способ прогнозирования повторных цереброваскулярных осложнений у больных гипертонической болезнью в сочетании с ишемической болезнью сердца в остром периоде ишемического инсульта

Формула изобретения

Способ прогнозирования повторных цереброваскулярных осложнений у больных гипертонической болезнью в сочетании с ишемической болезнью сердца в остром периоде ишемического инсульта путем исследования крови, отличающийся тем, что с помощью биолюминесцентного метода определяют уровни активности Г6ФДГ, НАДФМДГ, ГР и НАДФН-ГДГ тромбоцитов и о возможности возникновения или отсутствия осложнений судят по величине коэффициента соотношения реакций восстановления НАДФ⁺ и окисления НАДФН, при величине коэффициента <1,00 прогнозируют развитие осложнений, при величине 1,00 - отсутствие осложнений.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии и кардиологии, может быть применено для эффективной профилактики цереброваскулярных осложнений у больных гипертонической болезнью (ГБ) в сочетании с ишемической болезнью сердца (ИБС) после перенесенного ишемического инсульта (ИИ).

Известен способ прогнозирования течения ИИ, заключающийся в проведении в первые сутки острого нарушения мозгового кровообращения анализа сыворотки крови и ликвора на содержание мочевой кислоты. При содержании мочевой кислоты в сыворотке крови выше 390 мкмоль/л, в ликворе выше 140 мкмоль/л прогнозируют неблагоприятное течение (летальный исход) ишемического инсульта [3]. Недостатком способа является обязательное проведение больному ИИ спинномозговой пункции, что не всегда является легко выполнимой и необходимой манипуляцией.

Известен способ прогноза течения ИИ, заключающийся в проведения иммунофенотипирования лимфоцитов. Сущность способа состоит в том, что на 1, 10, 21-й день от момента развития ИИ определяют средний уровень CD95⁺-лимфоцитов. При значении уровня CD95⁺-лимфоцитов на 1-й день более 7,2±2,8% и возврате к норме на 21-й день прогнозируют благоприятный исход, при уровне CD95⁺-лимфоцитов выше 7,2±2,8% и сохранении среднего уровня показателя на 21-й день прогнозируют благоприятный прогноз для жизни и неблагоприятный для восстановления неврологического дефицита, а при значении среднего показателя СD95-лимфоцитов выше 29,12±3,1% прогнозируют неблагоприятный прогноз для жизни

[2]. Существенным недостатком данного способа является сложность расчетов и неоднократный забор крови у больных ИИ.

Известен способ прогнозирования клинического течения ИИ путем определения таких параметров гемостатической активации, как продукты деградации фибриногена D-димер, фибрин-мономерные растворимые комплексы (РКФМ), а также агрегационную активность тромбоцитов. Измерения производят в течение всего острейшего и острого периодов ишемического инсульта. В случае даже однократного увеличения концентрации D-димера более 1 мкг/мл и/или концентрации РКФМ более 50 мг% в сочетании со значительным снижением агрегации тромбоцитов до 10-15% по сравнению со значениями, выявленными в начале острейшего периода, прогнозируют вероятность летального исхода течения ишемического инсульта [1]. Недостатком способа является необходимость неоднократного определения исследуемых показателей гемостаза у больных ИИ.

В литературных источниках не обнаружено прогноза развития цереброваскулярных осложнений для пациентов, перенесших ИИ и страдающих сочетанной сердечно-сосудистой патологией (ГБ и ИБС).

Задачей предлагаемого способа является предупреждение возникновения повторных цереброваскулярных осложнений тромботического характера: острое нарушение мозгового кровообращения, транзиторная ишемическая атака, острый инфаркт миокарда, тромбоз периферических сосудов у больных ГБ в сочетании с ИБС после развития ишемического инсульта.

Поставленную задачу осуществляют за счет того, что с помощью биолюминесцентного метода определяют уровни активности Г6ФДГ, НАДФМДГ, ГР и НАДФН-ГДГ тромбоцитов и о возможности возникновения или отсутствия осложнений судят по величине коэффициента соотношения реакций восстановления НАДФ⁺ и окисления НАДФН, при величине коэффициента <1,00 прогнозируют развитие осложнений, при величине 1,00 - отсутствие осложнений.

Способ осуществляют следующим образом. У больных в первые сутки после развития ИИ утром, натощак при помощи венепункции острой иглой проводят забор свободным током венозной крови из локтевой вены в объеме 10 мл в пластиковую пробирку. В качестве антикоагулянта используют 3,8%-ный водный раствор цитрата натрия. Исследование проводят в течение одного часа после забора крови. Тромбоциты выделяют из венозной крови по методу, предложенному Савченко Е.А. с соавт. [4]. Для этого венозную кровь смешивают с 3,8%-ым водным раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. Обогащенную тромбоцитами плазму получают путем центрифугирования стабилизированной крови при 140 g в течение 10 минут. Из пробирки осторожно отбирают супернатант, переносят в чистую пробирку и доводят до 10 мл буфером № 1 (90 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 36 мМ цитрата натрия, 10 мМ ЭДТА, pH=7,2). Полученную смесь центрифугируют 15 мин при 400 g. Осадок ресуспензируют в 10 мл буфера № 1 и повторно центрифугируют 1 мин при 400 g. Отбирают 9 мл супернатанта, который вновь центрифугируют при 400 g в течение 15 мин. Супернатант аккуратно сливают, а к осадку добавляют 10 мл буфера № 2 (0,13 М NaCl, 0,02 М Трис-HCl буфера, 0,03 М ЭДТА, 0,015 М глюкозы, pH=7,4) и центрифугируют в том же режиме. После чего осадок разводят в 400 мкл буфера № 2 и центрифугируют 50 сек при 140 g. Для дальнейших исследований забирают 250 мкл супернатанта. Для определения активности НАДФН- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ из забранного супернатанта с тромбоцитами отбирают объем, содержащий 10⁷ клеток. Разрушают тромбоциты методом осмотического лизиса с доведением общего объема до 2,5 мл (конечная концентрация клеток составляет 4×10⁶ /мл). Активность Г6ФДГ, НАДФМДГ, ГР и НАДФН-ГДГ определяют с помощью биолюминесцентного метода. Для этого в 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат и кофактор, вносят 50 мкл суспензии разрушенных тромбоцитов. Конкретные значения концентраций субстратов и кофакторов, а также pH среды для определяемых ферментов представлены в таблице 1.

Таблица 1
Концентрация субстратов, кофакторов и показатели pH среды для определения активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в тромбоцитах крови биолюминесцентным методом
Фермент	Субстрат, мМ	Кофактор, мМ	РН буфера
Г6ФДГ	Г6Ф - 1,5	НАДФ - 0,025	9,8
НАДФМДГ	Малат - 7,5	НАДФ - 0,375	9,8
ГР	GSH - 0,5	НАДФН - 0,0025	7,4
НАДФН-ГДГ	Оксоглутарат - 100	НАДФН - 0,0025	7,4
Примечание: среду с pH 9,8 готовят на Трис-HCl буфере (ICN Biomedicals Inc., США); с pH 7,4 - на К+, Na+-фосфатном буфере (буфер готовят из K2HPO4 и NaH 2PO4 (Реахим, Россия)).

После инкубации исследуемых проб при 37°C в течение 30 минут для Г6ФДГ и НАДФМДГ или 5 минут для ГР и НАДФН-ГДГ к 200 мкл инкубационной смеси добавляют 50 мкл флавинмононуклеотида (ФМН) в концентрации 1,5×10 ^-5 М, 50 мкл 0,0005% миристинового альдегида и 10 мкл ферментативной системы НАДН:ФМНоксидоредуктаза-люцифераза (все реактивы биолюминесцентной системы разводят в 0,1 М K⁺, Na⁺-фосфатном буфере с pH 7,0). После смешивания биолюминесцентных реактивов и инкубационной пробы с помощью биохемилюминометра, например, марки БЛМ-8803 измеряют свечение. Учитывая, что в клетках имеется определенное количество субстратов для течения различных метаболических реакций, в том числе и катализируемых исследуемыми ферментами, определяют показатели, условно названные субстратный фон ферментов . Определение производят в тех же условиях, что и для вышеперечисленных дегидрогеназ, но в инкубационную смесь вместо соответствующего субстрата вносят буфер. В результате измерения свечения на биолюминометре получают относительные значения активности исследуемых ферментов. Чтобы получить абсолютные значения активности, строят графики зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации НАДФН (калибровочный график). Для этого 200 мкл стандартного раствора НАДФН в диапазоне 10^-9-10^-4 М вносят в кюветы биолюминометра, содержащие ФМН, миристиновый альдегид и НАДФН:ФМНоксидоредуктазу-люциферазу в концентрациях, указанных выше, после чего проводят измерение интенсивности биолюминесценции. В связи с широким диапазоном pH буферов, используемых для определения дегидрогеназной активности, а также pH-зависимостью биолюминесценции ферментативной системы из светящихся бактерий, калибровочные графики строят для каждого рН буфера. Активность НАДФ- и НАДФН-зависимых дегидрогеназ рассчитывают по формуле

A= [C]×V/T

где

A - активность дегидрогеназы, E (единица активности фермента) на 2×10 ⁵ тромбоцитов (1E=1 мкмоль/мин [1]);

[C] - разница концентраций НАДФН в пробах фермент и фон фермента , мкмоль;

V - объем пробы, мл;

T - время инкубации, мин.

Затем рассчитывают величину коэффициента соотношения реакций восстановления НАДФ⁺ и окисления НАДФН

При величине коэффициента <1,00 прогнозируют развитие осложнений, при величине 1,00 - отсутствие осложнений. Величина коэффициента соотношения реакций восстановления НАДФ⁺ и окисления НАДФН меньшая 1,00 свидетельствует о превалировании реакций окисления НАДФН над реакциями восстановления НАДФ⁺.

Данный способ подтвержден на 21 больном в остром периоде ишемического инсульта. Всем пациентам с острым нарушением мозгового кровообращения при поступлении в стационар проводили общепринятые лабораторные методы исследования крови: общий анализ, биохимический анализ с определением содержания холестерина и липидного спектра. Определение показателей системы гемостаза и уровней активности ферментов в тромбоцитах проводили в первые 24 часа после развития ИИ. Совпадение прогноза оценивали по факту возникновения цереброваскулярных осложнений у больных ГБ в сочетании с ИБС после развития ишемического инсульта (повторное ОНМК, ТИА, ОИМ, тромбоз периферических сосудов).

Таблица 2
Прогноз возникновения повторных сочетании с ИБС после развития цереброваскулярных осложнений у больных ГБ в ИИ по значению коэффициента НАДФ+/НАДФН
№	Коэффициент	Цереброваскулярное осложнение
есть	нет
1	2	3	4
1	НАДФ+/НАДФН	-	23,381
2	НАДФ+ /НАДФН	-	44,669
3	НАДФ+ /НАДФН	-	624,019
4	НАДФ+ /НАДФН	-	58,408
5	НАДФ+ /НАДФН	0,130	-
6	НАДФ+ /НАДФН	0,205	-
1	2	3	4
7	НАДФ+/НАДФН	0,859	-
8	НАДФ+/НАДФН	-	21,695
9	НАДФ+/НАДФН	-	6,999
10	НАДФ+/НАДФН	0,363	-
11	НАДФ+/НАДФН	-	11,887
12	НАДФ+/НАДФН	-	5,030
13	НАДФ+/НАДФН	0,174	-
14	НАДФ+/НАДФН	-	16,822
15	НАДФ+/НАДФН	0,989	-
16	НАДФ+/НАДФН	-	291,719
17	НАДФ+/НАДФН	0,696	-
18	НАДФ+/НАДФН	-	156,258
19	НАДФ+/НАДФН	-	12,763
20	НАДФ+/НАДФН	-	2,980
21	НАДФ+/НАДФН	-	19,272

По результатам обследования (кардиологического и неврологического осмотров, проведения эхокардиографии сердца, записи электрокардиограммы, холтеровского мониторирования) установлено, что в течение 12 месяцев после развития ИИ у 14 пациентов не было выявлено цереброваскулярных осложнений. У 7 - в диапазоне от 1 недели до 12 месяцев развилось одно из ишемических цереброваскулярных осложнений тромботического характера.

Таким образом, обнаружено совпадение прогноза возникновения повторных цереброваскулярных осложнений у больных ГБ в сочетании с ИБС, полученного путем определения коэффициента соотношения реакций восстановления НАДФ⁺ и окисления НАДФН в остром периоде ИИ, с результатами обследования пациентов через 12 месяцев (100%).

Клинический пример 1.

Больной Ч., 55 лет (история болезни № 19577), поступил в экстренном порядке в неврологическое отделение Муниципального Учреждения Здравоохранения Городская Клиническая Больница (МУЗ ГКБ) № 6 им. Н.С.Карповича г.Красноярска с диагнозом: Ишемический инсульт в бассейне левой среднемозговой артерии (ЛСМА) с правосторонней гемигипостезией. Кардиологический диагноз: Гипертоническая болезнь 3 степени, III стадии, риск 4, дислипидемия. ИБС. Стенокардия I ФК.

При поступлении в неврологическое отделение Муниципального Учреждения Здравоохранения Городская Клиническая Больница № 6 им. Н.С.Карповича г.Красноярска пациент предъявлял жалобы на головную боль, нарушение чувствительности в правых конечностях. Диагноз ИИ подтвержден при неврологическом обследовании и проведении компьютерной томографии (КТ) головного мозга.

Из анамнеза известно, что ранее острого нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) не было, с 2003 года подъемы АД до 240/130 мм рт.ст. С 2006 года клиника стенокардии напряжения на уровне I функционального класса (ФК), острый инфаркт миокарда (ОИМ) не переносил. Медикаментозной терапии не получал.

Результаты исследования системы гемостаза в 1-е сутки: гиперкоагуляция, тромбинемия, ослабление антикоагуляционного потенциала сосудистой стенки, снижение индуцированной агрегации тромбоцитов, повышение протромботической активности эндотелия.

При исследовании активности НАДФН- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ тромбоцитов было обнаружено, что коэффициент соотношения реакций восстановления НАДФ⁺ и окисления НАДФН составил 5,03, что указывает на отсутствие возникновения цереброваскулярных осложнений в течение года после перенесенного ИИ.

При обследовании через 12 месяцев в неврологическом отделении МУЗ ГКБ № 6 им. Н.С.Карповича у пациента не было выявлено цереброваскулярных осложнений. Не принимал лекарственную терапию.

Клинический пример 2.

Больная С., 57 лет (история болезни № 6718), в экстренном порядке поступил в неврологическое отделение Муниципального Учреждения Здравоохранения Городская Клиническая Больница № 6 им. Н.С.Карповича г.Красноярска с диагнозом: повторный ишемический инсульт в бассейне правой среднемозговой артерии (ПСМА). Кардиологический диагноз: Гипертоническая болезнь 3 степени, III стадии, риск 4. ИБС. Постинфарктный кардиосклероз (ПИКС). Стенокардия III функциональный класс (ФК). Сердечная недостаточность 2А стадии - III функциональный класс.

При поступлении в стационар пациентка предъявляла жалобы на слабость в левой ноге и левой руке, прихрамывание при ходьбе. Диагноз ИИ подтвержден при неврологическом обследовании, компьютерная томография головного мозга.

В анамнезе с 2000 года подъемы АД до 190/120 мм рт.ст. В 2001 и 2005 годах перенесла острое нарушение мозгового кровообращения. В 2003 году перенесла острый инфаркт миокарда, в последующем клиника стенокардии напряжения на уровне III функционального класса. Явления сердечной недостаточности с застоем большому кругу кровообращения. Не регулярно принимала гипотензивные препараты.

Результаты исследования системы гемостаза в 1-е сутки: гиперкоагуляция, тромбинемия, фибриногенемия, ослабление антикоагуляционного потенциала эндотелия, показатели агрегации тромбоцитов в пределах нормы, ослабление антиагрегационной активности сосудистой стенки на фоне повышения протромботической.

При исследовании активности НАДФН- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ тромбоцитов было обнаружено, что коэффициента соотношения реакций восстановления НАДФ⁺ и окисления НАДФН составил 291,72, что указывает на отсутствие обострения.

При обследовании пациентки через 12 месяцев в неврологическом отделении Муниципальное Учреждение Здравоохранения Городская Клиническая Больница № 6 им. Н.С.Карповича не было обнаружено цереброваскулярных осложнений. Гипотензивную и антиангинальную терапию принимала не регулярно.

Клинический пример 3.

Больной Г., 67 лет (история болезни № 10349), поступил в экстренном порядке в неврологическое отделение Муниципального Учреждения Здравоохранения Городская Клиническая Больница № 6 им. Н.С.Карповича г.Красноярска с диагнозом: Острое нарушение мозгового кровообращения по ишемическому типу в бассейне левой среднемозговой артерии. Кардиологический диагноз: ИБС. Постинфарктный кардиосклероз. Стенокардия III функциональный класс. Пароксизмальная форма фибрилляции предсердий. Гипертоническая болезнь 3 степени, III стадии, риск 4, дислипидемия. Сердечная недостаточность 2А стадии - III функциональный класс.

Жалобы при поступлении на нарушение речи, слабость, головокружение, головную боль, однократно рвоту. Диагноз ИИ подтвержден при неврологическом обследовании, компьютерной томографией головного мозга.

Из анамнеза известно, что в 2006 году перенес транзиторную ишемическую атаку (ТИА). С 1998 года подъемы АД до 180/90 мм рт.ст. В 2004 году перенес острый инфаркт миокарда, в последующем клиника стенокардии напряжения на уровне III функционального класса. С этого же времени пароксизмы фибрилляции предсердий. Явления сердечной недостаточности с застоем по малому кругу кровообращения. Не регулярно принимал антиаритмики.

Результаты исследования системы гемостаза в 1-е сутки: тромбинемия, гиперкоагуляция, ослабление антикоагулянтной активности эндотелия, индуцированная и спонтанная агрегация тромбоцитов в пределах нормы, повышение протромботической активности сосудистой стенки на фоне значительного ослабления антиагрегационной.

При исследовании активности НАДФН- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ тромбоцитов было обнаружено, что коэффициента соотношения реакций восстановления НАДФ ⁺ и окисления НАДФН составил 0,76, что указывает на развитие цереброваскулярного осложнения в течение года после перенесенного ИИ.

При обследовании пациента через 12 месяцев в неврологическом отделении МУЗ ГКБ № 6 им. Н.С.Карповича было выявлено, что у больного в течение года развился повторный ишемический инсульт. Гипотензивную и антиангинальную терапию принимала не регулярно.

Клинический пример 4.

Больной П., 60 лет (история болезни № 4561), в экстренном порядке поступил в неврологическое отделение Муниципального Учреждения Здравоохранения Городская Клиническая Больница № 6 им. Н.С.Карповича г.Красноярска с диагнозом: Повторное острое нарушение мозгового кровообращения по ишемическому типу в бассейне левой среднемозговой артерии. Кардиологический диагноз: Гипертоническая болезнь 3 степени, III стадии, риск 4. ИБС. Стенокардия II функционального класса. Сердечная недостаточность II А стадии - II функциональный класс.

При поступлении в стационар пациент предъявлял жалобы на нарушение речи, слабость, головную боль. Диагноз ИИ подтвержден при неврологическом обследовании, компьютерной томографии головного мозга.

Из анамнеза известно, что больной перенес 2 ишемических инсульта в 2004 году. В течение 10 лет подъемы АД до 180/100 мм рт.ст. Инфаркт миокарда не переносил, с 2000 года клиника стенокардии напряжения на уровне II функционального класса. Умеренные явления застоя по малому кругу кровообращения.

Результаты исследования системы гемостаза в 1-е сутки: гиперкоагуляция, тромбинемия, выраженное снижение антикоагулянтной активности сосудистой стенки, значительное повышение спонтанной и индуцированной активности тромбоцитов, выраженное ослабление антиагрегационной активности эндотелия на фоне повышения протромботической.

При исследовании активности НАДФН- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ тромбоцитов было обнаружено, что коэффициента соотношения реакций врсстановления НАДФ⁺ и окисления НАДФН составил 0,99, что указывает на развитие цереброваскулярного осложнения в течение года после перенесенного ИИ.

При обследовании через 12 месяцев в неврологическом отделении МУЗ ГКБ № 6 им. Н.С.Карповича было выявлено, что в течение года у пациента на фоне атеросклероза развился тромбоз периферических сосудов. Гипотензивную и антиангинальную терапию не принимал.

Приведенные примеры указывают на то, что, несмотря на однонаправленность изменений параметров системы гемостаза, у пациентов существенно различается прогноз развития цереброваскулярных осложнений.

Преимуществами предлагаемого способа являются:

1) возможность прогнозирования в первые сутки развития ИИ у больных ГБ в сочетании с ИБС возникновения повторных цереброваскулярных осложнений в течение 12 месяцев после ОНМК;

2) однократный забор только венозной крови;

3) высокий уровень совпадения прогноза - 100%.

Предложенный способ может быть рекомендован для применения в клинической практике неврологов, кардиологов, терапевтов.

Источники информации

1. Патент РФ № 2217754 С1, G01N 33/49, G01N 33/68, БИПМ № 33, 27.11.2003.

2. Патент РФ № 2236685 С1, G01N 33/577, БИПМ № 26, 20.09.2004.

3. Патент РФ № 2324941 C1, G01N 33/50, БИПМ № 14, 20.05.2008.

4. Савченко А.А. Биолюминесцентное определение активности НАД- и НАДФ-зависимых глутаматдегидрогеназ лимфоцитов // Лаб. дело. - 1991. - № 11. - С.22-25.