способ получения биологически активного комплекса

Формула изобретения

Способ получения биологически активного комплекса путем смешения водной суспензии модифицированной палочковидной вирусной частицы с водным раствором полипептида, отличающийся тем, что в качестве модифицированной палочковидной вирусной частицы используют продукт взаимодействия в водной среде 1 мас.ч. палочковидной вирусной частицы и 0,01-0,1 мас.ч. по крайней мере одного водорастворимого полимера с катионными группами, причем 1 мас.ч. модифицированной палочковидной вирусной частицы смешивают с 0,1-25 мас.ч. полипептида.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области молекулярной биологии, иммунологии, вирусологии и касается способа получения биологически активного комплекса, обладающего, например, протективной активностью против вируса гриппа. Данный комплекс может быть использован, например, для получения вакцинных препаратов.

Известен способ получения биологически активного комплекса путем генноинженерного слияния эпитопа (антигенной детерминанты) различных вирусов животных с белком оболочки (капсидным белком) вируса табачной мозаики (ВТМ) с последующей его репродукцией в растении (M.Bendahmane, M.Koo, E.Karrer, R.N.Beachy, Display ofepitopes on the surface of tobacco mosaic virus: impact of charge and isoelectric point of the epitope on virus-host interactions, J. Mol. Biol., 1999, 290, 9-20).

Известен способ получения биологически активного комплекса путем генноинженерного слияния белка оболочки ВТМ с эпитопом вируса иммунодефицита человека (A.A.McCormic, K.E.Palmer, Genetically engineered tobacco mosaic virus as nanoparticle vaccines, Expert Rev Vaccines, 2008, 7(1), 33-41).

Наиболее близким к заявляемому является известный способ получения биологически активного комплекса путем смешения водной суспензии модифицированной палочковидной вирусной частицы с водным раствором полипептида (патент США 20090053261) - прототип. В этом способе в качестве модифицированной палочковидной вирусной частицы используют палочковидную частицу с ковалентно связанным биотином. При этом в качестве полипептида используют полипептид, содержащий ковалентно связанный авидин. При смешении вышеназванных компонентов в водной среде образуется единый биологически активный комплекс за счет взаимодействия биотиновых и авидиновых привитых групп в компонентах комплекса.

Недостатком известного способа получения биологически активного комплекса является его относительная сложность, заключающаяся в необходимости обязательного проведения трех стадий очистки, включающих очистку модифицированной палочковидной вирусной частицы, очистку полипептида, ковалентно связанного с авидином, и очистку конечного биологически активного комплекса.

Технической задачей изобретения является упрощение известного способа получения биологически активного комплекса.

Указанный технический результат достигается за счет того, что в известном способе получения биологически активного комплекса путем смешения водной суспензии модифицированной палочковидной вирусной частицы с водным раствором полипептида в качестве модифицированной палочковидной вирусной частицы используют продукт взаимодействия в водной среде 1 массовой (мас.) части (ч.) палочковидной вирусной частицы и 0,01-0,1 мас. ч. по крайней мере одного водорастворимого полимера с катионными группами, причем 1 мас. ч. модифицированной палочковидной вирусной частицы смешивают с 0,1-25 мас. ч. полипептида.

Предлагаемый биологически активный комплекс не описан в литературе и является новым, что существенно расширяет ассортимент биологически активных комплексов.

В предлагаемом техническом решении в качестве палочковидной вирусной частицы могут быть использованы вирусы различных биологических родов, например рода Tobamovirus, рода Tobravirus, рода Pomovirus, и т.д. Данные палочковидные вирусные частицы могут быть выделены из клеток живых организмов известными методами или приобретены у коммерческих организаций, например у фирмы AGDIA (США).

В качестве водорастворимого полимера с катионными группами могут быть использованы различные полимеры, например такие, как полилизин, хитозан, полигексаметиленгуанидиний фосфат, полидиметилдиаллиламмоний хлорид (ПДМДААХ), N-алкилированный поли-N-винилпиридин (ПЭВП) и т.д. Помимо катионных групп используемые полимеры могут содержать гидрофильные электронейтральные и/или анионные, и/или гидрофобные группы (звенья). Можно использовать как индивидуальный полимер с катионными группами, так и смеси двух и более различных полимеров с катионными группами. При этом молекулярная масса полимеров может варьироваться в широких пределах, например от одного до нескольких тысяч килодальтон. Нерастворимые в воде полимеры не могут быть использованы в данном техническом решении.

Продукт взаимодействия палочковидной вирусной частицы и, по крайней мере, одного полимера с катионными группами образуется только в водной среде. Можно использовать как дистиллированную воду, так и водный раствор солей при их концентрации не выше 1%, например физиологический раствор. При получении такого продукта на 1 мас. ч. палочковидной вирусной частицы должно приходиться 0,01-0,1 мас. ч. по крайней мере одного водорастворимого полимера с катионными группами. Оптимальное вышеуказанное соотношение палочковидных вирусных частиц и по крайней мере одного водорастворимого полимера с катионными группами установлено экспериментально. При меньшем, чем заявлено, количестве массовых частей водорастворимого полимера с катионными группами биологическая активность конечного комплекса снижается, в то время как при большем содержании полимера продукт неизбежно требует дополнительной очистки от невступившего в реакцию полимера, что усложняет предлагаемый способ. При этом рН водной среды может варьироваться в широких пределах и подбирается экспериментально в зависимости от природы вирусной частицы и химического строения водорастворимого полимера.

С немодифицированной палочковидной вирусной частицей полипептиды биологически активные комплексы не образуют.

Образование именно продукта взаимодействия, а не просто механической смеси палочковидной вирусной частицы и, по крайней мере, одного водорастворимого полимера, содержащего катионные группы, подтверждается результатами следующих экспериментов. Готовят вышеназванный продукт, помещают водную дисперсию полученного продукта в ячейку ультрацентрифуги и подбирают скорость вращения ротора ультрацентрифуги таким образом, чтобы обеспечить количественное (полное) осаждение продукта. Убеждаются в том, что надосадочная жидкость (супернатант) не содержит ни свободного водорастворимого полимера, ни свободных вирусных палочковидных частиц. После этого проводят два контрольных эксперимента: в первом центрифугируют водный раствор того же полимера с катионными группами, во втором - водную суспензию исходных немодифицированных вирусных частиц. Концентрации полимера и вирусных частиц в контрольных экспериментах берут равными концентрациям этих компонентов при формировании продукта. Центрифугирование раствора полимера и суспензии вирусных частиц проводят при той же скорости вращения ротора ультрацентрифуги, при которой наблюдалось полное осаждение продукта. При этом убеждаются, что в указанных условиях ни взятый отдельно полимер, ни взятые отдельно вирусные частицы не осаждаются из раствора (суспензии). Совокупность полученных результатов однозначно свидетельствует о том, что смешение в водной среде раствора полимера и суспензии вирусных частиц при заявленном их соотношении сопровождается взаимодействием компонентов (полимера и вирусных частиц) друг с другом и формированием нового продукта, в который количественно входят оба компонента исходной смеси. Полученный продукт не обладает заметной биологической активностью.

В качестве полипептида может быть использован любой биологически активный водорастворимый полипептид, например вакцинные белки (гемагглютинин, нейраминидаза, М2Е и т.д.), ферменты (например, пероксидазы, протеазы и т.д.), ингибиторы (например, ингибиторы протеаз) и т.д. Биологическая активность любого предлагаемого комплекса будет определяться природой использованного при его создании полипептида. Нерастворимый в воде полипептид не может быть использован в предлагаемом техническом решении. Полипептид может быть получен различными методами, например путем биосинтеза в клетках бактерий, дрожжей, растений и т.д. Данный продукт может быть очищен и выделен в виде индивидуального препарата.

При получении биологически активного комплекса одну мас. ч. модифицированной палочковидной вирусной частицы смешивают с 0,1-25 мас. ч. полипептида. При меньшем, чем заявлено, количестве массовых частей полипептида биологическая активность вышеназванных комплексов существенно снижается. При большем содержании полипептида биологическая активность комплекса не возрастает, но полученный комплекс требует дополнительной очистки от свободного избыточного полипептида, что усложняет предлагаемый способ. При получении комплекса рН водной среды может варьироваться в широких пределах и подбирается экспериментально в зависимости от природы вирусной частицы и химического строения водорастворимого полимера. Получать биологически активный комплекс можно в широком интервале температур, традиционных для получения биологически активных комплексов, например от +4 до +30°С.

Биологически активный комплекс представляет собой достаточно стабильное образование, состоящее из модифицированной вирусной частицы и полипептида, которое может быть выделено из раствора в виде гелеобразного осадка. Такой осадок может быть ресуспендирован в водной среде. В зависимости от характеристик модифицированных вирусных частиц, природы полипептида и концентраций обоих компонентов водная суспензия биологически активного комплекса может быть практически прозрачной, слабо опалесцирующей или сильно замутненной.

Образование именно комплекса при смешении водной суспензии модифицированных вирусных частиц и водного раствора полипептида, а не их простой механической смеси, может быть доказано методом ультрацентрифугирования аналогично тому, как это было сделано выше для продукта взаимодействия вирусных частиц и водорастворимого полимера, содержащего катионные группы. При этом убеждаются в том, что надосадочная жидкость (супернатант) не содержит свободного полипептида, а осадок обладает высокой биологической активностью, которая отсутствовала у модифицированных вирусных частиц.

Биологическая активность комплексов была продемонстрирована с помощью традиционных опытов на лабораторных животных на примере протективной активности полученных комплексов против вируса гриппа.

Преимущества предлагаемого способа получения биологически активного комплекса поясняют следующие примеры.

Пример 1.

Из 100 г растений табака, зараженных ВТМ, выделяют препарат палочковидных вирусных частиц методом центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы. Готовят 10 мл суспензии палочковидных вирусных частиц в дистиллированной воде, содержащей 100 мг вирусных частиц (концентрация вирусных частиц составляет 10 мг/мл).

Из 100 г клеток E.coli (кишечная палочка) на Ni-содержащей агарозе выделяют водорастворимый полипептид, содержащий фрагмент гемагглютинина вируса гриппа. Готовят 2 мл раствора полипептида в дистиллированной воде, содержащей 8 мг полипептида.

Для получения модифицированных палочковидных частиц используют следующую процедуру. Готовят раствор ПЭВП со степенью полимеризации 600 в воде в концентрации 0,3 мг/мл и 10^-2 М ТРИС-HCl буферный раствор с рН 7,5. Смешивают 0,04 мл раствора ПЭВП (0,012 мг полимера, содержащего катионные группы, 0,02 мас. ч.), 1,76 мл буферного раствора и 0,06 мл суспензии ВТМ с концентрацией 10 мг/мл (0,06 мг палочковидных вирусных частиц, 1 мас. ч.). Смесь инкубируют в течение 1 часа при 4°С. Модифицированные палочковидные частицы выделяют центрифугированием полученной смеси в течение 30 мин при 60000g и 4°С. Осажденный комплекс ресуспендируют в физиологическом растворе.

Образование продукта - модифицированных палочковидных частиц, а не механической смеси палочковидных вирусных частиц и свободного полимера доказывают следующим образом. Полученный образец помещают в ячейку ультрацентрифуги и подбирают скорость вращения ротора центрифуги таким образом, чтобы обеспечить количественное (полное) осаждение продукта. Убеждаются в том, что надосадочная жидкость (супернатант) не содержит ни свободных вирусных частиц, ни полимера. После этого проводят два контрольных эксперимента: в первом центрифугируют водную суспензию вирусных частиц, во втором - водный раствор полимера. Концентрации вирусных частиц и полимера в контрольных экспериментах берут равными концентрациям этих компонентов при формировании продукта. Центрифугирование суспензии вирусных частиц и раствора полимера проводят при той же скорости, при которой наблюдается полное осаждение продукта. При этом убеждаются, что в указанных условиях ни взятые отдельно вирусные частицы, ни взятый отдельно полимер не осаждаются из суспензии (раствора). Совокупность полученных результатов однозначно свидетельствует о том, что смешение раствора вирусных частиц и полимера в вышеуказанном соотношении сопровождается взаимодействием компонентов - вирусных частиц и полимера - друг с другом и формированием нового продукта, в который количественно входят оба компонента исходной смеси.

Комплекс палочковидной частицы и полипептида получают путем смешения 1 мл суспензии модифицированных палочковидных вирусных частиц в физиологическом растворе, содержащей 1 мг частиц (1 мас. ч.) и 0,25 мл водного раствора вышеназванного полипептида, содержащего 1 мг полипептида (1 мас. ч.). Смесь инкубируют в течение 1 часа при 4°С. Образование именно комплекса, а не их простой механической смеси вышеназванных компонентов, доказывают методом ультрацентрифугирования аналогично тому, как это было сделано выше для продукта взаимодействия вирусных частиц и водорастворимого полимера, содержащего катионные группы. При этом убеждаются в том, что надосадочная жидкость (супернатант) не содержит несвязанного полипептида, берущегося изначально в большом молярном (но не массовом) избытке по отношению к палочковидной частице. После этого убеждаются, что осадок обладает высокой биологической активностью, которая отсутствует у модифицированных вирусных частиц. Комплекс выделяют центрифугированием полученной смеси в течение 30 мин при 60000 g и 4°С. Осажденный комплекс ресуспендируют в физиологическом растворе. Методом электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле определяют состав комплекса: палочковидная частица - 1 мас. ч., полипептид - 25 мас. ч.

Полученный комплекс не требует дополнительной очистки. Биологическую активность полученного комплекса оценивают по его протективной активности против вируса гриппа. Лабораторных животных (мышей) иммунизируют путем подкожной инъекции, вводя по 50 мкг препарата в присутствии адъюванта Фрейнда в мышь три раза с интервалом 7 дней. Через две недели после третьей иммунизации животных заражают вирусом гриппа, используя адаптированный к мышам штамм вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1). Перед заражением животных проводят титрование вируса на мышах для определения летальной дозы (LD) вируса. Для заражения мышей используют летальные дозы LD70 и LD90, при которых погибает соответственно 70 и 90% неиммунизированных мышей.

Биологическая активность комплекса, определенная указанным способом, показана в таблице 1. Полученный результат сравнивают с биологической активностью известного биологически активного препарата, выбранного в качестве прототипа.

Таблица 1
Группы мышей	Вводимый препарат	Количество выживших мышей на 14-е сутки	Выжившие животные, %
Доза заражения	Доза заражения
LD70	LD90	LD70	LD90
Опытная	Заявляемый комплекс	20/14*	20/8	70	40
Контрольная	Прототип	20/8	20/5	40	25
Примечание: * в числителе общее количество мышей в опыте, в знаменателе количество выживших мышей.

Пример 2.

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако в качестве модифицированной палочковидной вирусной частицы используют продукт взаимодействия 1 мас. ч. вируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) и 0,01 мас. ч. водорастворимого полимера с катионными группами полилизина, в качестве водорастворимого полипептида используют фрагмент белка вируса гриппа нейраминидазы при соотношении компонентов в комплексе: модифицированная палочковидная вирусная частица 1 мас. ч., полипептид 0,1 мас. ч.

Полученный комплекс не требует дополнительной очистки.

Биологическая активность комплекса показана в таблице 2.

Таблица 2
		LD70	LD90	LD70	LD90
Опытная	Заявляемый комплекс	20/15	20/9	75	45
Контрольная	Модифицированная палочковидная частица ВШМЯ	20/5	20/1	25	5
Примечание: * в числителе общее количество мышей в опыте, в знаменателе количество выживших мышей.

Пример 3.

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако в качестве модифицированной палочковидной вирусной частицы используют продукт взаимодействия 0,05 мас. ч. водорастворимого полимера с катионными группами ПДМДААХ, 0,05 мас. ч. водорастворимого полимера с катионными группами хитозана и 1 мас. ч. ВТМ, в качестве водорастворимого полипептида используют фрагмент гемагглютенина при соотношении компонентов в комплексе: модифицированная палочковидная вирусная частица 1 мас. ч., полипептид 25 мас. ч.

Полученный комплекс не требует дополнительной очистки.

Биологическая активность комплекса показана в таблице 3.

Пример 4.

Опыт проводят аналогично примеру 2, однако в качестве катионного полимера вместо полилизина используют смесь 0,003 мас. ч. ПЭВП, 0,003 мас. ч. хитозана и 0,004 мас. ч. ПДМДААХ. Биологическая активность полученного комплекса с точностью до погрешности эксперимента совпадает с биологической активностью предлагаемого комплекса, описанного в примере 2.

Таблица 3
Группы мышей	Вводимый препарат	Количество выживших мышей на 14-е сутки	Выжившие животные, %
Доза заражения	Доза заражения
LD70	LD90	LD70	LD90
Опытная	Заявляемый комплекс	20/13*	20/7	65	35
Контрольная	Модифицированная палочковидная частица ВТМ	20/4	20/2	20	10
Примечание: * в числителе общее количество мышей в опыте, в знаменателе количество выживших мышей.

Таким образом, из приведенных примеров видно, что предлагаемый способ получения биологически активного комплекса существенно упрощает известный способ получения биологически активного комплекса, выбранного в качестве прототипа, за счет устранения стадий очистки. Кроме того, предлагаемый способ позволяет получать новые биологически активные комплексы, активность которых превышает в 1,6-1,7 раза биологическую активность известного комплекса, выбранного в качестве прототипа.