способ раннего прогнозирования риска развития сосудистых поражений в дебюте эндокринопатий

Формула изобретения

Способ раннего прогнозирования риска развития сосудистых поражений в дебюте эндокринопатий, включающий определение состояния гемостаза по плазме крови, отличающийся тем, что в обогащенной тромбоцитами плазме крови определяют интегральный показатель тромбоцитарной активности (S) планиметрическим методом или по формуле:

S=-0,263+1,029А-0,286В,

где А - степень агрегации (%), В - скорость агрегации за 30 с (%/мин) и значение S>14 см ² оценивают как повышенную степень риска тромбообразования.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к медицине, эндокринологии, кардиологии, терапии, патофизиологии, профилактической медицине и может быть использовано для предупреждения тромботических осложнений.

Предварительные данные по диспансеризации работников социальной сферы выявили лидирующее распространение эндокринопатий среди трудоспособного населения РФ [Дедов И.И. 2008]. Дисгормональные нарушения сопровождаются изменениями метаболизма и гемостаза, высоким риском сердечно-сосудистых катастроф. Результаты Фремингемского исследования показали, что при корректировке данных по возрасту, курению, величине системного АД и содержанию общего холестерина в крови наличие сахарного диабета (СД) повышает риск развития ИБС у мужчин на 66%, у женщин - на 203% [Wilson P.W.F. et al. 1986]. Риск коронарных осложнений у больных СД без ИБС сопоставим с риском у больных с установленным диагнозом ИБС, а смертность от цереброваскулярных расстройств в 2-3 раза превышает аналогичные показатели в общей популяции [Malmberg K. et al. 2000, Juutilainen A. et al., 2005]. Ведущее место в структуре смертности больных диабетом занимает ишемическая болезнь сердца: 44% смертей при СД 1 типа и ~52% при СД 2. Высокую распространенность сердечно-сосудистых поражений отмечают при акромегалии Katznelson L., 2007, гипотиреозе, в том числе субклиническом [Hak A.E. et al., 2000], гиперкортицизме [Чехладзе Н.М., Чазова И.Е. 2008].

Имеющиеся при эндокринопатиях гемостазиологические расстройства традиционно рассматриваются как осложнение основного заболевания, развивающиеся на поздних стадиях болезни [Ryden L. et al. 2007]. В современных клинических рекомендациях представлены принципы антитромбоцитарной терапии, проводимой у больных СД в возрасте старше 40 лет с повышенным сердечно-сосудистым риском, либо при наличии ИБС [Дедов И.И., Шестакова М.В. 2009; Standards of Medical Care in Diabetes ADA, 2010]. Литературные сведения об изменении и соответствующей коррекции нарушений гемостаза при других эндокринопатиях скудны, а по ряду отдельных нозологических форм вовсе отсутствуют. Между тем имеющиеся эпидемиологические сведения о стабильно высоком рейтинге сердечно-сосудистых поражений в структуре летальности и смертности больных СД свидетельствуют о недостаточной эффективности выбранной тактики лечения по факту наличия осложнений. Очевидно, что в борьбе с сердечно-сосудистыми расстройствами нужна предупреждающая стратегия, направленная на устранение ведущих факторов риска и патогенетических механизмов их развития. Эндотелиальная дисфункция развивается в дебюте эндокринопатий [Shäfer А & Bauersachs J. 2008], поэтому целесообразно при изучении гемостаза делать акцент на изучение функциональной активности кровяных пластинок.

Коронароангиография - это инвазивный метод исследования коронарных артерий. Является «золотым стандартом» диагностики ишемической болезни сердца. Исследование проводят в стационарных условиях.

Методика проведения: под местной анестезией выполняют прокол бедренной артерии в области паховой складки (иногда используют другие артерии). В артерию вводят специальный катетер, продвигают его против тока крови по аорте к устью коронарных артерий. По катетеру подают специальное рентгеноконтрастное вещество, которое заполняет собой коронарные артерии. Далее выполняют ряд рентгеновских снимков в различных проекциях. После процедуры на место прокола бедренной артерии накладывают давящую повязку, пациент сутки соблюдает постельный режим.

Коронароангиография позволяет рассмотреть анатомические особенности сосудов сердца, тип коронарного кровоснабжения, выявить атеросклеротические бляшки, степень сужения просвета артерий. На основании результатов коронароангиографии производят выбор оптимальной тактики лечения ИБС. [Кардиология: национальное руководство. / Под ред. Ю.Н.Беленкова, Р.Г.Оганова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - С.249-254.]

Недостатки способа

1. Инвазивность метода.

2. Вероятность осложнений: кровотечение, тромбоз или аневризма артерий, повреждение сердечной стенки, аллергические реакции на контрастное вещество, контраст-индуцированная нефропатия.

3. Применение сложной аппаратуры: ангиографические установки, аппараты для мониторирования артериального давления, ЭКГ, наличие оборудования для борьбы с возможными осложнениями.

Ближайший аналог

Исследование биохимических показателей (липидный профиль) - определение липидного профиля, проводимого с помощью биохимического автоматического анализатора ADVIA 1650 (Bayer). Руководство по эксплуатации. США, 2008.

Основные стадии способа

1. Забор крови из вены в вакуэту в количестве 5 мл.

2. Помещение пробы в анализатор на 10 мин.

3. Анализ полученных результатов. Повышение концентрации липидов свидетельствует о наличии и/или высоком риске развития атеросклеротических поражений.

Недостатки способа

- Возможность несоблюдения требований по забору крови на доаналитическом этапе.

- Применение дорогостоящего автоматического анализатора.

- Трудоемкость.

- Погрешности в результатах.

- Снижение информативности.

Задачи предлагаемого изобретения - ранняя диагностика и своевременное предупреждение развития тромботических осложнений, сокращение сроков медико-социальной реабилитации, повышение эффективности лечения.

Сущностью изобретения является анализ агрегационных свойств тромбоцитов в обогащенной тромбоцитами плазме путем определения интегрального показателя тромбоцитарной активности (S) методом планиметрии либо полученной при помощи множественного регрессионного анализа зависимости в виде линейной функции от степени и скорости агрегации за 30 сек по формуле:

S=-0,263+1,029А-0,286В

где А - степень агрегации (%), В - скорость агрегации за 30 сек (%/мин), значение S>14 см² оценивают как условие повышенной степени активности кровяных пластинок и необходимость предупреждения тромбообразования. Установление количественной взаимосвязи нивелируется коэффициентами, позволяющими осуществить отход от единиц измерения.

Технический результат: за счет раннего выявления и своевременной коррекции гемостазиологических нарушений создаются возможности по снижению летальности, частоты осложнений, тяжести течения заболевания, повышению эффективности медико-социальной реабилитации.

Способ апробирован на контингенте больных сахарным диабетом 1 и 2 типа, акромегалией, гиперкортицизма, гипотиреозом аутоиммунного и послеоперационного генеза в дебюте диагностики заболевания и контрольной группе здоровых людей.

Интегральный показатель тромбоцитарной активности в дебюте эндокринопатий, Медиана (нижний и верхний квартили)
Сахарный диабет 1 типа n=47	Сахарный диабет 2 типа n=66	Акромегалия n=13	Гиперкортицизм n=11	Гипотиреоз (АИТ, послеоперационный) n=25	Контроль n=60
33,4	38	43	33	39,5	13,4
(27; 51)	(19; 49)	(22; 48)	(9,1; 42)	(17,7; 49)	(8,7; 21,5)
Примечание: n - количество больных

Способ осуществляют следующим образом. Исследование гемостаза проводят в ранние утренние часы с шести до семи часов утра, обязательно натощак с исключением курения и приема лекарственных препаратов на протяжении предшествующих 12 часов. Забор крови из вены осуществляют иглой с широким просветом без использования шприца и наложения жгута. Первые капли отбрасывают, т.к. в них содержится тромбопластин. Кровь в пробирке из несмачиваемого материала (пластик) сразу же смешивают с 3.8% раствором натрия лимоннокислого (цитрата) в соотношении 9:1.

С целью исследования агрегационной активности кровяных пластинок (ААКП) используют два типа плазмы - бедной и обогащенной тромбоцитами. Плазму, богатую тромбоцитами, используют для исследования функциональной активности кровяных пластинок, бестромбоцитарную плазму - для калибровки шкалы оптической плотности прибора и, при необходимости, для разведения богатой тромбоцитами плазмы до стандартного содержания клеток. При исследовании агрегационных свойств тромбоцитов чрезвычайно важна стандартизация суспензии клеток по их количеству. Обогащенную плазму получают центрифугированием цитратной крови в течение 5-10 минут при 1000-1500 об/мин (450-500 g). Плазму, бедную тромбоцитами (бестромбоцитарную), - путем повторного центрифугирования плазмы, богатой тромбоцитами, в режиме 15-20 минут при 3000-4500 об/мин (1200-2000g). Кровь разрабатывают, используя дозаторы с одноразовыми пластмассовыми наконечниками. Затем определяют классическим методом функциональную активность кровяных пластинок, путем изучения выраженности светорассеяния плазмы, богатой тромбоцитами, развивающегося в процессе тромбоцитарной агрегации (G.V.R.Born, 1962). Например, методом турбодиметрической детекции (фирма Solar, Беларусь). С помощью агрегометра измеряют изменение коэффициента пропускания исследуемой плазмы крови с красным светофильтром. Изменение оптических свойств исследуемого раствора в процессе агрегации тромбоцитов обусловлено уменьшением общей рассеивающей поверхности клеток в результате их склеивания друг с другом. Происходящее в процессе агрегации тромбоцитов изменение коэффициента светопропускания раствора характеризует ААКП. В зависимости от изменения коэффициента пропускания исследуемого раствора в кювете измеряется величина светового потока, прошедшего через раствор и попадающего на фотоприемник измерительного канала. Ток фотоприемника регистрируется электронной схемой через промежутки времени, равные секунде. Это позволяет регистрировать изменение коэффициента пропускания исследуемого раствора во времени, рассчитать параметры агрегатограммы и вывести результаты измерения на дисплей компьютера. Агрегометр работает в режиме АР - режим без нормировки результатов измерений по начальному уровню светопропускания плазмы, богатой тромбоцитами. Данный режим предназначен для стандартизации исследуемой плазмы крови по количеству тромбоцитов. За нулевой уровень принимается светопропускание перекрестного кюветного отделения (нулевое пропускание), за уровень 100% - светопропускание бестромбоцитарной плазмы. Тромбоциты при исследовании на агрегометре находятся в условиях, приближенных к физиологическим (собственный микромир), при стандартной температуре 37°С и постоянной скорости перемешивания, моделирующей кровообращение, в интактной среде (одноразовые пластиковые кюветы). Мерой агрегационного процесса является графически регистрируемое процентное падение оптической плотности плазмы в результате образования тромбоцитарных агрегатов, образующихся под воздействием индукторов агрегации. Первой ответной реакцией является изменение формы тромбоцитов, набухание, т.е. дискоидная форма, которая переходит в сферическую форму, характеризующуюся образованием многочисленных отростков. В этот момент на агрегатограмме может отмечаться кратковременный сдвиг исходной оптической плотности в сторону увеличения. За изменением формы тромбоцитов наступает первая фаза агрегации (первичная агрегация), вызываемая агрегационным средством. Этот процесс инициировали аденозиндифосфатом (АДФ). Активированные тромбоциты послойно укладываются, соединяясь в агрегаты посредством гликопротеинов внешней оболочки и фибриногена. Кривая агрегации смещается в сторону снижения оптической плотности светопропускания богатой кровяными пластинками плазмы крови. После окончания первичной агрегации крутизна агрегационной кривой снижается, в этот период из тромбоцитов освобождается сначала содержимое -гранул (реакция высвобождения), а затем плотных гранул - хранилища биологически активных соединений (АДФ, серотонин, тромбоксаны и пр.), усиливающих агрегационную волну (вторичная агрегация, вторая фаза агрегации), делая ее необратимой. В частности, присоединение индуктора активации к своему рецептору на поверхности тромбоцита активирует фосфолипазу С, которая путем отщепления от фосфолипидов мембраны диацилглицерола и инозитолтрифосфата способствует высвобождению ионов Са²⁺ из системы плотных канальцев в цитоплазму, а также активации фосфолипазы А₂ . В цитоплазме Са²⁺ соединяется с кальмодулином и образуется комплекс, активирующий сократительную систему филаментов: форма тромбоцита из дискоидной превращается в шиповидно-сферическую, в это время периферически расположенные микротубулы перемещаются в центр, увлекая за собой гранулы. Активированная фосфолипаза А₂ отщепляет от фосфолипидов арахидоновую кислоту. Из нее путем метаболических превращений образуется тромбоксан А₂, который вызывает высвобождение содержимого тромбоцитарных гранул и усиление агрегации тромбоцитов. Дозозависимая аденозиндифосфат-индуцированная агрегация, является удобной моделью для исследования, как первичной агрегации тромбоцитов, так и для оценки секреторных процессов в тромбоцитарных гранулах, и реакции освобождения содержащихся в них биологически активных субстанций (II фаза). Выраженность АДФ-агрегации при стандартном содержании тромбоцитов в плазме, постоянной температуре и скорости перемешивания зависит от применяемой концентрации аденозиндифосфата.

При исследовании агрегации тромбоцитов in vitro агрегационное вещество добавляют к плазме, богатой тромбоцитами. В работе использовали аденозиндифосфат фирмы «Технология-Стандарт» (Барнаул) в стандартной концентрации АДФ 1,25×10^-6 мкМ; это позволяет получить агрегационную кривую, отражающую процессы первичной агрегации (фиг.1). Необратимая агрегация тромбоцитов под действием АДФ наблюдается только в тех случаях, когда на поверхности пластинок обнаруживается тромбин и осуществляется его реакция с фибриногеном.

Принцип исследования. Запись агрегационных характеристик при помощи агрегометра производят следующим образом. В кюветное отделение аппарата устанавливают кювету с бестромбоцитарной плазмой обследуемого, светопроницаемость которой является исходной. Затем производят замену на кювету, содержащую плазму, богатую тромбоцитами и предварительно выдержанную в термостате в течение 5 минут при t=37°С. Агрегометр автоматически фиксирует спонтанную агрегацию при ее наличии и в течение 20 секунд подсчитывает начальную концентрацию тромбоцитов. После чего в кювету вносят индуктор агрегации (АДФ) в избранной концентрации и производят автоматическую запись кривой агрегации тромбоцитов. Анализируются следующие параметры АДФ агрегации: А - степень агрегации, В - скорость агрегации за 30 секунд, которые вычисляются автоматически анализатором (фиг.1).

Степень агрегации (А) - максимальная величина агрегации, соответствующая максимальному увеличению светопропускания плазмы после внесения индуктора, выраженная в процентах. Скорость агрегации (В) - процентное увеличение светопропускания плазмы за 30 секунд, измеряемое ПЭВМ от начала первичной и/или вторичной агрегационных волн на наиболее линейном участке ее подъема. Вторичная агрегация может не определятся, если вторичная волна на графическом изображении кривой агрегации агрегометром отсутствует (монофазная кривая). Кроме показателей, регистрируемых анализатором агрегации по методу G.V.R.Born (1962), для анализа сопоставимости размеров, методом планиметрии вычисляли интегральный показатель тромбоцитарной активности за шесть минут от начала процесса агрегации. Для этого кривую обратимой агрегации, необратимой или неполностью обратимой агрегации замыкали пересечением горизонтальной линии с вертикальной линией отметки времени в конце шестой минуты от начала процесса агрегации (фиг.2). Внутреннюю площадь фигуры разбивают на квадраты, длина и ширина которых равняется 1 см. По количеству сантиметров квадратных определяют площадь под кривой агрегатограммы либо расчет осуществляют по предложенной выше формуле.

S=-0,263+1,029×49(%)-0,286×67,7(%/мин)=21,5 см ²

Значение S>14 см² оценивают как условие гиперактивности кровяных пластинок.

Примеры

Пример 1, фиг.3, 4. Больная Г., 54 года. История болезни № 7743. Диагноз: Сахарный диабет 2 тип, впервые выявленный. Диабетическая ангиопатия сетчатки, диабетическая нефропатия 1. ИМТ 29 кг/м². АД 130/80 мм рт.ст. В лабораторных показателях - гликемия натощак 7,8 ммоль/л, общий холестерин 6,1 ммоль/л, холестерин ЛПНП - 4,9 ммоль/л, холестерин ЛПВП - 1,1 ммоль/л, триглицериды - 2,3 ммоль/л, гликированный гемоглобин - 7,4%. Клинических проявлений макроангиопатии нет. Исследована агрегационная активность кровяных пластинок

Гульман жен	Степень агрегации (%) 46
Отделение: Энд. История болезни: 7743	Время агрегации (мин:сек) 02:39
Реагент: АДФ Концентрация: 1.25 мкМ	Скорость за 30 сек (%/мин) 33.8
Диагноз Обследование	Кол-во тромбоцитов, тыс./мкл 224.2
	Дата: 27/02/02

S=-0,263+1,029×46-0,286× 33,8=37,4 см²

(фиг.3)

Назначена сахароснижающая терапия (метформин 1700 мг/сут), гиполипидемическая (розувастатин 10 мг/сут), антиагрегантная (ацетилсалициловая кислота 75 мг/сут) терапия.

Четыре года спустя. ИБ № 6982. Сахарный диабет 2 тип. Диабетическая ангиопатия сетчатки, диабетическая нефропатия 1. ИМТ 28 кг/м². В лабораторных показателях - гликемия натощак 5,6 ммоль/л, общий холестерин 4,5 ммоль/л, холестерин ЛПНП - 2,4 ммоль/л, холестерин ЛПВП - 1,4 ммоль/л, триглицериды - 1,4 ммоль/л, гликированный гемоглобин - 5,6%. Клинических проявлений макроангиопатии нет. Исследована агрегационная активность кровяных пластинок.

Гульман жен	Степень агрегации (%) 8.1
Отделение: Энд. История болезни: 6982	Время агрегации (мин:сек) 00:59
Реагент: АДФ Концентрация: 1.25 мкМ	Скорость за 30 сек (%/мин) 14.6
Диагоз Обследование	Кол-во тромбоцитов, тыс./мкл 223.0
	Дата: 13/03/06

S=-0,263+1,029×8,1-0,286×14,6=3,9 см²

(фиг.4)

Пример 2, фиг.5, 6. Больная Я. 56 лет. История болезни № 51570. Диагноз: Сахарный диабет 2 тип, впервые выявленный. Признаков диабетической микро- и макроангиопатии не обнаружено, семейный анамнез на наличие ранних коронарных или цереброваскулярных осложнений не отягощен. ИМТ 28 кг/м². АД 130/80 мм рт.ст. В лабораторных показателях - гликемия натощак 8,1 ммоль/л, общий холестерин 5,9 ммоль/л, холестерин ЛПНП - 4,6 ммоль/л, холестерин ЛПВП - 1,1 ммоль/л, триглицериды - 2,5 ммоль/л, гликированный гемоглобин - 7,6%. Клинических проявлений макроангиопатии нет. Исследована агрегационная активность кровяных пластинок.

Яманова жен	Степень агрегации (%) 53.7
Отделение: Энд. История болезни: 51570	Время агрегации (мин:сек) 01:52
Реагент: АДФ Концентрация: 1.25 мкМ	Скорость за 30 сек (%/мин) 57.4
Диагноз Обследование	Кол-во тромбоцитов, тыс./мкл 215.7
	Дата: 26/10/06

S=-0,263+1,029×53,7-0,286×57,4=38,6 см²

(фиг.5).

Назначена сахароснижающая терапия (метформин 1700 мг/сут), гиполипидемическая (розувастатин 10 мг/сут) терапия.

Три года спустя. ИБ № 31757. Диабетическая ангиопатия сетчатки, диабетическая нефропатия 1. Появились клинические проявления стенокардии напряжения II Ф.класса. В лабораторных показателях - гликемия натощак 5,8 ммоль/л, общий холестерин 5,1 ммоль/л, холестерин ЛПНП - 2,4 ммоль/л, холестерин ЛПВП - 1,3 ммоль/л, триглицериды - 1,6 ммоль/л, гликированный гемоглобин - 6,0%. Исследована агрегационная активность кровяных пластинок.

Яманова жен	Степень агрегации (%) 61
Отделение: История болезни: 31757	Время агрегации (мин:сек) 01:54
Реагент: АДФ Концентрация: 1.25 мкМ	Скорость за 30 сек (%/мин) 71.0
Диагноз Обследование	Кол-во тромбоцитов, тыс./мкл 231.5
	Дата: 29/06/09

S=-0,263+1,029×61-0,286×71,0=42,2 см², свидетельствующая о сохраняющемся повышенном риске тромбообразования (фиг.6).