способ укоренения растений, полученных в культуре in vitro

Формула изобретения

Способ укоренения растений, полученных в культуре in vitro, с использованием безгормональной среды Мурасига и Скуга, содержащей половинный набор макросолей и витаминов, агар (7 г/л), сахарозу (10 г/л), отличающийся тем, что при переносе на среду указанного состава побеги льна не заглубляют в питательную среду, а культивируют на границе «питательная среда/воздух», при этом чашки Петри, заполненные средой указанного состава, проходят следующие этапы подготовки: заливают 25-30 мл среды в чашку Петри диаметром 90 мм; отделяют с помощью скальпеля и удаляют половину среды, как показано на фигуре 1; отступив от верхней границы оставшейся половины среды 50 мм, прорезают «окошко» практически на всю ширину чашки (примерный размер 50×80 мм), как показано на фигуре 2; отделенные от каллуса побеги помещают в подготовленную, как изложено выше, чашку Петри, горизонтально протыкая «мостик» из среды, как показано на фигуре 3; продвигают побег до тех пор, пока срез стебля слегка не коснется поверхности той части среды, которая расположена ниже «окошка», как показано на фигуре 4; чашки Петри с помещенными в них побегами размещают на световых установках вертикально.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности, к тем методам культивирования в условиях in vitro, где требуется укоренение полученных растений-регенерантов и адаптация их к естественным условиям выращивания (ex vitro). Изобретение может успешно использоваться в технологиях на основе культивируемых тканей и клеток растений, а именно: получение биологически активных веществ растительного происхождения, ускоренное микроклональное размножение, получение безвирусных растений, получение растений после отдаленной гибридизации, антерные культуры (гаплоиды, дигаплоиды), клеточный мутагенез и селекция, соматическая гибридизация, генетическая трансформация.

Известно, что корнеобразование (ризогенез) и последующая адаптация к почвенным условиям являются наиболее трудно выполнимыми этапами в культуре in vitro для любого растительного материала и в высокой степени для льна, регенеранты которого характеризуются особенно низкой адаптационной способностью [1, 2].

В используемых методах для получения корней у регенерантов льна меняют основной состав среды, уменьшая в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей по рецепту Мурасига и Скуга [1, 3, 4] или заменяют ее средой Уайта [5], уменьшают количество сахаров до 0,5-1% и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин [6]. В качестве стимулятора корнеобразования применяют -индолил-3-масляную кислоту, -индолил-уксусную кислоту [7] или -нафтил-уксусную кислоту [7, 8]. Кроме этого, применяется затемнение нижней части сосуда, что также стимулирует корнеобразование [5].

Аналогами заявляемого способа индукции корнеобразования могут считаться способы получения корней на жидких питательных средах. В данных способах для поддержания побегов используются подложки из парафиновых дисков, П-образных полосок фильтровальной бумаги, пенопластовых тонких пластинок либо пластинок из любого другого инертного пористого материала [5, 9]. Полоски загибаются, концами вниз помещаются в пробирку так, чтобы образовавшаяся горизонтальная плоскость материала оказалась чуть выше уровня жидкой среды. Культивирование эксплантов происходит на подложке. Данные способы неудобны в исполнении, так как требуются многочисленные сложные манипуляции в стерильных условиях, к тому же микропобеги льна проблематично закрепить на подложке. Кроме того, использование парафиновых дисков может иметь отрицательное воздействие на корнеобразование и качество корневой системы из-за ухудшения аэрации микропобегов [9].

Наиболее близким к заявляемому является метод, в котором используется безгормональная среда Мурасига и Скуга, содержащая половинный набор макросолей и витаминов, агар (7 г/л) и сахарозу (10 г/л) [1].

Несмотря на варьирование состава сред способ получения корней у регенерированных побегов льна во всех методиках одинаков: побеги длиной 2-2,5 см отделяют от каллуса и заглубляют в выбранной среде так, чтобы побег сохранял вертикальное положение. В течение довольно длительного промежутка времени (1-2 месяца) формируются корни. Данный способ имеет существенные недостатки. При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах происходит постепенное накопление веществ токсического действия (фенольные соединения), что приводит к формированию растений с измененной морфологией [10]. Возможно накопление этилена, вызывающего эпинастию и хлороз [10, 11]. Вместе с тем, наблюдаются такие нежелательные эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем, образование верифицированных (оводненных) побегов и, как следствие, уменьшение способности растений к укоренению. При заглублении побегов в среду культивирования уменьшается аэрация нижней части стебля растения-регенеранта. В таких условиях образование корней затруднено, а образовавшиеся корни обладают сниженной биосинтетической активностью, замедляется поглощение воды и солей, что вызывает ослабление роста побегов [12].

В связи с этим задача заявляемого способа состоит в создании определенных условий культивирования, стимулирующих ризогенез, у растений-регенерантов.

Для решения поставленной задачи разработана методика стимулирования корнеобразования. Сущность заявленного способа состоит в том, что при переносе на среду для ризогенеза побеги льна не заглубляются в питательную среду, а культивируются на границе - питательная среда/воздух.

Известно, что у молодых тканей с высоким содержанием физиологически активного материала (в данном случае срез стебля регенерированного побега) интенсивность клеточного дыхания выше, чем у зрелой ткани. Также известно, что образование вторичных корней происходит из клеток камбия. Заявляемый способ основан на улучшении аэрации камбиальной зоны стебля, что приводит к увеличению активности клеток этой зоны, и, следовательно, способствует образованию корней.

Для заявляемого способа используется безгормональная среда Мурасига и Скуга, содержащая половинный набор макросолей и витаминов, агар (7 г/л), сахарозу (10 г/л). Далее следует специальная подготовка чашек Петри, заполненных средой указанного состава. Подготовка включает следующие этапы:

1) заливают 25-30 мл среды в чашку Петри диаметром 90 мм;

2) отделяют с помощью скальпеля и удаляют половину среды (фиг.1);

3) отступив от верхней границы оставшейся половины среды 50 мм, прорезают «окошко» практически на всю ширину чашки (примерный размер 50×80 мм) (фиг.2);

4) отделенные от каллуса побеги помещают в подготовленную, как изложено выше, чашку Петри, горизонтально протыкая «мостик» из среды (фиг.3);

5) продвигают побег до тех пор, пока срез стебля слегка не коснется поверхности той части среды, которая расположена ниже «окошка» (фиг.4);

6) чашки Петри с помещенными в них побегами размещают на световых установках вертикально.

При реализации проектов с применением биотехнологических методов на культуре льна в основном используются сорта льна масличного [13, 14, 15]. Они обладают более высокой регенерационной способностью по сравнению с сортами льна-долгунца [16]. При разработке заявляемого способа мы использовали генотипы сортов и льна масличного, и льна-долгунца. Индукция ризогенеза по заявляемому методу позволяет одинаково успешно получать функциональные корни у побегов льна обоих типов. Наблюдаемое интенсивное развитие корневой системы (фиг.5A, Б) способствует быстрому установлению оптимального эндогенного баланса гормонов, что позволяет растениям легко адаптироваться к условиям выращивания ex vitro (фиг.6А, Б).

В результате проведенных нами наблюдений установлено, что индукция ризогенеза заявляемым способом

- сокращает сроки образования корней до 10-20 дней по сравнению с 30-60 днями, если пользоваться общепринятой методикой;

- повышает эффективность ризогенеза до 80% по сравнению с 10-20%, если пользоваться общепринятой методикой;

- позволяет получить хорошо развитую корневую систему, что облегчает адаптацию побегов к условиям ex vitro;

- позволяет получать корни у генотипов льна с различной регенерационной способностью.

Источники информации

1. Поляков А.В. Биотехнология в селекции льна. Тверь. 2000. 150 с.

2. Pretova A., Obert В. and Bartosova Z. Flax // Biotechnology in Agriculture and Forestry. Vol.6. Transgenic Crops VI Red. by E.C. Springer-verlag Berlin Heidelberg. 2007. P.129-140.

3. Поляков А.В., Кельнер Е.В. Органогенез и регенерация у льна-долгунца в культуре in vitro // Технические культуры: М.: Агропромиздат, 1991. С.192-199.

4. Burbulis N., Blinstrubiene A., Kupriene R., Sliesaravicius A., Venskutoniene E. Optimization of Linseed flax (Linum usitatissimum L.) in vitro cultures // Zemdirbyste. Agriculture. V.94. N4. 2007. P.120-128.

5. Основы биотехнологии растений. Культура клеток и тканей: Учебное пособие / Составители: Сорокина И.К., Старичкова Н.И., Решетникова Т.Б., Гринь Н.А. СГУ им. Н.Г.Чернышевского. 2002. 45 с.

6. Teguh Wijayanto and Alan McHughen. Genetic transformation of Linum by particle bombardment // In Vitro Cell. Dev. Biol. - Plant 35:456-465, November-December, 1999.

7. Rutkowska-Krause I., Mankowska G., Poliakov A.V. Regeneration ofandrogenic flax (Linum usitatissimum L.) plants and their application in breeding programme // Natural Fibres. 2002, P.92-101.

8. Wang Yu Fu, Kang Qing Hua, Liu Yan, Li Xi Chen, Liu Shao Jun, Xu Ying. Study on Flax Genetic Transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens // J. Natural Fibres, Vol.1(1) 2004, P.1-10.

9. Пронина И.Н. Оптимизация процесса ризогенеза подвоев и сортов яблони и груши in vitro. Автореферат канд. дисс. Мичуринск, 2008. 23 с.

10. Кузьмина Н.А. Основы биотехнологии // http://www.biotechnolog.ru/, 2005.

11. Бабикова А.В., Горпенченко Т.Ю., Журавлев Ю.Н. Растение как объект биотехнологии. КОМАРОВСКИЕ ЧТЕНИЯ. Вып.LV. 2007. С.184-211.

12. Крамер П.Д., Козловский Т.Т. Физиология древесных растений. 1983. 464 с.

13. Баер О.А., Баер Г.Я., Емец А.И., Блюм Я.Б. Введение в культуру in vitro и регенерационная способность сортов льна-долгунца с различной устойчивостью к полеганию // Физ. и биох. культ, растений. 2004. Т.36. № 1. С.48-54.

14. Поляков А.В., Чикризова О.Ф., Каляева М.А., Захарченко Н.С., Балохина Н.В., Бурьянов Я.И. Трансформация растений льна-долгунца // Физиол. растений. 1998. Т.45. № 6. С.882-887.

15. Wang Yu Fu, Kang Qing Hua, Liu Yan, Li Xi Chen, Liu Shao Jun, Xu Ying. Study on Flax Genetic Transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens // J. Natural Fibres, Vol.1(1) 2004. P.1-10.

16. Yelena Guzenko, Valentina Lemesh, Lyubov Khotyleva. Comparative analysis of regenerative ability in linseed and fiber flax cultivars // INTERNATIONAL SCIENTIFIC CONFERENCE Actualities in Plant Physiology 12-13 June, 2008, Babtai, Lithuanian Institute of Horticulture. P.58-59.