биологический препарат, подавляющий развитие планктонных и биопленочных форм микроскопических водорослей в водной среде

Формула изобретения

Биологический препарат, подавляющий развитие планктонных и биопленочных форм микроскопических водорослей в водной среде, который получают путем смешивания активного начала в виде культуральной жидкости штамма бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-10531 с носителем в виде гранул вспученного перлитового песка в соотношении, мас.%: от 4:1 до 3:2, с последующим высушиванием.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к промышленной биотехнологии, в частности производству и применению биологических средств борьбы с микроскопическими водорослями.

Массовое развитие микроскопических водорослей (микроводорослей) является серьезной экономической и социальной проблемой. Микроскопические водоросли могут существовать в двух состояниях - суспендированном (планктонном) и в виде биологической пленки («мата»). Физиологические и биохимические свойства микроводорослей в этих состояниях существенно различаются. Высокая антропогенная нагрузка на водные источники в результате поступления промышленных, хозяйственно-бытовых и сельскохозяйственных сточных вод приводит к загрязнению водоемов за счет роста и развития различных видов микроскопических водорослей (микроводорослей) и, прежде всего, сине-зеленых водорослей (цианобактерий). Увеличение численности микроводорослей в водоемах приводит к неблагоприятным последствиям, таким как образование трехмерных структурированных биологических пленок («матов»), что проявляется в «цветении» воды. «Цветение» водоемов сопровождается последующим отмиранием избыточной биомассы микроводорослей, выделением токсинов, нарушением кислородного режима, органолептическими проявлениями гниения. Процесс разложения и гниения составляющих биопленки («маты») микроводорослей сопровождается выбросом в воду ряда токсических соединений (фенолов, индола, скатола). Высокая численность клеток микроводорослей при их отмирании может приводить к гипоксии и гибели многих аэробных организмов [1-3]. Некоторые виды микроводорослей продуцируют ряд специфических токсинов, в том числе нейро- и гепатотоксины, представляющие серьезную угрозу здоровью людей и животных. Антидотов к токсинам микроводорослей не существует. Микроводоросли вызывают ряд аллергических заболеваний. В связи с глобальным потеплением климата планеты широкое распространение микроводорослей приобретает характер глобальной мировой проблемы [4]. Серьезный экономический ущерб, а также токсическое воздействие микроводорослей на окружающую среду диктует необходимость разработки методов подавления развития микроскопических водорослей и прогнозирования состояния водных экосистем.

В настоящее время известны различные физические, химические и биологические средства подавления развития микроводорослей.

Ультрафиолетовое облучение, ультразвук, электролиз воды направлены на создание условий, либо препятствующих развитию водорослей, либо разрушающих уже образовавшиеся сообщества микроводорослей - «маты». Ультразвуковая обработка «цветущей» воды хотя и является достаточно эффективной, приводит к нежелательным последствиям (снижает рН, количество общего азота и фосфора в воде и повышает температуру воды), а электролиз воды связан с большими финансовыми затратами [5, 6], в широких масштабах их не используют.

Химические гербициды с альгицидными свойствами (диурон, симазин, атразин) способны снижать численность водорослей, однако их отрицательное влияние на водные биоценозы, выражающееся в отсутствии избирательности действия, летальном, мутагенном и тератогенном эффектах, фактически исключает возможность использования этих веществ.

Альтернативой для подавления развития микроводорослей в водной среде является применение биологических средств на основе бактерий и их метаболитов, обладающих альгицидными свойствами. Известны штаммы бактерий, подавляющие развитие микроводорослей [7-13], однако сведений о биологических препаратах на основе таких бактерий в источниках информации не обнаружено.

Задача заявляемого изобретения: разработать биологический препарат, подавляющий развитие в водной среде различных форм микроводорослей.

Задача решена путем разработки биологического препарата «Алгалат», подавляющего развитие планктонных и биопленочных форм микроскопических водорослей в водной среде, полученного путем смешивания активного начала в виде культуральной жидкости штамма бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-10531 с носителем в виде гранул вспученного перлитового песка в соотношении, в мас.%: от 4:1 до 3:2, с последующим высушиванием.

Процедура приготовления «Алгалата».

1. Среда для культивирования штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-10531

Штамм бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-10531 культивировали в среде NBY следующего состава (мас.%): питательный бульон «Difco» - 0,8; дрожжевой экстракт «Difco» - 0,3; вода - остальное, рН доводили до 7,0.

Для приготовления агаризованной питательной среды в жидкую среду NBY вносили агар-агар (2,0 мас.%).

2. Свойства носителя для иммобилизации активного фактора

В качестве носителя для иммобилизации активного начала культуральной жидкости бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-10531 выбран вспученный перлитовый песок, который производится из натуральной горной породы, подвергнутой тепловой обработке при температуре 900-1200°С, и представляет собой легкие пористые гранулы жемчужно-белого цвета размером от 0,16 до 1,25 мм с насыпной плотностью от 75 до 100-150 кг/м ³ [14]. Вспученный перлитовый песок - природный материал, обладающий необходимыми потребительскими свойствами для создания биопрепарата: стерилен, химически инертен, легкий, сыпучий, не слеживается, негорючий, биологически стойкий и экологически чистый, не подвержен процессам гниения, воздухо- и водопроницаем, обладает высокими адсорбционными свойствами и может впитывать до 400% воды по массе. Гранулы вспученного перлитового песка обладают хорошей плавучестью, что позволяет препарату долго держаться на поверхности, постепенно погружаясь в воду, сохраняя эффективность в течение длительного срока действия.

3. Состав и преимущества биологического препарата «Алгалат»

Препарат состоит из культуральной жидкости штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-10531, включающей комплекс спор, вегетативных клеток (с титром КОЕ/мл от 8×10⁸ до 1-2×10⁹) и продуктов метаболизма, и гранул вспученного перлитового песка, на которых этот комплекс иммобилизован.

Преимуществом заявляемого препарата «Алгалат» является то, что он хорошо хранится, удобен для транспортировки, дает стабильный объем, не слеживается, а альгицидные свойства проявляет в воде.

Изобретение подтверждено следующими примерами.

Пример 1

Культивирование альгицидного штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-10531

Для культивирования штамма ВКПМ В-10531 использовали стандартные стеклянные конические плоскодонные колбы Эрленмейера объемом 750 см³, в которые вносили 50-100 мл стерильной среды. Среду NBY готовили на дистиллированной воде, доводили значение рН до 7,0; разливали в колбы по 50 мл и стерилизовали при давлении 0,8 атм, температуре 120°С в течение 30 мин. После стерилизации колбы охлаждали до +20°С. Стерильность и рН среды контролировали путем отбора соответствующих проб. В качестве посевного материала использовали 5-10 мл культуры ВКПМ В-10531, полученной при культивировании в среде NBY в течение 16 часов при 30°С при встряхивании 250 об./мин. Отсутствие посторонней микрофлоры контролировали микроскопически. Продуктивность штамма определяли методом серийных разведений с последующим высевом на агаризованную среду. Конечный титр составлял 1×10⁹ КОЕ/мл.

Пример 2

Культивирование микроскопических водорослей

Использовали штаммы азотфиксирующих нитчатых видов микроскопических водорослей цианобактерий: Anabaena sp. 5781 - штамм получен с кафедры микробиологии Ленинградского государственного университета; Nostoc sp. A-10 - получен из коллекции IМЕТ, Йена, ГДР. Штаммы не фиксирующих азот одноклеточных цианобактерий Microcystis aeruginosa 562 и 905 получены из Института гидробиологии Китайской Академии наук (провинция Хубей, г.Ухань).

Штаммы цианобактерий Anabaena и Nostoc выращивали в модифицированной среде BG-11 [15].

Штаммы Microcystis aeruginosa 562 и 905 выращивали в среде В-12 [16].

Микроводоросли культивировали в стеклянных плоскодонных колбах емкостью 250 мл в 100 мл среды без аэрации при температуре 20°С и круглосуточном освещении в течение двух недель. Использовали люминесцентные лампы дневного белого света СВЕ ЛБУ-30, которые обеспечивали освещенность 40 мкмоль квантов·м²·с ¹ в области ФАР (Фотосинтетическая Активная Радиация).

Пример 3

Приготовление препарата «Алгалат»

Для приготовления препарата культуральную жидкость штамма ВКПМ В-10531, выращенного, как в примере 1, смешивали с гранулами вспученного перлитового песка в количестве 25 мас.% от общего количества препарата и высушивали при 40°С в течение 16 часов. Полученный порошкообразный препарат хранили при комнатной температуре в таре с плотно закрытой пробкой для предотвращения увлажнения.

Пример 4

Оценка альгицидной активности препарата «Алгалат» в лабораторных условиях

Альгицидную активность препарата, приготовленного, как в примере 3, выявляли при совместном инкубировании с микроводорослями Nostoc, Anabaena или Microcystis, выращенными, как в примере 2, путем совместного инкубирования в течение 96 часов при комнатной температуре. Препарат вносили в инкубационную смесь в соотношении 1:5. Активность препарата оценивали по изменению оптической плотности смеси, которую измеряли при длине волны 590 нм в нулевой момент времени и после совместной инкубации. Альгицидную активность оценивали как остаточную оптическую плотность смеси при длине волны 590 нм по формуле:

(ОП)=(ОП_Т/ОП _Н)×100,

где ОП_Н - начальная ОП, ОП_Т - ОП после инкубации в течение Т часов соответственно.

Поскольку микроводоросли синтезируют ряд пигментов (хлорофилл, фикобилины, каротиноиды), альгицидную активность оценивали также визуально по изменению окраски инкубационных смесей планктонных форм микроводорослей и препарата: «обесцвечивание» смеси отражало лизис микроводорослей. Лизис клеток микроводорослей подтверждали также микроскопированием.

Таблица 1
Альгицидная активность «Алгалата» против различных цианобактерий в лабораторных условиях
Обработка	Остаточная оптическая плотность (ОП)а, %
Nostoc	Anabaena	Microcystis
Обработка «Алгалатом»	13,50	15,50	45,50
а Остаточную оптическую плотность измеряли в смеси микроводорослей из различных образцов с «Алгалатом» после 96 часов инкубации в процентах от оптической плотности контроля

Пример 5

Оценка альгицидной активности препарата «Алгалат» по отношению к образцам микроводорослей, полученным из природных водоемов

Использовали природные образцы воды, содержащие различные типы микроскопических водорослей из природных водоемов России (Саратовской и Московской областей) и Китая (озеро Дианчши, провинции Юннань). При микроскопическом анализе в образцах в большом количестве выявляли нитчатые (типа Nostoc, Anabaena) и одноклеточные микроводоросли (типа Microcystis). Кроме того, в образцах выявлены другие виды микроводорослей. Таксономическую идентификацию микроводорослей не проводили. Опыты проводили в стандартных пробирках. Изменение цвета инкубационной смеси микроводорослей и «Алгалата» наблюдали через 96 часов. При световой микроскопии выявляли лизис клеток микроводорослей. В контрольных пробирках (без добавления препарата и/или с добавлением гранул не обработанного вспученного перлитового песка) изменения окраски микроводорослей не наблюдали, то есть образцы оставались сине-зеленого цвета, а также при световой микроскопии лизиса клеток не обнаружено. «Алгалат» - гранулы вспученного перлитового песка, содержащие бактериальный препарат, добавляли в обрабатываемые пробирки с образцами воды из природных водоемов в соотношении 1:5. Изменение цвета смеси наблюдали через 96 часов инкубации сначала до светлого желто-зеленого, а затем до полного обесцвечивания. При световой микроскопии выявляли лизис клеток микроводорослей.

Таблица 2
Альгицидная активность «Алгалата» в образцах воды, взятых из природных водоемов
Обработка	Остаточная оптическая плотность (ОП), %
Водохранилище, Саратовская область	Учинское водохранилище, Московская область	Река Скалба, Московская область	Озеро Дианчши, провинция Юннань, Китай (образец 1)а	Озеро Дианчши, провинция Юннань, Китай (образец 2)а
Обработка «Алгалатом»	20,50	25,50	15,50	17,50	50,00
аОбразцы 1 и 2, отобранные из различных участков озера Дианчши, провинция Юннань (Китай), отличались по составу и количеству нитчатых и одноклеточных водорослей

Пример 6

Приготовление биопленок - трехмерных структур микроводорослей в лабораторных условиях

Для получения биопленок - трехмерных структур микроводорослей («матов») - в лабораторных условиях цианобактерии Nostoc, Anabaena и Microcystis выращивали в колбах, как в примере 2, но в течение 2-х месяцев. Затем жидкую планктонную культуру микроводорослей переносили в чашки Петри и культивировали в них в течение последующих 4 недель при температуре 20°С при круглосуточном освещении, как в примере 2, до образования биопленок.

Аналогичным способом выращивали биопленки различных природных штаммов микроводорослей, полученных из образцов воды природных водоемов Московской и Саратовской области (Россия) и озера Дианчши провинции Юннань (Китай).

Пример 7

Оценка альгицидной активности препарата «Алгалат» на биопленках в лабораторных условиях

Воздействию препарата «Алгалат» подвергали биопленки цианобактерий Nostoc, Anabaena, Microcystis, выращенные, как в примере 6, как при их индивидуальном, так и при совместном культивировании этих микроводорослей.

Препаратом «Алгалат» обрабатывали опытные чашки с биопленками цианобактерий Nostoc, Anabaena и/или Microcystis, выращенными как при индивидуальном, так и при совместном культивировании, как из культивируемых в лабораторных условиях, так и из природных водоемов. Препарат «Алгалат» вносили в чашки Петри с биопленками в соотношении 1:5 путем равномерного распыления по всей поверхности.

В контрольные чашки с биопленками вносили то же количество гранул не обработанного вспученного перлитового песка.

В опытных чашках через 96 часов наблюдали изменение цвета биопленок микроводорослей, контактирующих с препаратом, сначала до светлого желто-зеленого, а затем до полного обесцвечивания. Микроскопически выявляли лизис клеток микроводорослей.

В контрольных чашках при тех же условиях изменения окраски микроводорослей не наблюдали - биопленки оставались сине-зеленого цвета и микроскопически лизиса клеток не обнаружено.

Это подтверждает выраженное разрушающее воздействие препарата «Алгалат» на биопленки - трехмерные структуры микроводорослей, образованные в процессе развития различными типами микроводорослей, как культивируемых в лабораторных условиях, так и присутствующих в образцах, взятых из природных водоемов.

Литература

1. Tyagi M.M., Thkur J.K., Singh D.P. Kumar A., Prasuna E.G. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999, 9:9-21.

2. Kaebernic M., Rohlack Т., Christoffersen K., Neilan B.A. Environ. Microbiol. 2001, 3(11):669-679.

3. Rohlack Т., Dittman E., Henning M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 1999, 65:737-739.

4. Kurmayer R., Dittman E., Fatner J., Chorus I. Microbiol. Ecol. 2002, 43:107-118.

5. Alam M.Z., Otaki M., Furumai H., Ohgaki S. Water Res. 2001, 35:1008-1014.

6. Ahn C.Y., Park M.H., Joung S.H., Kim H.S., Jang K.Y., Oh H.M. Environ. Sci. Technol., 2003, 37(13):3031-3037.

7. Ahn C.Y., Joung S.H., Jeon J.W., Kim H.S., Yoon B.D., Oh H.M. Biotechnol. Lett. 2003, 25(14):1137-42.

8. Imamura N, Motoike I, Shimada N, Nishikori M, Morisaki H, Fukami H. J. Antibiot (Tokyo), 2001, 54(7):582-7.

9. KR 20040094073.

10. KR 20030075874.

11. Hibayashi R., Imamura N. J. Antibiot. (Tokyo), 2003, 56(2):154-159.

12. Mayali X., Azam F. J. Eukaryot Microbiol. 2004, 51 (2):139-144.

13. Lovejoy C., Bowman J.P., Hallegraeff G. M. Applied and Environmental Microbiology. 1998, 64(8):2806-2813.

14. State Russian Standard 10832-91.

15. Stanier, R.Y., Kunisawa, R., Mandel M., Cohen-Basire, G. Bacteriol. Rev. 1971, 35(2):71-205.

16. Nakagawa, M., Y. Takamura, and O. Yagi. Agric. Biol. Chem. 1987, 51:329-337.