способ определения антибактериальной резистентности организма человека

Формула изобретения

Способ определения антибактериальной резистентности организма человека при заболеваниях, вызванных стафилоккоковой инфекцией, основанный на исследовании нейтрофилов крови, отличающийся тем, что функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов периферической крови пациента исследуют с помощью хемилюминесцентного анализа, определяют индекс бактериальной активации нейтрофилов (ИБА-индекс), представляющий собой отношение площади под кривой, индуцированной бактериями Staphylococcus epidermidis хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов, к площади под кривой спонтанной хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов, и при величине этого индекса ниже 1,47 определяют высокий уровень антибактериальной резистентности, а при величине равной 1,47 и выше - низкий уровень антибактериальной резистентности организма.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для оценки неспецифической антибактериальной резистентности организма человека.

Известен метод определения неспецифической антибактериальной резистентности организма [RU 2068997 C1, опубл. 10.11.1996]. Сущность изобретения состоит в том, что перед подготовкой мазков готовят культуру бактерий Serratia marcescens для использования ее в качестве объекта фагоцитоза, опсонизируют бактериальную взвесь сывороткой здоровых лиц, инкубируют опсонизированную и неопсонизированную культуру бактерий с лейкоконцентратом больных, исследуют суммарную цитохимическую активность миелопероксидазы и катионных белков до и после инкубации, после чего рассчитывают индекс стимуляции нейтрофилов. При величине индекса 0,5 и ниже определяют снижение антибактериальной резистентности организма. Недостатком метода является длительность его выполнения и необходимость микроскопической оценки активности ферментов, что снижает точность и объективность способа.

Задачей изобретения является создание нового информативного способа определения антибактериальной резистентности организма человека.

Задача достигается тем, что с помощью хемилюминесцентного анализа исследуют функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов периферической крови пациента, определяют индекс бактериальной активации нейтрофильных гранулоцитов (ИБА-индекс), представляющий собой отношение площади под кривой хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов, индуцированной бактериальной суспензией Staphylococcus epidermidis, к площади под кривой спонтанной хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов. При величине этого индекса ниже 1,47 определяют высокий уровень антибактериальной резистентности, а при величине, равной 1,47 и выше, - низкий уровень антибактериальной резистентности организма человека.

Низкая антибактериальная резистентность характеризуется увеличением восприимчивости организма к бактериальным инфекциям; увеличением длительности заболевания и присоединением сопутствующих бактериальных инфекций, а также утяжелением острого периода и быстрым переходом заболевания в хроническую форму. Цифра 1,47 получена опытным путем на основании сопоставления данных проведенного хемилюминесцентного анализа, результатов медицинского обследования и данных о последующих обострениях хронической бактериальной инфекции.

Активированные нейтрофильные гранулоциты являются мощными эффекторами и запускают механизмы каскадных реакций, обеспечивающих развитие воспаления. Противоинфекционное действие нейтрофильных гранулоцитов связано, главным образом, с генерацией активных форм кислорода, а одним из методов, позволяющих оценить кислородзависимую биоцидность нейтрофильных гранулоцитов, является хемилюминесцентный анализ. Нейтрофильные гранулоциты несут на своей поверхности широкий спектр рецепторов, часть из которых может взаимодействовать с неопсонизированными бактериями (CR- и Toll-рецепторы). Фагоцитоз без опсонизации связан с наличием у микробов особых факторов вирулентности, с помощью которых они проникают в клетки. Фагоцитоз является одной из главных систем защиты организма от чужеродных агентов и играет важную роль при гнойно-воспалительных заболеваниях, особенно при стафилококковой инфекции. Несомненным преимуществом метода является применение в качестве индуктора бактерий Staphylococcus epidermidis, которые способны вызывать тяжелые воспалительные заболевания.

Способ осуществляют следующим образом. Из венозной крови обследуемого пациента выделяют нейтрофильные гранулоциты. Для этого к 5 мл крови с гепарином добавляют 1 мл полиглюкина. Смесь инкубируют в течение 30 мин при 37°С для ускорения осаждения эритроцитов. Полученный лейкоцитарный супернатант дважды отмывают в растворе Хенкса без фенолового красного по 10 мин при 400 g. Супернатант сливают, оставшиеся нейтрофильные гранулоциты разводят в 1 мл раствора Хенкса и получают взвесь. Подсчитывают количество нейтрофильных гранулоцитов в камере Горяева. Для проведения хемилюминесцентного анализа используют следующие реактивы: донорскую сыворотку (группа крови АВ, резус-фактор отрицательный), раствор Хенкса (без фенолового красного), люминол в концентрации 100 мкг/мл. Готовят пробу: 200 мкл взвеси нейтрофильных гранулоцитов, 20 мкл донорской сыворотки, 240 мкл раствора Хенкса, 50 мкл люминола и 40 мкл бактериальной суспензии Staphylococcus epidermidis в концентрации 10⁶ КОЕ/мл. Хемилюминесцентный анализ проводят в двух кюветах: спонтанная хемилюминесценция осуществляется без добавления индуктора, во вторую кювету добавляют бактериальную суспензию Staphylococcus epidermidis. Измерение хемилюминесцентного ответа осуществляют при помощи хемилюминесцентного анализатора, например «CL3604», в течение 90 мин. Регистрацию результатов и управление хемилюминесцентным анализатором осуществляют через компьютер. Получают кривые спонтанной и индуцированной бактериями хемилюминесценции. Индекс бактериальной активации нейтрофилов (ИБА-индекс) определяют по формуле:

ИБА=S_{индуцированная}/S_{спонтанная},

где:

S_{индуцированная} - величина площади под кривой хемилюминесценции, индуцированной бактериальной суспензией Staphylococcus epidermidis;

S_{спонтанная} - величина площади под кривой спонтанной хемилюминесценции.

При ИБА-индексе ниже 1,47 диагностируют высокий уровень антибактериальной резистентности, при ИБА-индексе, равном 1,47 или выше, - низкий уровень антибактериальной резистентности организма.

Данный метод апробирован на 12 больных хроническим гайморитом, поступивших на лечение в ЛОР-отделение НУЗ "Дорожная клиническая больница" на ст.Красноярск ОАО РЖД, и на 45 здоровых лицах. Результаты обследования представлены в табл.1.

По результатам исследования установлено, что у всех 45 здоровых лиц величина ИБА-индекса ниже 1,47 (100% совпадение). У 11 больных также отмечено совпадение результатов анализа. У 1 больного величина индекса ниже 1,47. Таким образом, совпадение метода определения антибактериальной резистентности у больных хроническими гайморитами составляет 91,7%. При статистическом анализе (с подсчетом медианы (Me) и интерквартильного разброса (С₂₅-С₇₅)) установлены статистически достоверные различия (Р<0,001) по уровню ИБА в группах здоровых и больных людей (табл.2).

Таблица 2
Уровень ИБА в группах здоровых и больных лиц
Группы	N	Me	C25	C75
Здоровые	45	0,930000	0,630000	1,330000
Больные	12	1,700000	1,640000	2,055000

Клинический пример 1. Больной И., 43 г. История болезни № 2149. Поступил на стационарное лечение в ЛОР-отделение НУЗ "Дорожная клиническая больница" на ст. Красноярск ОАО РЖД с диагнозом хронический риносинусит. При поступлении состояние больного средней степени тяжести, беспокоят слабость и головные боли. Проведено исследование заявляемым способом. ИБА равен 1,96 (выше 1,47). Следовательно, у обследуемого низкий уровень антибактериальной резистентности. Клинический пример 2. Пациент С., 41 год, был обследован всеми основными врачами-специалистами, включая врача-инфекциониста и врача-иммунолога, при проведении профилактического осмотра сотрудников ОАО "Горэлектрсвязь" на базе клиники НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН. Признан здоровым. Проведено исследование заявляемым способом.

ИБА равен 1,15 (ниже 1,47). Следовательно, у обследуемого высокий уровень антибактериальной резистентности.

Технический результат предлагаемого способа:

- автоматизированное определение функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов;

- оценка результатов не зависит от субъективных факторов.

Таким образом, способ информативен, точен, отвечает современным требованиям к методам лабораторной диагностики, позволяет значительно упростить процесс определения факторов неспецифической защиты организма, его функциональной активности и резервных возможностей, дает возможность выявить недостаточность фагоцитарной защиты и ее реактивной или патологической активации.