экспресс-тест для диагностирования болезни альцгеймера

Формула изобретения

1. Способ диагностирования болезни Альцгеймера на основании образца крови от пациента, при этом указанный способ включает стадии:

(а) стабилизацию крови в образце одним или более антикоагулянтом;

(б) отделение CD4⁺ или CD8 ⁺ лимфоцитов, несущих CD69, от клеток крови путем иммуномагнитного разделения посредством антител, связанных с магнитными частицами, таких как анти- CD69 антитело и анти- CD4 антитело для определения CD4⁺ лимфоцитов или анти- CD69 антитело и анти- CD8 антитело для определения CD8⁺ лимфоцитов, в контрольном образце;

(в) определение количества CD4⁺ или CD8⁺ лимфоцитов, экспрессирующих маркеры CD69, путем разрушения клеток лизирующим раствором в контрольном образце;

(г) митогенетическую стимуляцию лимфоцитов в опытном образце с использованием от 1 до 50 мкг/мл митогена фитоллакки (PWM) в течение от 2 до 24 ч в физиологических условиях;

(д) отделение CD4⁺ или CD8⁺ лимфоцитов, несущих CD69, от клеток крови путем иммуномагнитного разделения посредством антител, связанных с магнитными частицами, таких как анти- CD69 антитело и анти- CD4 антитело для определения CD4⁺ лимфоцитов или анти- CD69 антитело и анти- CD8 антитело для определения CD8⁺ лимфоцитов в опытном образце;

(е) определение количества CD4⁺ или CD8⁺ лимфоцитов, экспрессирующих маркеры CD69, путем разрушения клеток лизирующим раствором, в опытном образце;

(ж) определение индекса стимуляции как отношения числа CD4⁺ или CD8 ⁺ лимфоцитов, несущих CD69 маркеры после митогенной стимуляции в опытном образце к числу лимфоцитов, несущих CD69 маркеры, не подвергшихся митогенной стимуляции в контрольном образце;

причем коэффициент стимуляции, достигающий по меньшей мере 10-кратного или максимум 30-кратного значения по отношению к нестимулированному контрольному образцу, является признаком болезни Альцгеймера.

2. Набор для диагностирования болезни Альцгеймера, содержащий следующие компоненты:

(а) PWM для митогенетической стимуляции;

(б) антитела, связанные с магнитными частицами, такие как анти- CD69 антитело и анти- CD4 антитело или анти- CD69 антитело и анти- CD8 антитело;

(в) антикоагулянт; и/или

(г) буфер для лизиса клеток;

(д) магнит для выделения клеток, связанных с магнитными частицами;

(е) реагент для удаления связанных магнитных частиц;

(ж) вещества для количественного определения концентрации ДНК и/или белка и готовые растворы для получения калибровочных кривых.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к способу диагностирования болезни Альцгеймера (БА), или ее ранней стадии, или предрасположенности к этой болезни, отличающемуся тем, что указанный способ основан на определении количества митогенетически экспрессируемых маркеров поверхности клетки, предпочтительно CD69, периферически доступных клеток, например клеток кожи или лимфоцитов, (а) до и (б) после митогенетической стимуляции, причем коэффициент стимуляции а:б, представляет собой признак болезни Альцгеймера, или ее ранней стадии, или предрасположенности к этой болезни. Также настоящее изобретение относится к набору, пригодному для осуществления диагностического способа согласно настоящему изобретению.

Посредством клинических способов, и доступных параклинических способов диагностики, и способов, основанных на аппаратуре и технологии как таковой, болезнь Альцгеймера не может быть достоверно диагностирована. Всегда требуется контрольное вскрытие. При диагностике часто трудно отличить БА от других причин слабоумия, в особенности на ранних стадиях болезни. Однако на этих очень ранних стадиях болезни точно поставленный диагноз является важным по двум причинам. С одной стороны, это дает возможность диагностически различать потенциально излечимые формы слабоумия, которые таким образом можно будет эффективно лечить, и, с другой стороны, это непременное условие для любой формы терапевтического вмешательства в нейродегенеративный процесс болезни Альцгеймера, которое может быть успешным только на ранних стадиях. Такую диагностическую уверенность можно обеспечить только на основе биологических маркеров (биомаркеров) болезни Альцгеймера, то есть легко определяемых биологических изменений с соответствующими этой болезни чувствительностью и специфичностью.

Биомаркеры болезни Альцгеймера имеют, таким образом, диагностическую ценность и, в частности, будут помогать безопасно идентифицировать группы риска и пациентов в предклинических стадиях и ранних клинических стадиях БА. Биомаркеры также могут служить для последующего наблюдения пациентов и, таким образом, способствовать прогнозированию и контролю способности к реагированию на терапевтические вмешательства. Идеальные биомаркеры должны соответствовать определенным теоретическим и практическим требованиям. В частности, указанные требования включают высокие специфичность и чувствительность, способность определять предклинические стадии и достоверность положительного и отрицательного результата. Если возможно, то биомаркеры следует определять неинвазивным образом, не обременять и не пугать пациента. Испытания должны быть недорогими и легко выполнимыми, если возможно, в практике домашнего доктора. К сожалению, ни один из известных на сегодня биомаркеров болезни Альцгеймера не соответствует вышеприведенным требованиям. В частности, из-за незначительной чувствительности и специфичности известных биомаркеров, они не удовлетворяют потребностям диагностики. Другие диагностические исследования, обладающие значительной чувствительностью и специфичностью, требуют сложных дополнительных технических условий и, таким образом, не подходят для местного использования значительных групп пациентов.

Таким образом, изобретение в основном основывается на технической проблеме создания простого способа для диагностирования болезни Альцгеймера, который позволит устанавливать диагноз болезни Альцгеймера, определять предклинические стадии болезни и устанавливать диагностические различия между болезнью Альцгеймера и другими видами слабоумия с достаточной чувствительностью и специфичностью.

Эта техническая проблема была разрешена в результате способов реализации изобретения, охарактеризованных в формуле изобретения.

Стало возможным разработать диагностический способ, основывающийся на определении митогенетического коэффициента (коэффициента активации), при использовании периферически доступных клеток пациента, таких как клетки кожи или лимфоциты крови, при и без митогенетической стимуляции, например, после выделения клеток. Активация этих клеток сопровождается поверхностным представлением маркеров активации, которые можно определять количественно, предпочтительно посредством взаимодействий «антиген-антитело», используя магнитные частицы, предпочтительно покрытые антителами, что позволяет осуществлять магнитную сортировку клеток и затем количественное определение числа клеток, несущих этот поверхностный маркер до и после митогенетической стимуляции. Данная характеристика показывает характерные для болезни отклонения от стандартных значений. Таким образом, способ согласно настоящему изобретению позволяет диагностировать болезнь Альцгеймера, определять предклинические стадии болезни и устанавливать диагностические различия между болезнью Альцгеймера и другими видами слабоумия.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу диагностирования болезни Альцгеймера, или ее ранней стадии, или предрасположенности к этой болезни на основании образца от пациента, этот способ включает стадии:

(а) митогенную стимуляцию периферически доступных клеток в образце;

(б) определение количества митогенетически стимулированных клеток в клеточной популяции до и после стадии (а) на основании одного или более поверхностных маркеров, экпрессированных после митогенетической стимуляции, при этом клетки, несущие поверхностные маркеры, отделяют от клеток, не несущих поверхностные маркеры, посредством антител, направленных против указанных поверхностных маркеров, и

(в) определение коэффициента стимуляции как соотношения числа клеток, несущих поверхностный маркер или маркеры, до и после стадии (а),

при этом коэффициент стимуляции, достигающий значения по меньшей мере в 10 раз, как максимум в 100 раз, по отношению к нестимулированному контрольному образцу, является признаком болезни Альцгеймера, или ее ранней стадии, или предрасположенности к этой болезни.

Квалифицированному специалисту в данной области известны соответствующие способы, пригодные для получения применимых в способе согласно настоящему изобретению образцов от пациента, которые содержат достаточно митогенетически стимулируемых клеток. Например, подходящими пробами являются образцы клеток кожи, пробы крови, предпочтительно венозной крови, клетки из цереброспинальной жидкости и клетки из мочи.

В предпочтительном способе реализации диагностического способа согласно настоящему изобретению, например, при использовании образца крови перед другими этапами способа добавляют антикоагулянт, например цитрат или гепарин натрия, с целью стабилизации.

Используемый здесь термин «диагностирование болезни Альцгеймера» также подразумевает наблюдение пациентов после проведения лечения и, таким образом, прогноз, контроль над эффективностью терапевтического вмешательства и установление диагностического различия между этой болезнью и другими видами слабоумия.

Используемый здесь термин «периферически доступные клетки» относится к клеткам, которые можно удалить без операции или в (минимально) инвазивной форме из человеческого организма, и они включают, например, клетки кожи и лимфоциты периферической крови, последнее предпочтительно для способа согласно настоящему изобретению.

Митогенную стимуляция для получения экспрессии поверхностных маркеров можно осуществлять известными стимуляторами, такими как фитогемагглютинин (РНА), белок A, PWM (митоген фитолакки) или другими соединениями, обладающими трофическим или митогенетическим действием. Стимуляцию можно осуществлять, добавляя индивидуальные соединения или комбинацию соединений.

Квалифицированному специалисту в данной области известны соответствующие экспериментальные условия для такой стимуляции, например, в отношении концентрации используемых митогенов, продолжительности стимуляции и других инкубационных условий. Стимуляцию следует осуществлять в подходящих сосудах, допускающих соответствующий газообмен. Концентрации определенных агентов для стимуляции должны находиться в физиологическом пределе, составляющем от 1 мкг/мл до 20 мкг/мл для РНА, от 1 мкг/мл до 50 мкг/мл для PWM, от 10 мкг/мл до 200 мкг/мл для белка А. Продолжительность стимуляции зависит от скорости экспрессии исследуемой молекулы. Однако для точных исследований может быть необходимо время стимуляции от 2 до 24 часов. В случае CD69 оптимальная продолжительность стимуляции составляет 4 часа. Стимуляцию следует проводить при физиологических условиях, и ее можно осуществлять, например, в газовом инкубаторе при 37°С и с 5% CO₂ .

Квалифицированному специалисту в данной области также известны пригодные поверхностные маркеры, которые служат проявлением митогенетической стимуляции, например CD69, CD25, CD45RO, CD63 и HLA-Dr, предпочтителен поверхностный маркер CD69. Для целей данного изобретения также возможно осуществить определение сочетания поверхностных маркеров или дополнительную характеризацию клеток, выделенных на основании определенного поверхностного маркера, например CD69, в отношении дальнейшего разделения на субпопуляции, например на CD4⁺, и/или CD8⁺ , и/или CD19⁺, и/или CD56⁺ субпопуляции.

Коэффициент стимуляции (коэффициент активации) основан на соотношении числа клеток, несущих поверхностный маркер или маркеры, до и после стимуляции. Коэффициент стимуляции, который достигает по меньшей мере 10 раз, максимально 100 раз, по отношению к нестимулированному контрольному образцу, представляет собой признак болезни Альцгеймера, или ее ранней стадии, или предрасположенности к данной болезни. Коэффициент стимуляции, достигающий менее 10 раз по отношению к нестимулированному контрольному образцу, не является признаком болезни Альцгеймера, или ее ранней стадии, или предрасположенности к этой болезни. Клетки, несущие поверхностные маркеры, можно определять традиционными способами, например Western blot, ELISA (способом иммуноферментного анализа), RIA (методом радиоиммунного анализа), FACS (методом проточной цитофлуориметрии), LSC (методом жидкостно-сцинтилляционного счета) и т.д.

Для того чтобы определить клетки, несущие поверхностные маркеры, их по характерным клеточным особенностям предпочтительно отделяют от клеток, не несущих поверхностный маркер или несущих другие поверхностные маркеры.

В диагностическом способе согласно настоящему изобретению клетки, несущие поверхностные маркеры, отделяют от не несущих поверхностные маркеры клеток с помощью антител, направленных против требуемого поверхностного маркера(ов). Пригодные для этой цели антитела могут быть моноклональными, поликлональными, синтетическими антителами или их фрагментами. В связи с этим термин «фрагмент» означает все части моноклонального антитела (например, Fab, Fv или одноцепочечные фрагменты Fv), которые обладают специфичностью к тому же эпитопу, как и целое антитело. Квалифицированному специалисту в данной области известно получение таких фрагментов, также многие антитела, направленные против поверхностных маркеров, коммерчески доступны.

В наиболее предпочтительном способе реализации диагностического способа согласно настоящему изобретению специфичное к поверхностным маркерам антитело или антитела связаны с магнитными частицами, например, парамагнитными шариками (например, доступными у DYNAL A.S., P.O.Box 158 Skoyen, N-0212 Oslo, Norway), что позволяет выделять клетки с соответствующими поверхностными маркерами посредством иммуномагнитного выделения согласно известным способам.

Затем можно установить коэффициент стимуляции, определяя количество клеток, выделенных на основании требуемого поверхностного маркера, на основе содержания кодирующей его нуклеиновой кислоты и/или содержания белка, используя известные способы, например способом спектрофотометрического определения содержания нуклеиновый кислоты или белка после лизиса клеток или после выявления нуклеиновой кислоты, с помощью специфичных красителей, например этидия бромида, пропидия иодида, акридин-оранжевого, DAPI и т.п., с помощью фотометрического количественного определения. Число клеток можно вычислять на основании содержания в образце белка и/или нуклеиновой кислоты, используя калибровочные кривые.

Также настоящее изобретение относится к набору, который пригоден для осуществления диагностического способа согласно настоящему изобретению и содержит, по меньшей мере, следующие компоненты:

(а) соединение для митогенетической стимуляции;

(б) по меньшей мере одно антитело, направленное против поверхностного маркера, экспрессируемого после митогенетической стимуляции, предпочтительно антитело, связанное с магнитной частицей.

Также набор согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит:

(а) по меньшей мере один реакционный сосуд;

(б) антикоагулянт и/или буфер для лизиса клеток;

(в) буфер для фиксирования клеток;

(г) вещества, требуемые для количественного определения концентрации ДНК и/или белка, и готовые растворы для получения калибровочных кривых;

(д) магнит для выделения клеток, связанных с магнитными частицами (входит в состав, если используется антитело, связанное с магнитной частицей), и

(е) реагент для удаления связанных магнитных частиц (входит в состав, если используется антитело, связанное с магнитной частицей).

В предпочтительном способе реализации набора согласно настоящему изобретению антитело представляет собой анти-CD69 антитело. Кроме того, набор может дополнительно содержать или содержать вместо анти-CD69 антитела анти-CD4 и/или анти-CD8 антитело.

В заключение, набор согласно настоящему изобретению может присутствовать, где необходимо, в сочетании с одним или более применимых дополнительных агентов детектирования, например флуорохром-конъюгированных первичных антител, вторичных антител, агентов для детектирования белков и/или нуклеиновых кислот, например интеркалирующего красителя, и т.п.

Пример

Определение коэффициента митогенетической стимуляции на основании CD69 у пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера

Определение признаков, известных к настоящему времени для болезни Альцгеймера, которое можно выполнить у живых пациентов (биомаркеров), показывает только недостаточные чувствительность и специфичность или не подходит для исследований с большим числом пациентов по причине стоимости или высокосложного механизма исследования. С клиническими средствами диагностическая достоверность составляет только от 80 до 90% и существуют трудности, особенно на ранних стадиях болезни, в отношении установления диагностических различий. В настоящее время определение предклинических стадий болезни невозможно из-за отсутствия соответствующего биомаркера.

Нейродегенеративные изменения основываются на нарушеннии процессов внутриклеточного опосредования трофических и митогенных сигналов в случае болезни Альцгеймера. Эти дисфункции внутриклеточной передачи сигнала не ограничены нервной системой. Также они могут быть обнаружены в клетках кожи и лимфоцитах периферической крови этих пациентов. Вследствие специфичности болезни это изменение имеет диагностическое значение и подходит в качестве биомаркера.

В нижеприведенном примере исследовали, существует ли дисфункция, типичная для внутриклеточного опосредования трофических и митогенных сигналов при болезни Альцгеймера, с помощью иммуномагнитного выделения лимфоцитов презентирующих CD69 до и после митогенетической стимуляции.

Кровь брали путем укола в вену, используя систему для взятия крови компании SARSTEDT. В процессе взятия кровь стабилизировали, используя антикоагулянты, введенные в систему для взятия крови, такие как цитрат натрия или гепарин натрия. В такой форме кровь можно хранить при комнатной температуре от 24 до 48 часов. Эксперименты по стимуляции проводят в реакционных сосудах, которые можно хорошо аэрировать, например в 24-луночном планшете компании Greiner bio-one для культвирования клеток в суспензии. Для этого митогены - фитогемагглютинин (РНА), белок А и митоген фитолакки (PWM) использовали раздельно или в различных сочетаниях для каждых 400 мкл стабилизированной крови. В этом примере конечные концентрации соответствующих митогенов находились в физиологическом диапазоне значений и составляли 12 мкг/мл для РНА, 50 мкг/мл для белка А и 4 мкг/мл для PWM. Стимуляцию проводили в физиологических условиях при 37°С и 5% концентрации CO ₂ в газовом инкубаторе в течение 4 часов. Каждые 100 мкл стимулированной цельной крови инкубировали с магнитными частицами, покрытыми различными антителами. В этом примере использовали магнитные частицы, покрытые анти-CD4 и анти-CD8 антителами от компании DYNAL. Соответствующие магнитные частицы добавляли к отдельному образцу в избытке (10 мкл суспензии магнитных частиц) для обеспечения полного выделения соответствующей субпопуляции лимфоцитов. После 30-минутного инкубационного периода при 4°С соответствующую субпопуляцию лимфоцитов магнитно выделяли и после стадий промывки переводили в 100 мкл определенной среды, в этом примере RPMI 1640, смешанной с 1% фетальной телячьей сывороткой (FCS). В данном примере связанные магнитные частицы удаляли, используя 10 мкл DETACHaBEAD компании DYNAL. После 45-минутного инкубационного периода при комнатной температуре удаленные магнитные частицы выделяли и после нескольких стадий промывки клеточную суспензию переводили в описанную среду, в этом примере RPMI 1640. В результате добавления определенного лизирующего буфера разрушали клетки, ДНК метили красителями, специфичными для ДНК, такими как этидия бромид, пропидия иодид, акридин-оранжевый или DAPI, и затем количественно определяли фотометрически. Содержание белка в образцах сравнивали способом определения белка по Bradford. Число клеток вычисляли по содержанию в образце ДНК и/или белка, используя калибровочные кривые. Эта методика позволяла сделать прямой вывод относительно числа клеток. Вычисление коэффициента на основании количества CD69-презентирующих клеток до и после митогенетической стимуляции (коэффициента стимуляции), давало сведения об изменениях митогенетической стимулируемости этих клеток.

Коэффициент стимуляции, который достигает по меньшей мере 10 раз, максимально 100 раз, по отношению к нестимулированному контрольному образцу, представляет собой признак болезни Альцгеймера, или ее ранней стадии, или предрасположенности к этой болезни. Коэффициент стимуляции, который в 10 раз меньше, чем для нестимулированного контрольного образца, не является признаком болезни Альцгеймера, или ее ранней стадии, или предрасположенности к этой болезни.

В другом эксперименте определяли содержание белка в образце и определяли содержание ДНК без добавления выявляющих ДНК соединений для количественного определения CD69-представляющих клеток. В этом случае измеряли поглощение света, имеющего определенную длину волны (например, 260 нм или 280 нм), ДНК или белком.

Данные экспериментов

Были исследованы коэффициенты стимуляции для 9 человек с клинически диагностированным подозрением на болезнь Альцгеймера (таблица А) и для 9 человек, не страдающих деменцией (таблица В). Пациенты, страдающие болезнью Альцгеймера и психически здоровые с учетом возраста. В таблицах также показаны соответствующие значения по краткой шкале оценки психического статуса (MMSE - mini-mental state examination). MMSE обычно применяется для того, чтобы установить степень тяжести поражения сознания отдельного человека. Как правило, показание на шкале выше 27 считается нормальным; 20-26 означает легкое психическое расстройство; 10-19 - умеренную степень тяжести психического расстройства, и ниже 10 - очень тяжелую степень психического расстройства.

Митогенетическую стимуляцию осуществляли с использованием митогена лаконоса (PWM).

Периферические мононуклеарные клетки крови (РВМС) выделяли из образцов крови, взятых у отдельных людей, и суспендировали в среде при концентрации 2,5×10⁶ кл./мл. Выделенные клетки стимулировали 4 µг/мл митогена лаконоса. Образцы выдерживали при температуре 37°С и 7% СО₂ в течение 4 часов, затем перемешивали с FACS-лизирующим раствором. Антитела, содержащиеся в образцах, окрашивали и образцы анализировали с помощью проточного цитометра FACSCalibur и программного обеспечения CellQuest Pro. X.X. Количество CD69+/CD69- в клетках CD19+ до и после стимуляции показаны для каждого человека в таблицах А и В соответственно. Коэффициенты стимуляции рассчитывали в соответствии с формулой, приведенной под таблицами.

Что касается пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, в таблице А 8 из 9 образцов показали коэффициент стимуляции выше 10. Только коэффициент стимуляции для пациента G немного ниже 10. В таблице А также показано, что коэффициент стимуляции выше 10 был получен для пациентов с легкой и умеренной степенью тяжести психического расстройства (пациенты А, В, Н и I) так же, как и для пациентов с тяжелой степенью психического расстройства (пациенты С, D, Е и F).

Напротив, для всех контрольных примеров без психических расстройств были получены коэффициенты стимуляции значительно ниже 10.

Таким образом, представленные данные подтверждают, что с помощью заявленного способа возможно отличить человека, страдающего болезнью Альцгеймера, от человека с неповрежденным сознанием. Учитывая, что результаты исследования в значительной степени соответствуют клинической диагностике болезни Альцгеймера, заявленный способ расценивается как дополнительный способ исследования, обеспечивающий несложное предварительное диагностирование болезни Альцгеймера. Таким образом, реализация заявленного способа подтверждена.

Таблица А
Коэффициенты стимуляции для пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера
Пациент, страдающий болезнью Альцгеймера	А	В	С	D	Е	F	G	Н	I
MMSE	25	18	11	6	5	9	23	17	14
Возраст	83	83	69	76	73	78	79	59	90
Число CD69+/CD69- в CD19+ клетках
нестимулированные [CD69+]	16	22	9	3	10	10	20	2	12
нестимулированные [CD69-]	257	335	208	97	175	151	202	119	155
PWM-стимулированные [CD69+]	236	254	127	92	174	183	182	35	139
PWM-стимулированные [CD69-]	48	60	37	42	12	32	36	47	24
Коэффициент стимуляции	14,18	13,13	18,67	22,89	17,31	13,70	9,27	25,82	11,87

Таблица В
Коэффициенты стимуляции для пациентов, не страдающих психическими расстройствами
Контроль	1	2	3	4	5	6	7	8	9
MMSE	28	29	28	29	30	28	29	27	29
Возраст	76	85	84	85	78	85	91	84	85
Число CD69+/CD69- в CD19+ клетках
нестимулированные [CD69+]	151	56	34	9	19	93	102	552	35
нестимулированные [CD69-]	49	103	267	147	271	187	42	1035	317
PWM-стимулированные [CD69+]	134	168	127	46	141	321	124	1357	314
PWM- стимулированные [CD69-]	75	49	83	213	105	44	27	46	147
Коэффициент стимуляции	0,85	2,20	5,35	3,08	8,75	2,65	1,16	2,78	6,85

Расчет коэффициента стимуляции:

n[CD69+]PWM-stim.

(n[CD69+]PWM-stim. + n[CD69-]PWM-stim.)

n[CD69+]non-stim.

(n[CD69+]non-stim. + n[CD69-]non-stim.)