штамм гибридных культивируемых клеток животных mus. musculus, продуцирующий моноклональные антитела, специфичные к benzo[a]pyrene и benz[a]anthracene

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus BpBal, депонированный в специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур института Цитологии РАН под номером РККК(П) 723 Д, продуцирующий моноклональные антитела, специфичные к benzo[a]pyrene и benz[a]anthracene.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к гибридомной технологии, и представляет собой новый штамм гибридных клеток животных Mus. Musculus, продуцирующий в клеточных культурах и брюшной полости сингенных животных моноклональные антитела (мАТ) к benzo[a]pyrene (Bp) и benz[a]anthracene (Ba). Изобретение может быть использовано в научных исследованиях, перспективно для создания различных тест-систем для определения канцерогенных полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), антител (AT), специфичных к ним, а также для поиска пептидов-иммуномиметиков Bp и Ba, а в дальнейшем - для получения новых средств иммунопрофилактики рака - антиканцерогенных вакцин против ПАУ.

ПАУ присутствуют в качестве загрязнителей в окружающих средах (воздухе, воде, почве). Многие ПАУ классифицированы как профессиональные канцерогены. Bp является первым соединением группы ПАУ, для которого доказаны канцерогенная и мутагенная активности для человека. Его содержание коррелирует с общим содержанием ПАУ в образцах, взятых на анализ загрязнения среды. Соединения Bp с белком и ДНК являются биомаркерами влияния ПАУ на организм человека и животных [1]. В связи с этим многие работы, выполняемые в направлении профилактики воздействия химических канцерогенов, прежде всего акцентированы на защиту организма человека и животных от Bp.

В настоящее время в мире известно несколько гибридных клеточных линий (США, Чехия, Япония), продуцирующих мАТ специфичные к ПАУ, которые используются для выявления ПАУ в среде и их метаболитов и аддуктов с ДНК, в биологических жидкостях человека и животных, в иммуноферментных тест-системах [2, 3, 4].

Известен, например, штамм гибридных культивируемых клеток мыши Mus. Musculus 4D5, который был получен иммунизацией мышей конъюгатом 6-амино-Вр с альбумином сыворотки быка (BSA) [2]. Несмотря на то, что в качестве антигена при иммунизации использовали конъюгат Вр, наибольшую специфичность секретируемые мАТ 4D5 проявляли к pyrene. Кроме этого мАТ 4D5 не были исследованы на взаимодействие с неканцерогенными ПАУ.

Наиболее ближайшим к заявляемому штамму - прототипом является штамм гибридных культивируемых клеток мыши Mus. Musculus ВАР-14 [3]. Недостатком штамма ВАР-14 является то, что секретируемые им мАТ, проявляя высокую специфичность к Вр (в сравнении с неканцерогенными ПАУ), имеют низкую специфичность к Ва - вероятному канцерогену для человека.

Кроме того, ни штамм-аналог 4D5, ни штамм-прототип ВАР-14 не были исследованы на способность к связыванию с эндогенными соединениям (стероидным гормонам и ароматическим аминокислотам). Отсутствие такой способности является непременным условием при поиске пептидов-иммуномиметиков Вр и Ва и при получении антиканцерогенных вакцин.

Технической задачей настоящего изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши Mus. Musculus, продуцирующего мАТ, высокоспецифичные к безусловному канцерогену человека - Вр и к вероятному канцерогену - Ва, но с низкой специфичностью (кросс-реактивностью) к неканцерогенным ПАУ и эндогенным соединениям (стероидным гормонам и ароматическим аминокислотам).

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus BpBal, продуцирующим мАТ, обладающие высокой специфичностью к Вр и Ва.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии Balb/c иммунизируют конъюгатом Вр с BSA. Антиген вводят в подушечки лап и внутрибрюшинно. Клетки селезенки и лимфатических узлов иммунной мыши гибридизуют с клетками миеломы Sp-2/0 в присутствии полиэтиленгликоля по протоколу, описанному Kohler и Milstein [5]. Для культивирования и селекции гибридных клеток используют среду с добавлением азасерина и гипоксантина. Гибриды-продуценты отбирают с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием в качестве антигена конъюгата Вр с гексокиназой дрожжей. Наиболее продуктивный клон выводят в массовую культуру и обозначают BpBal.

Штамм депонирован в специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур института Цитологии РАН (г.Санкт-Петербург) под регистрационным номером РККК (П) 723Д.

Сущность изобретения состоит в том, что в результате слияния клеток миеломы мыши линии Sp-2/0, и спленоцитов, и лимфоцитов мышей BALB/c, иммунизированных конъюгатом Bp-BSA, при использовании в качестве слияющего агента полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500 и последующего клонирования методом предельных разведений получают гибридому BpBal, продуцирующую мАТ к Вр. Для оценки специфичности вырабатываемого гибридомой мАТ используют метод ИФА с использованием конъюгата Вр с гексокиназой дрожжей. MAT, секретируемые штаммом BpBal, позволяют проводить специфичное выявление Вр методами ИФА.

Конечный продукт - мАТ подкласса IgG1 (согласно методу иммунодиффузии по Ухтерлони) обладает высокой специфичностью к Вр и Ва, перекрестно, но значительно слабее, реагирует с chrysene, 11Н-benzo[a]fluorene, 11H-benzo[b]fluorene, pyrene, fluoranthene; не взаимодействует с anthracene, naphthalene, fluorene, stilbene, ароматическими аминокислотами и стероидными гормонами: progesterone, pregnenolone, estron, estradiol (по данным конкурентного ИФА).

При культивировании штамма используют питательную среду IMDM с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина, 2,5 мкг/мл амфотерицина Б. Клетки культивируют при 37°С в атмосфере 100% влажности с 5% CO₂. Для культивирования используют пластиковые планшеты или флаконы объемом 50 мл.

Штамм BpBal характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Культура клеток состоит из слабо прикрепившихся к поверхности культуральных флаконов округлых клеток одинаковой величины с крупными ядрами.

Культуральные признаки. Культура полусуспензионная. Посевная доза составляет 150 тыс.кл. на 1 мл. Время субкультивирования - 2-3 суток, кратность рассева 1:5-1:6. Метод снятия клеток - встряхивание. Штамм продуцирует мАТ на протяжении 15 пассажей в культуре.

Характеристика культивирования в организме животного. Для выращивания гибридом в асцитной форме клетки в количестве 10⁶ на мышь вводят в брюшную полость мышей линии BALB/c, сенсибилизированных за 3-60 дней вазелиновым маслом. Рост серозной опухоли отмечают на 7-12 день. Общий выход асцитной жидкости составляет 5-10 мл на мышь. Штамм может перевиваться.

Контаминация штамма. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Контроль на контаминацию микоплазмой и вирусами не проводился.

Видовая принадлежность Mus. Musculus.

Онкогенность. Гибридома при внутрибрюшинном введении вызывает серозные опухоли у мышей.

Характеристика полезного продукта. мAT относится к подклассу IgG1 (по данным иммуннодиффузии по Уохтерлони), специфично к Вр и Ва (согласно ИФА).

Биотехнологическая характеристика. Секретируемое гибридомой мАТ имеет титр около 1×10⁴ в культуральной жидкости и титр 1×10⁶ в асцитной жидкости (по данным ИФА). Стабильность продуцирования мАТ сохраняется на протяжении 15 пассажей в культуре и 2 пассажей на животных.

Криоконсервирование. Клетки замораживают в ростовой среде с 40% содержанием эмбриональной сыворотки теленка, 10% диметилсульфоксидом при температуре -70°С, хранят в жидком азоте. Жизнеспособность после размораживания составляет 50-70%.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Получение штамма BpBal

Мышей линии Balb/c иммунизируют конъюгатом Bp-BSA. Антиген вводят по следующей схеме: 1, 3, 7 недели - по 150 мкг конъюгата Bp-BSA в смеси с полным адъювантом Фрейнда в подушечки задних лап; 10 неделя - 450 мкг Bp-BSA в смеси с неполным адъювантом Фрейнда внутрибрюшинно и в подушечки задних лап; 12 неделя - 200 мкг Bp-BSA в забуференном физиологическом растворе внутрибрюшинно и в подушечки лап.

Через 3 дня после введения бустерной дозы конъюгата Bp-BSA клетки селезенки и лимфатических узлов иммунной мыши гибридизуют с клетками миеломы Sp-2/0 (соотношение 10:3) в присутствии полиэтиленгликоля (м.в. 1500). После гибридизации клетки высевают в 96-луночные планшеты по 3×10⁵ клеток в лунку. Для культивирования и селекции гибридных клеток используют среду IMDM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка, 5,7 мкM азасерина и 20 мМ гипоксантина. Гибриды-продуценты отбирают с помощью ИФА с использованием в качестве антигена конъюгат Вр с гексокинозой дрожжей. В результате получают штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus BpBal - продуцент мАТ, специфичного к Вр. Клонирование полученных гибридом методом лимитирующих разведений путем рассева клеток в лунки 96-луночного планшета проводят дважды, затем тестируют на секрецию AT и показывают, что доля клонов, сохраняющих продукцию AT заданной специфичности, составляет 100%.

Пример 2. Выявление иммобилизованного Вр.

Клетки штамма помещают в пластиковый флакон с площадью дна 25 см² по 1×10⁶ в 7 мл среды IMDM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина, 2,5 мкг/мл амфотерицина Б. Клетки культивируют 3-4 дня при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO₂. Культуральную среду вместе с клетками собирают, центрифугируют 10 мин при 200 g при 4°С, клетки отмывают 1 раз солевым раствором Хэнкса и в количестве 10⁶ клеток в 0,5 мл забуференного раствора внутрибрюшинно вводят мышам линии Balb/c, сенсибилизированным за 3-60 дней вазелиновым маслом. Через 7-12 дней образующуюся асцитную жидкость забирают, центрифугируют 10 мин при 200 g и 4°С. Полученные супернатанты культуральной и асцитной жидкостей используют как реагенты для изучения специфичности взаимодействия AT с Вр с помощью пятенного ИФА (дот-ИФА). На нитроцеллюлозные фильтры (диаметром пор 0,45 мкм) размером 4×4 мм с помощью микрошприца сорбируют 40 нг конъюгата Вр с гексокиназой в объеме 0,2 мкл. Для уменьшения неспецифического связывания фильтры инкубируют несколько минут с 0,1% казеином, разведенным в буфере TBS (0,02М трис-HCl, рН 7,5, 0,15М NaCl), разносят по лункам 96-луночного планшета и инкубируют в течение 4 часов при комнатной температуре с 50 мкл супернатантов культуральной или асцитной жидкости, разбавленных буфером TBS с 0,1% казеином, 0,05% твин-20. Фильтры отмывают буферным раствором TBS с 0,05% твин-20, вносят AT кролика против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, разведенные 1:10000 в забуференном растворе с 0,08% желатинолем и 0,05% твин-20. По окончании инкубации (1 час при комнатной температуре) фильтры отмывают описанным выше способом и проявляют в течение 30 мин раствором субстрата пероксидазы - перикиси водорода в присутствии хромогена - 4-хлор-1-нафтола. Положительный результат в исследуемых образцах оценивают по появлению пятен, окрашенных в темно-синий цвет. Положительным контролем служит иммунная сыворотка мыши. Отрицательными контролями - сыворотка крови неиммунизированной мыши и культуральная среда. Неспецифическую сорбцию метода оценивают по пробам, в которых использовали забуференный раствор вместо сывороток или культуральной среды. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1
Разведение культуральной жидкости	Интенсивность окраски пятна	Разведение асцитной жидкости	Интенсивность окраски пятна
1:2	++++	1:10	++++
1:3	++++	1:100	++++
1:10	++++	1:1000	++++
1:100	++++	1:10000	+++
1:1000	+++	1:100000	+++
1:10000	++	1:1000000	++
Контроль без мАТ	-	Контроль без мАТ	-

Данные, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о высокой специфичности мАТ, вырабатываемого клетками штамма BpBa1, к Вр и показывают возможность применения AT для выявления иммобилизованного Вр с помощью твердофазного иммуноферментного метода. Достоверное определение AT к Вр возможно при разбавлении культуральной жидкости 1:100-1:10000, асцитной жидкости 1:1000-1:1000000.

Пример 3. Взаимодействие мАТ BpBal с соединениями, содержащими в своей структуре циклические ароматические углеводороды.

В качестве антигенов используют соединения группы ПАУ, входящие в список US Environmental Protection Ageny, как наиболее распространенные в среде и представляющие опасность для здоровья животных и человека: Вр, Ва, chrysene, anthracene, pyrene, naphthalene, 11H-benzo[a]fluorene, 11H-benzo[b]fluorene, fluoranthene, fluorene, stilbene; a также ароматические аминокислоты - tryptophan, phenylalanine, и стероидные гормоны - progesterone, pregnenolone, estron, estradiol.

Для проведения конкурентного ИФА в лунки полистирольных планшетов («Медполимер», Россия) сорбируют конъюгат Bp-BSA в концентрации 5 мкг/мл, инкубируют 12 часов. После инкубации планшеты отмывают PBS (137 mM Nad, 2.68 mM KCl, 8.1 mM Na₂HPO₄·12H ₂O, 1.47 mM KH₂PO₄, рН 7.5) с 0.05% твин-20 (PBST). Участки неспецифического связывания насыщают 0,5%-ным раствором BSA в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре. Отмывают, как описано выше. В лунки вносят смесь мАТ BpBal в постоянной концентрации 100 нг/мл с разным количеством конкурирующих антигенов, которую предварительно инкубируют в течение 30 мин при 37°С. Планшеты инкубируют в течение часа при 37°С. Отмывают PBST. Вносят конъюгат пероксидазы хрена с AT кролика, специфичными к IgG мыши, в разведении 1:10000, инкубируют в течение часа при 37°С. Отмывают сначала PBST, потом PBS и добавляют субстрат - перекись водорода в присутствии ТМВ (3,3,5,5-тетраметилбензидин). Оптическую плотность (OD) измеряют на микропланшетном ридере (ФФМ, Россия) при 450 нм. Чувствительность мАТ BpBa1 к Вр и другим соединениям определяют по количеству Вр или другого соедиения, необходимого для 50% ингибирования связывания мАТ с конъюгатом Bp-BSA. Чем больше количество конкурирующего агента, необходимого для 50% ингибирования связывания мАТ с иммобилизованным конъюгатом Bp-BSA, тем меньше чувствительность мАТ по отношению к исследуемому соединению. Количество конкурирующего соединения, добавляемого в лунку, выражают в рМ. Результаты конкурентного иммуноферментного анализа представлены на фиг.1.

Данные, приведенные на чертеже, свидетельствуют о высокой специфичности мАТ, вырабатываемыми клетками штамма BpBal к Вр и Ва. Количество конкурента, необходимое для 50% ингибирования связывания мАТ BpBal с иммобилизованным на пластике конъюгатом Bp-BSA для ряда гаптенов, составляло следующие значения: для Вр - 6 рМ, Ва - 8 рМ, chrysene - 9 рМ, pyrene - 66 рМ, anthracene - 700 рМ, fluoranthene - 530 рМ, 11H-benzo[a]fluorene - 19 рМ и 11H-benzo[b]fluorene - 36 рМ.

мAT штамма BpBal не реагируют со стероидными гормонами - progesterone, pregnenolone, estron, estradiol и ароматическими аминокислотами - tryptophan и phenylalanine. Значения чувствительности больше 10000 рМ.

Для ранжирования специфичности мАТ BpBa1 определяют значения кросс-реактивности (CR). Сначала результаты конкурентного ИФА выражают как "процент ингибирования" (PI), который вычисляется по формуле: PI=(MAX-TEST)/MAX·100%. Где MAX - среднее значение показателей абсорбции в лунках, которые получены при связывании мАТ с Bp-BSA без добавления конкурента; TEST - показатели связывания мАТ с иммобилизованным конъюгатом Bp-BSA с добавлением разного количества родственного соединения. По полученному графику зависимости процента ингибирования связывания мАТ с Bp-BSA от количества конкурирующего антигена находят значение, соответствующее 50% ингибированию (IC₅₀). Затем кросс-реактивность вычисляют по формуле: CR=IC₅₀ (Bp)/IC₅₀ (ПАУ)·100%. Значение кросс-реактивности для Вр принимают за 100%. Чем ниже показатель кросс-реактивности, тем ниже специфичность мАТ по отношению к данному соединению.

Значения чувствительности и кросс-реактивности (CR) с исследуемыми соединениями представлены в таблице 2.

Таблица 2
Соединения	Чувствительность, рМ	CR (%)
ПАУ:
Benzo[a]pyrene	6	100
Benz[a]anthracene	8	78
Chrysene	9	70
11H-benzo[a]fluorene	19	31
11H-benzo[b]fluorene	36	17
Pyrene	66	9
Fluoranthene	530	1
Anthracene	700	0.9
Naphthalene	>10000	<0.1
Fluorene	>10000	<0.1
Stilbene	>10000	<0.1
Ароматические аминокислоты:
tryptophan	>10000	<0.1
phenylalanine	>10000	<0.1
Стероидные гормоны:
progesterone	>10000	<0.1
pregnenolone	>10000	<0.1
estron	>10000	<0.1
estradiol	>10000	<0.1

Из таблицы 2 видно, что показатель кросс-реактивности для Ва составляет 78%, а показатели кросс-реактивности в ряду от chrysene до anthracene уменьшаются от 70% до 0.9%.

Значения кросс-реактивности для naphthalene, fluorine, stilbene, a также для ароматических аминокислот и стероидных гормонов менее 0.1%.

Сравнительная характеристика специфичности заявляемого мАТ BpBal с аналогом (мАТ 4D5) и прототипом (ВАР-14) представлена в таблице 3.

Таблица 3
CR, % мАТ	100	99-75	74-50	49-25	24-0
мАТ	Вр	Ва	chrysene	pyrene	fluoranthene,
BpBa1					anthracene
4D5,				pyrene	Вр
[2]
ВАР-14	Вр	chrysene,	anthracene,	pyrene	fluorene
[3]		fluoranthene	Ва

Таким образом, полученный штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus BpBal является продуцентом мАТ, специфичных к Вр и Ва. мAT, продуцируемые заявляемым штаммом мАТ BpBa1, значительно превосходят аналог (мАТ 4D5), у которого специфичность к pyrene больше, чем к Вр, и прототип (мАТ ВАР-14), у которого специфичность к chrysene и fluoranthene больше, чем к Ва.

мAT заявляемого штамма могут быть использованы для разработки на их основе чувствительных и специфичных тест-систем для определения канцерогенных ПАУ и AT к ним, а также для поиска пептидов-иммуномиметиков Вр и Ва, и в дальнейшем - для получения антиканцерогенных вакцин против ПАУ.

Источники информации

1. International Agency for Recearch on Cancer Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans. Polynuclear Aromatic Compounds. Part I: International Agency for Recearch on Cancer. Lyon. France, 1983: Vol.32.

2. Gomes M., Santella R.M. Immunologic methods for the detection of benzo[a]pyrene metabolites in urine. Chem. Res. Toxicol, 1990, 3, 307-310.

3. Scharnweber Т., Fisher M., Suchanek M., Knopp D., Niessner R. Monoclonal antibody to polycyclic aromatic hydrocarbons based on a new benzo[a]pyrene immunogen. Fresenius J Anal Chem, 2001, 371, 578-585.

4. Yamashita N. et al. Anti-РАН monoclonal antibodies and cell lines producing the same. United State Patent № US 6277964 В1, 2001.

5. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 1975, 256, 495-497.