NaOAc, pH 6,0 и аккуратно перемешивали смесь до полного растворения ККО, затем фильтровали в новый контейнер, чтобы удалить весь агрегированный/осажденный материал. К раствору ККО добавляли необходимое количество белкового раствора инсулина, чтобы получить 7,5-кратный молярный избыток (при малом масштабе процесса) и 5-кратный молярный избыток (при масштабированном процессе) ККО, и аккуратно перемешивали в деликатном смесителе при 4±1°С. Добавляли раствор 100 мг/мл NaCNBHs в количестве, необходимом для получения в конечной реакционной смеси концентрации 8 мг/мл, аккуратно перемешивали, проверяя pH конечной реакционной смеси, при необходимости доводили pH до 6,0 добавлением 0,5 М NaOH/HCl при 4±1°С. Окончательный объем реакционной смеси добавлением 10 мМ NaOAc, pH 6,0 доводили до такого, чтобы концентрация белка составляла 1 мг/мл. Пробирку герметически закрывали и встряхивали при требуемой температуре (4±1°С) в течение 24 ч. Реакцию останавливали подходящим способом (таким, как добавление буфера трис(оксиметил)аминометана pH 7,4) и отбирали пробы для SDS-PAGE (использовали 18% гель в трис-глицине), SE-ВЭЖХ (колонка superose 12), проверяя pH реакционной смеси. Чтобы исключить образование осадка, реакционную смесь перед анализом методом SE-ВЭЖХ и очисткой центрифугировали при 13000 об/мин в течение 5 мин, для SE-ВЭЖХ предпочтительным буфером был 0,1 М Na-фосфат (pH 6,9).

6.2. Оптимизация

Для N-концевой и случайной модификации инсулина проводили восстановительное аминирование ККО с молекулярным весом в диапазоне от 10 до 30 кДа. Для реакций конъюгирования применяли набор переменных параметров: молярный избыток ККО 10-20 (для небольшого масштаба) и 5-10 (для крупного масштаба); реагент NaCNBH₃ с концентрацией 50-100 мМ; буфер для реакции 10 мМ NaOAc с pH 5,5-6,5; температура 4±1°С; время реакции 16-24 ч и т.д.

Было установлено, что оптимизированными условиями реакции являются следующие: молярный избыток ККО равен 7,5 (малый масштаб) и 5 (крупный масштаб), концентрация реагента NaCNBH₃ 50 мМ, буфер для реакции 10 мМ NaOAc с pH 5,5, температура 4±1°С, длительность реакции 24 ч.

6.3. Очистка и получение характеристик конъюгатов инсулин-КК (N-концевой способ)

Для удаления из реакционной смеси свободной ККО использовали ХГВ (HiTrap Butyl FF). Раствор для нанесения готовили разбавлением реакционной смеси с инсулином, добавляя минимальный объем концентрированного раствора (NN₄)₂SO₄ (например, 3 М), 20 мМ Na₂HPO₄ (pH 7,4), до конечной концентрации (NH₄)₂SO₄ 0,8 М в растворе для нанесения. Проверяли pH, который должен быть равен 7,4, при необходимости его устанавливали добавлением 0,5 М HCl/NaOH, раствор для нанесения необходимо фильтровать через мембранный фильтр с порами 0,2 мкм.

Затем этот раствор наносили на колонку ХГВ (скорость 0,5 мл/мин), предварительно уравновешенную буфером HIC В (20 мМ фосфат натрия +0,8 М (NH₄) ₂SO₄, pH 7,4). В процессе нанесения собирали фракции (объем каждой фракции составлял 1,5 объема колонки) и метили (L1-Lx), затем колонку промывали буфером HIC В (по меньшей мере 5 объемов колонки, скорость 0,5 мл/мин, объем фракций 1,5 объема колонки), фракции собирали и метили (W1-Wx). Продукт элюировали буфером HIC А (10 мМ натрий-фосфатный буфер, pH 7,4) (скорость 5 мл/мин), фракции собирали (объем каждой фракции 1 объем колонки, всего 6 объемов колонки) и метили (Е1-Ех). Если две последовательные фракции не содержали белка (по поглощению в УФ области при 280 нм), проводили следующий этап. Пробы в ходе очистки держали на льду. Концентрацию белка определяли по УФ поглощению (280 нм) (коэффициент экстинкции раствора инсулина с концентрацией 1 мг/мл был равен приблизительно 1,043 при 280 нм). Отбирали пробы для SDS-PAGE и SE-ВЭЖХ.

Содержащие белок фракции после колонки ХГВ промывали буфером IEC А (20 мМ фосфатный буфер, pH 7,4) в Vivaspin 20 (предел молекулярного веса 5 кДа) для удаления возможных остатков сульфата аммония. Проверяли pH и при необходимости доводили его до pH 7,4. Раствор белка наносили на колонку ИОХ, предварительно уравновешенную буфером IEC А. Систему градиентов применяли следующим образом.

Нанесение: образец наносили со скоростью 0,25 мл/мин в буфере IEC А, промывка 3-кратным объемом колонки;

Помывка: градиентная система: буфер IEC А - 90%, буфер АЕХ В (20 мМ фосфатный буфер +1М NaCl, pH 7,4) - 10%, объем градиента равен 5-кратному объему колонки, затем промывка 3-кратным объемом колонки, скорость протока 0,25 мл/мин;

Буфер IEC А - 68%, буфер IEC В - 32%, объем градиента равен 5-кратному объему колонки, затем промывка 3-кратным объемом колонки, скорость протока 0,25 мл/мин;

Буфер IEC А - 35%, буфер IEC В - 65%, объем градиента равен 5-кратному объему колонки, затем промывка 3-кратным объемом колонки, скорость протока 0,25 мл/мин;

Буфер IEC А - 0%, буфер IEC В - 100%, объем градиента равен 5-кратному объему колонки, затем промывка 3-кратным объемом колонки, скорость протока 0,25 мл/мин.

Содержащие очищенный конъюгат фракции ИОХ объединяли и промывали для удаления соли несколькими сменами буфера PBS. После удаления соли доводили значение pH до 7,4. Затем раствор концентрировали при 4±1°С, концентрацию белка определяли с помощью УФ спектроскопии при 280 нм. Конъюгаты подвергали стерилизующей фильтрации и отбирали пробы для определения активности и анализа с помощью SDS-PAGE и SE-ВЭЖХ. При необходимости отбирали аликвоты для определения количества белка и КК. Остальное хранили до последующего использования при 4±1°С и исследовали физическую стабильность методом SE-ВЭЖХ.

Были исследованы воздействия различных процессов, влияющих на стабильность инсулина в растворе и степень модификации.

6.4. Приготовление конъюгатов инсулина с КК 14 кДа (монодисперсной)

Инсулин (5808 Да) поставлялся в виде белого твердого вещества. Инсулин растворяли в минимальном количестве 100 мМ HCl, затем pH раствора доводили до нужного значения и помещали раствор в лед. Количество КК 14 кДа, которое необходимо добавить для конъюгации, рассчитывали по формуле:

Взвешивали необходимое количество ККО 14 кДа. ККО 14 кДа растворяли в 10 мМ фосфатном буфере, pH 6,0 (здесь использовали 20%-ный объем от конечного объема реакционной смеси), аккуратно перемешивали смесь до полного растворения ККО 14 кДа, затем фильтровали ее в новый контейнер, чтобы удалить весь агрегированный/осажденный материал. К раствору ККО 14 кДа добавляли необходимое количество белкового раствора инсулина, чтобы получить 7,5-кратный молярный избыток (при малом масштабе процесса) и 5-кратный молярный избыток (при масштабированном процессе) ККО 14 кДа, и аккуратно перемешивали в деликатном смесителе при 4±1°С. Добавляли раствор 100 мг/мл NaCNBH₃ в количестве, необходимом для получения в конечной реакционной смеси концентрации 63,5 мМ или 4 мг/мл, аккуратно перемешивали, проверяя pH конечной реакционной смеси, при необходимости доводили pH до 6,0 добавлением 0,5 М NaOH/HCl при 4±1°С. Окончательный объем реакционной смеси добавлением 10 мМ NaOAc, pH 6,0 доводили до такого, чтобы концентрация белка в реакционной смеси составляла 1 мг/мл. Пробирку герметически закрывали и встряхивали при требуемой температуре (4±1°С) в течение 24 ч. Реакцию останавливали подходящим способом и отбирали пробы для SDS-PAGE (использовали 18% гель в трис-глицине) и SE-ВЭЖХ (колонка superose 12), проверяя pH реакционной смеси. Чтобы исключить образование осадка, реакционную смесь перед анализом методом SE-ВЭЖХ и очисткой центрифугировали при 13000 об/мин в течение 5 мин, для SE-ВЭЖХ предпочтительным буфером был 0,1 М Na-фосфат (pH 6,9).

6.5. Оптимизация

Восстановительное аминирование инсулина проводили с набором КК различного молекулярного веса (10-30 кДа) при N-концевой и случайной модификации. Для реакций конъюгирования применяли набор переменных параметров: молярный избыток ККО 10-20 (для небольшого масштаба) и 5-10 (для крупного масштаба); реагент NaCNBH₃ с концентрацией 50-100 мМ; буфер для реакции 10 мМ фосфатный буфер с pH 5-7,4; температура 4-37±1°С; время реакции 16-24 ч и т.д.

Было установлено, что оптимизированными условиями реакции являются следующие: молярный избыток ККО равен 7,5 (малый масштаб) и 5 (крупный масштаб), концентрация реагента NaCNBH₃ 63,5 мМ (4 мг/мл), буфер для реакции 10 мМ фосфат с pH 6,0, температура 4±1°С, длительность реакции 24 ч.

6.6. Очистка и получение характеристик конъюгатов инсулин-КК (N-концевой способ)

Для удаления из смеси свободной ККО применяли ХГВ. Раствор для нанесения готовили разбавлением реакционной смеси с инсулином добавлением минимального объема концентрированного раствора (NH ₄)₂SO₄ (например, 3 М) в 20 мМ Na ₂HPO₄ (pH 7,4), чтобы получить в растворе для нанесения концентрацию (NH₄)₂SO₄ 0,8 М. Проверяли pH и если он отличался от 7,4, добавляли 0,5 М HCl/NaOH. Раствор для нанесения фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм.

Затем этот раствор наносили на колонку ХГВ (скорость 0,5 мл/мин), предварительно уравновешенную буфером HIC В (20 мМ фосфат натрия +0,8 М (NH ₄)₂SO₄, pH 7,4). При нанесении фракции собирали (объем каждой фракции составлял 1,5 объема колонки) и метили (L1-Lx). Колонку промывали буфером HIC В (общий объем не менее 5 объемов колонки, скорость 0,5 мл/мин), собирали фракции (объем каждой фракции составлял 1,5 объема колонки) и метили (W1-Wx). Продукт элюировали буфером HIC А (10 мМ фосфат натрия, pH 7,4) со скоростью 5 мл/мин, (объем элюента равен 6 объемам колонки), собирали фракции (объем каждой фракции равен одному объему колонки) и метили (Е1-Ех). Если в двух последовательных фракциях белок не обнаруживался (по УФ поглощению при 280 нм), проводили следующий этап. Пробы в ходе очистки держали на льду. Количество белка определяли по УФ поглощению при 280 нм (коэффициент экстинкции раствора инсулина с концентрацией 1 мг/мл равен приблизительно 1,043 при 280 нм). Отбирали пробы для SDS-PAGE и SЕ-ВЭЖХ.

Содержащие белок фракции после колонки ХГВ промывали буфером IEC А (20 мМ фосфатный буфер, pH 7,4) в Vivaspin 20 (предел молекулярного веса 5 кДа) для удаления возможных остатков сульфата аммония. Проверяли pH и при необходимости доводили его до pH 7,4. Раствор белка наносили на колонку ИОХ, предварительно уравновешенную буфером IEC А. Систему градиентов применяли следующим образом.

Нанесение: образец наносили со скоростью 0,25 мл/мин в буфере IEC А, промывка 3-кратным объемом колонки;

Помывка: градиентная система: буфер IEC А - 90%, буфер АЕХ В (20 мМ фосфатный буфер +1М NaCl, pH 7,4) - 10%, объем градиента равен 5-кратному объему колонки, затем промывка 3-кратным объемом колонки, скорость протока 0,25 мл/мин;

Буфер IEC А - 68%, буфер IEC В - 32%, объем градиента равен 5-кратному объему колонки, затем промывка 3-кратным объемом колонки, скорость протока 0,25 мл/мин;

Буфер IEC А - 35%, буфер IEC В - 65%, объем градиента равен 5-кратному объему колонки, затем промывка 3-кратным объемом колонки, скорость протока 0,25 мл/мин;

Буфер IEC А - 0%, буфер IEC В - 100%, объем градиента равен 5-кратному объему колонки, затем промывка 3-кратным объемом колонки, скорость протока 0,25 мл/мин.

Содержащие очищенный конъюгат фракции ИОХС объединяли и промывали для удаления соли несколькими сменами буфера PBS. После удаления соли доводили значение pH до 7,4. Затем раствор концентрировали при 4±1°С, концентрацию белка определяли с помощью УФ спектроскопии при 280 нм. Конъюгаты подвергали стерилизующей фильтрации и отбирали пробы для определения активности и анализа с помощью SDS-PAGE и SE-ВЭЖХ. При необходимости отбирали аликвоты для определения количества белка и КК. Остальное хранили до последующего использования при 4±1°С и исследовали физическую стабильность методом SЕ-ВЭЖХ.

Были исследованы воздействия различных процессов, влияющих на стабильность инсулина в растворе и степень модификации.

6.7. SE-ВЭЖХ рецептур с инсулином

ВЭЖХ проводили на хроматографе Liquid Chromatograph (JASCO), снабженном блоком автоматического отбора образцов Jasco AS-2057 plus с охлаждением при 4°С и детектором Jasco UV-975 UV/VIS. Данные регистрировали с помощью программного обеспечения EZchrom Elite software на персональном компьютере IBM. Пробы SE-хроматографии анализировали на колонке Superose 12 с применением в качестве изократической подвижной фазы 0,1 М фосфата Na, pH 6,9 (фиг.8). Фиг.8 показывает только один пик при времени удержания RT=75,408, который приписан инсулину.

6.8. Электрофорез в полиакриламидном геле с SDS и вестерн-блотирование

SDS-PAGE проводили в 18% гелях с трис-глицином. Пробы разбавляли восстанавливающим или невосстанавливающим буфером, в каждую ячейку наносили 5,0 мкг белка. Электрофорез вели в трис-глициновой системе, гели окрашивали кумасси голубым (фигуры 5 и 7). Вестерн-блотирование проводили с использованием антител к полисиаловой кислоте. Фиг.4 показывает результаты SDS-PAGE рецептур с инсулином (сайт-специфическая, N-концевая модификация).

6.9. Изоэлектическое фокусирование (ИЭФ) в геле конъюгатов ККО-инсулин с 27 кДа и 13 кДа КК

Для определения различий в изоэлектрических точках инсулина и конъюгатов инсулина с ККО был использован гель Novex® IEF. Пробы растворяли до концентрации 0,5 мг/мл. Образцы объемом 5 мкл разбавляли 5 мкл буфера Novex IEF Sample Buffer pH 3-10, затем пробу белка наносили на гель.

6.10. Исследование стабильности

Стерильные конъюгаты инсулина хранили в буфере PBS при 4°С в течение 6 недель. Каждую неделю проводили PAGE образцов в нативных условиях.

6.11. Активность рецептур с инсулином in vivo

Активность рецептур с инсулином in vivo изучали на самках мышей линии CD-1 с возрастом 7-8 недель. Дозы белка 0,3 Ед (с одинаковой активностью) вводили мышам подкожно. Животных разделяли по 4 особи на 7 групп. Каждому животному из каждой группы вводили рецептуры с инсулином следующим образом: инсулин (0,3 Ед/мышь), конъюгат инсулина с ПСК (14 кДа) Lantus (Aventis), PBS. У каждого животного отбирали каплю крови для измерения содержания глюкозы в крови тестом ACCU-CHEK Active (Roche Diagnostics).

Результаты

Активация КК и определение степени окисления

Использовали коломиновую кислоту (КК) - линейный гомополимер с -2,8 связями остатков N-ацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac). Окисление коломиновых кислот проводили путем обработки 20 мМ периодатом в течение 15 мин при комнатной температуре. Сохранность внутренних связей -2,8 между остатками Neu5Ac после обработки периодатом анализировали с помощью гель-проникающей хроматографии, полученные для окисленного материала (ККО) хроматограммы сравнивали с хроматограммами нативной КК. Было установлено, что профили элюции окисленной и нативной КК почти идентичны и не свидетельствуют о том, что этап окисления приводит к заметной фрагментации полимерной цепи.

Количественное измерение степени окисления КК проводили методом восстановления феррицианидного иона до ферроцианида (прусский голубой) в щелочном растворе (Park and Johnson, 1949) с использованием глюкозы в качестве стандарта. Было установлено, что окисленная коломиновая кислота содержит восстанавливающий агент в количестве, большем стехиометрического (>100%), то есть кажущееся содержание альдегида составляло 112 мольных %, что включало объединенный восстанавливающий потенциал хемикеталя на редуцирующем конце и введенного альдегида (на другом конце).

Оптимизация реакции полисиалилирования

Оптимизацию условий полисиаллирования проводили в реакции rh-инсулина с ККО, варьируя температуру, молярное соотношение реагентов и длину цепи. Результаты представлены на фигурах 5-12. Было установлено, что оптимальная температура для стабильности ККО и инсулина в ходе реакции составляет 4°С. Однако при более высокой температуре можно достигнуть большей степени конъюгации, и молярное отношение ККО к инсулину 7,5:1 более эффективно.

В таблице 1 представлена зависимость степени полисиалилирования от молярного отношения.

Таблица 1
№ ячейки	1	3	5	7	8	11	12
Молярное отношение	1:1	1:2	1:4			1:7,5	1:10
Мол. вес ККО	27 кДа ККО с 100% СНО
Инсулин (мг)	1	1	1		1	1
ККО (мг)	4,49	8,98	17,96		33,675	44,9
Конечная конц. NaCNBH3		4 мг/мл
Реакция		4
РН		6

По отношению к контролю PBS наиболее эффективным среди конъюгатов, представленных на фиг.9, в снижении уровня глюкозы в крови мышей был конъюгат ККО-инсулин с КК 21,5 кДа.

В таблице 2 представлены результаты Т-теста (статистический анализ, парный тест) эффективности in vivo конъюгатов ККО-инсулин с различной длиной цепи КК.

Таблица 2
Время (мин)	0,0	32,0	64,5	99,4	170,8	230,2	303,3	358,0	1354,9
13 кДа ККО-исулин		**	***	***
21 кДа ККО-исулин			***	***		*
27 кДа ККО-исулин		**	***	**		**			**
32 кДа ККО-исулин		***	***	***					*
инсулин		***	***	***
Звездочки обозначают уровень значимости различий между группами по отношению к трис-буферу: *Р<0,05, **Р<0,01, ***Р<0,001.

Таблица 3
	Lantus	15 кДа ККО-инсулин (Sigma)
0
30	***	**
60	***	***
90	**	***
120	*	**
150		*
210
270
330
Звездочки обозначают уровень значимости различий между группами по отношению к буферу PBS: *Р<0,05, **Р<0,01, ***Р<0,001.

Изучение влияния pH на активность in vivo конъюгата 15 кДа ККО-инсулин также подтвердило, что pH 6,0 лучше, чем pH 7,4. Поэтому последующий опыт был проведен при pH 6,0. Данные пептидного картирования и расщепления по Edman дополнительно подтвердили, что конъюгат, полученный полисиалилированием при pH 6,0, специфически модифицирован на N-конце В-цепи инсулина.

Приготовление, очистка и получение характеристик конъюгатов инсулина

Инсулин может быть успешно конъюгирован с монодисперсной ККО. Конъюгаты высокой степени чистоты были получены с помощью масштабированной ХГВ и ИОХ. Эффективность очистки была повышена комбинацией ИОХ и ХГВ с применением установки для препаративной ВЭЖХ, как показано на фиг.10.

Процедура для приготовления и очистки конъюгатов коломиновой кислоты (КК) с инсулином с селективной модификацией на N-конце путем проведения реакции при пониженном pH (pH 6,0) и при 4±1°С подробно описана выше. Она включает конъюгирование в присутствии цианоборгидрида натрия, затем очистку с помощью хроматографии на основе гидрофобного взаимодействия (ХГВ) для удаления свободной КК (фиг.11), после чего удаление инсулина с помощью ионообменной хроматографии (ИОХ) (фиг.12). Низкий pH применяли для обеспечения селективной модификации на N-конце В-цепи инсулина (PheB1), a также для того, чтобы свести к минимуму агрегацию инсулина в ходе реакции. Состав окончательного буфера для реакции был следующим: инсулин 1 мг/мл, NaCNBH₃ 8 мг/мл и 5-кратный молярный избыток ККО в 10 мМ NaOAc при pH 6,0.

Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) в геле конъюгатов ККО-инсулин с 13 кДа и 27 кДа КК (фиг.13) показало, что конъюгат полисиалилированного инсулина не имеет фиксированной изоэлектрической точки (pl).

Образование конъюгатов инсулин-КК и стабильность были подтверждены SE-ВЭЖХ (изменение времени задержки конъюгата инсулина с ПСК в сравнении с инсулином, а также совместное элюирование обеих частей молекулы), ионообменной хроматографией (связывание конъюгатов на колонке ИОХ) и электрофорезом в полиакриламидном геле (SDS-PAGE, сдвиг зон в сторону большего молекулярного веса).

У конъюгатов инсулина, использованных для оценки эффективности in vivo (на мышах CD-1 со средним весом 25 г), обнаружены повышенная по сравнению с инсулином активность in vivo (продление) и отсечка (укороченный профиль пика). Продление способности конъюгатов снижать уровень глюкозы в крови было пропорционально длине цепи использованного в рецептуре полимера, как показано на фиг.14.

Изучение стабильности конъюгатов 27 кДа ККО-инсулин показало, что в ходе хранения в течение 40 дней при 4°С не происходило никакой деструкции, как следовало из электрофореза PAGE в нативных условиях.

Получение характеристик полученных и очищенных в масштабированном режиме конъюгатов ККО-инсулина с 14 кДа КК

В этом примере с помощью масштабированной очистки на колонке из 700 мг инсулина в качестве исходного материала было получено 230 мг (вес массы белка) конъюгата 14 кДа ККО-инсулин.

Сравнение хроматограмм на фиг.15 показывает различия в количестве аминокислот, что относится к аминокислотам N-конца. Водную пробу с концентрацией 1 мг/мл в PBS pH 7,4 разбавляли водой в 100 раз. Для анализа отбирали 2 мкл этого разбавленного раствора. В итоге последовательность G-I-V-Е указывала на А-цепь инсулина. Отсутствие аминокислот Phe/Val/Asn/Gln свидетельствовало о том, что В-цепь инсулина была закрыта на N-конце.

Было установлено, что конъюгаты с ПСК активны в анализе на активность in vitro. Изучение активности in vivo показало, что активность конъюгатов ПСК-инсулин значительно превышает активность инсулина.

Литература

Geiger et al. (in D.Branderburg, and A.Wollmer (eds.), (1980), Insulin: Chemistry, Structure, and Function of Insulin and Related Hormones, Walter de Gruyter & Co., New York, P409-415.

Ehrat M., Luisi P.L, (1983), Synthesis and spectroscopic characterization of insulin derivatives containing one or two poly(ethylene oxide) chains at specific positions, Biopolymers, 22: P.569-573.

Caliceti P, (1999) Improvement of the physicochemical and biopharmaceutical properties of insulin by poly(ethyleneglycol) conjugation, STP Pharma Sciences, 9: P.107-113.

Uchio, Т., Baudys, M., Liu, F., Song, S.C., Kim, S.W., (1999) Site-specific insulin conjugates with enhanced stability and extended action profile., Advanced Drug Delivery Reviews, 35: P.289-306.

Hinds K,. Koh J.J, Joss L, Liu F., Baudys M. Kim, S.W., (2000)."Synthesis and Characterization of Poly(ethylene glycol)-lnsulin Conjugates", Bioconjugate Chem., 11: 195-201.

Hinds K.D.; Kim S.W. (2002), Advanced Drug Delivery Reviews, 54: 505-530.

Fernandes, A.I., Gregoriadis, G., (1996) Synthesis, characterization and properties of polysialylated catalase, Biochimica et Biophysica Acta, 1293: 92-96.

Fernandes, A.I., Gregoriadis, G., (1997) Polysialylated asparaginase: preparation, activity and pharmacokinetics, Biochimica et Biophysica Acta, 1341: 26-34.

Jain, S. et al. (2003) Polysialylated insulin: synthesis, characterisation and biological activity in vivo, Biochimica et Biophysica Acta, 1662: 42-49;

Gregoriadis, G., McCormack, В., Wang, Z., Lifely, R., (1993) Polysialic acids: potential in drug delivery, FEBS Letters, 315: 271-276.

Park, J.T., Johnson, M.J., (1949) A submicrodetermination of glucose, Journal of Biological Chemistry, 181: 149-151.

Shriner, R. L, Fuson, R.D.C., Curtin, D.Y., Morill, T.C., (1980) The Systematic Identification of Organic Compounds, 6th ed., Wiley, New York.

Svennerholm, L., (1957) Quantitative estimation of sialic acid II: A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method, Biochimca et Biophysica Acta, 24: 604-611.

Wang, W., (1999) Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals, International Journal of Pharmaceutics, 185: 129-188.