аллель snp41 гена pde4d, его применение для прогнозирования индивидуальной предрасположенности к инсульту в русской популяции, применение молекулярно-генетического маркера индивидуальной предрасположенности к инсульту и способ прогнозирования индивидуальной предрасположенности к инсульту
Классы МПК: | C12N15/00 Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев |
Автор(ы): | Бондаренко Елена Александровна (RU), Тупицына Татьяна Викторовна (RU), Шамалов Николай Анатольевич (RU), Шетова Ирма Мухамедовна (RU), Скворцова Вероника Игоревна (RU), Наседкина Татьяна Васильевна (RU), Заседателев Александр Сергеевич (RU), Сломинский Петр Андреевич (RU), Лимборская Светлана Андреевна (RU) |
Патентообладатель(и): | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (ГОУ ВПО РГМУ Росздрава) (RU), Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство образования и науки Российской Федерации (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2010-04-22 публикация патента:
27.06.2011 |
Изобретение относится к биотехнологии и касается аллеля A SNP41 гена PDE4D, а также его применения в качестве диагностического маркера для оценки индивидуальной предрасположенности к инсульту в русской популяции. Изобретение позволяет диагностировать предрасположенность к инсульту в русской популяции, а следовательно, своевременно и адекватно назначать соответствующие медикаменты. 4 н.п. ф-лы, 1 табл.
Формула изобретения
1. Аллель SNP41 гена PDE4D, представляющий собой молекулярно-генетический маркер индивидуальной предрасположенности к инсульту в русской популяции.
2. Применение аллеля SNP41 гена PDE4D для прогнозирования индивидуальной предрасположенности к инсульту в русской популяции.
3. Применение аллеля SNP41 гена PDE4D в качестве молекулярно-генетического маркера индивидуальной предрасположенности к инсульту в русской популяции.
4. Способ прогнозирования индивидуальной предрасположенности к инсульту в русской популяции, включающий анализ полиморфизма гена PDE4D на наличие аллеля А SNP41, в случае выявления наличия указанного варианта аллеля прогнозируется предрасположенность к инсульту.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к биотехнологии и касается аллеля гена PDE4D, а именно SNP41.
Сосудистые заболевания головного мозга и, в частности, инсульт, - одна из наиболее важных и актуальных медицинских проблем нашего общества. Широкое распространение инсульта, высокий процент смертности и тяжелой инвалидизации определяют приоритетность исследований в области изучения патогенеза развития этого заболевания.
Инсульт - это острое нарушение мозгового кровообращения, приводящее к повреждению ткани головного мозга и расстройству его функций. Согласно международным эпидемиологическим исследованиям в мире от инсульта ежегодно умирают 4,7 миллионов человек. В нашей стране инсульт занимает второе место в структуре общей смертности, уступая лишь кардиоваскулярной патологии. Ежегодная смертность от инсульта в России - одна из самых высоких в мире (175 человек на 100 000 населения). 80% из выживших после инсульта больных становятся инвалидами, у 50% наступает повторный инсульт в последующие 5 лет жизни.
В настоящее время в изучении генетической предрасположенности инсульта, равно как и других мультифакторных заболеваний, используется анализ генетических ассоциаций, с помощью которого проводится изучение кандидатных генов, участвующих в формировании основных факторов риска сосудистой патологии. В последние несколько лет анализ генетических ассоциаций используется и для изучения аспектов индивидуальной чувствительности мозга к ишемическому повреждению и возможному прогнозированию течения и исхода заболевания.
Ген PDE4D кодирует фософодиэстеразу 4Д, которая относится к PDE4-семейству суперсемейства фосфодиэстераз и участвует в избирательном гидролизе цАМФ и цГМФ. Известно, что уменьшение уровня цАМФ приводит к усилению пролиферации и миграции сосудистых гладкомышечных клеток in vitro. Такие процессы, как известно, приводят к образованию фиброзной бляшки [Fukumoto S. и соавт., 1999; Houslay M.D. и соавт., 2003; Pan X. и соавт., 1994; Palmer D. и соавт., 1998].
Кроме того, на модельных животных было показано, что применение антагонистов PDE4 ингибирует пролиферацию данного типа клеток [Indolfi С. и соавт., 1997; Indolfi С. и соавт., 2000]. Ген PDE4D также экспрессируется в активированных макрофагах и, следовательно, PDE4D может принимать участие в процессе воспаления в атеросклеротической бляшке. Таким образом, фосфодиэстераза 4D может быть вовлечена или в процесс атерогенеза или нестабильности атеросклеротичекой бляшки, или в оба процесса [Lusis A.J. и соавт., 2000; Libby P., 2002; Naghavi М. и соавт., 2003].
Ген PDE4D размером 1600 тпн состоит из 22 экзонов и имеет, по крайней мере, 7 промоторов. В результате альтернативного сплайсинга или использования определенных промоторов этот ген может экспрессировать как минимум 8 функционально различных изоформ белка: 2 короткие формы (PDE4D1 и PDE4D2) и 6 длинных (PDE4D3,4,5,7,8 и 9) [Munshi A., Kaul S. Stroke genetics - focus on PDE4D gene // Int. J. Stroke. 2008. V.3. № 3. P.188-192]. Все изоформы имеют одинаковый С-концевой каталитический домен и отличаются по структуре N-концевого домена. Разные варианты PDE4D экспрессируются во многих типах клеток и тканей различных органов, включая мозг, легкие, почки, моноциты, В и Т лимфоциты и сосудистые гладкомышечные клетки [Szpirer С. и соавт., 1995; Bevan S. и соавт., 2004].
Ранее в уровне техники на линиях EBV-трансформированных В-лимфоцитов было показано, что у больных инсультом значительно понижен уровень тотальной мРНК PDE4D по сравнению с контрольной группой. Эта разница возникала вследствие более низкой экспрессии мРНК изоформ PDE4D1, PDE4D2 и PDE4D5 [Gretarsdottir S., Thorleifsson G., Reynisdottir S.T. et al. The gene encoding phosphodiesterase 4D confers risk of ischemic stroke // Nature Genetics. 2003. V.35. № 2. P.131-138]. Пока не выяснено, как пониженный уровень определенных изоформ фермента фосфодиэстеразы 4D участвует в патогенезе инсульта. По одной из гипотез снижение уровня экспрессии одной или нескольких изоформ фосфодиэстеразы 4D или изменение их баланса в результате нарушения регуляции экспрессии или сплайсинга увеличивает риск развития ишемического инсульта [Bersano A., Ballabio E., Bresolin N. et al. Genetic polymorphisms for the study of multifactorial stroke // Hum. Mutat. 2008. V.29. № 6. P.776-795}.
В гене PDE4D было обнаружено 260 однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП). Gretarsdottir S. et al. определили 3 гаплоблока A, B и C, охватывающих первые 3 экзона гена PDE4D и прилежащие к ним участки: гаплоблок A (экзоны D7-3 и D7-2, 300 тпн, содержит 19 ОНП с MAF>20%), гаплоблок B (первый экзон D7-1, 200 тпн, содержит 22 ОНП с MAF>20%) и гаплоблок С (примыкает к гаплоблоку B, 60 тнп, содержит 25 ОНП с MAF>20%) [Gretarsdottir S., Thorleifsson G., Reynisdottir S.T. et al. The gene encoding phosphodiesterase 4D confers risk of ischemic stroke // Nature Genetics. 2003. V.35. № 2. P.131-138].
Положительные ассоциации между ОНП в гене PDE4D и инсультом были показаны на некоторых выборках из различных неевропейских стран, таких как США (для SNP56, гаплоблок B), Пакистан (для SNP83, гаплоблок A), Япония (для SNP83) и Австралия (для SNP83, SNP87 и SNP89, гаплоблок A). Эти результаты не удалось воспроизвести в Европе, где только van Rijn et al. сообщили о положительной ассоциации в небольшой популяции в Нидерландах (для SNP39 и SNP45, гаплоблок В) [Gulcher J.R., Gretarsdottir S., Helgadottir A. et al. Genes contributing to risk for common forms of stroke // Trends Mol. Med. 2005. V.11. № 5. P.217-224]. Gretarsdottir S. и др. показали, что SNP41 (гаплоблок B) и SNP87 (гаплоблок А) ассоциированы с кардиоэмболическим и атеросклеротическим инсультом в исландской популяции [Gretarsdottir S., Thorleifsson G., Reynisdottir S.T. et al. The gene encoding phosphodiesterase 4D confers risk of ischemic stroke // Nature Genetics. 2003. V.35. № 2. Р.131-138]. Кроме того, не было найдено ассоциаций между ОНП, входящих в состав гаплоблока C, с риском развития инсульта. Таким образом, имеются противоречивые данные об ассоциации гена PDE4D с риском развития данного заболевания.
В связи с этим представляет интерес анализ полиморфизма гена PDE4D у больных инсультом в остром периоде.
Задачей изобретения является идентификация аллеля гена PDE4D, который отвечает за предрасположенность к инсульту, и его применение для диагностики повышенного риска возникновения инсульта.
Для решения поставленной задачи проводили анализ двух однонуклеотидных полиморфизмов - SNP41 (rsl52312) и SNP87 (rs2910829), которые относятся к разным гаплогруппам (гаплоблок А и гаплоблок В соответственно) у больных с острым инсультом (n=577, средний возраст 67±12,6) г. Москвы и в контрольной выборке (n=270, средний возраст 51,7±9,1), соответствующей ей по полу и этнической принадлежности. Подбор и клиническое обследование пациентов проводили на кафедре фундаментальной и клинической неврологии РГМУ на базе ГКБ № 31 г.Москвы. Взятие крови производилось на вторые или третьи сутки от момента наступления инсульта.
Возможно экстраполировать результаты, полученные на московской субпопуляции на всю русскую популяцию, так как московская субпопуляция не является изолированной, а напротив, содержит в себе представителей всех русских субполуляций.
Для молекулярно-генетического анализа были использованы препараты ДНК, полученные из 3 мл венозной крови. ДНК выделяли при помощи AxyPrep Blood Genomic DNA Midiprep kit ("Axygen Biosciences", США). Полиморфные аллели гена PDE4D были исследованы методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (технология TaqMan). ПЦР проводили на амплификаторе Мх3000р фирмы "Stratagene". Смесь для амплификации объемом 25 мкл содержала 2,5 мкл 10-кратного ПЦР буфера ("Синтол", Россия); 2,5 мкл 25 мМ MgCl 2, 2,5 мкл 2,5 мМ раствора dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 10 пМ каждого праймера; 4 пМ каждого зонда; 1,25 ед. HotTaq-полимеразы ("Синтол", Россия); 0,1-0,2 мкг геномной ДНК и деионизированной воды до 25 мкл. Процесс амплификации проводился при следующих температурных условиях: 3 мин деконтаминация при 50°C, 10 мин денатурация при 95°C, а затем 40 циклов в режиме: 95°C - 15 сек, 58°C (для SNP87) или 56°C (для SNP41) - 50 сек. Последовательности праймеров и зондов приведены в [Hsieh M.-S., Yu S.-C., Chung W.-T. et al. Phosphodiesterase 4D (PDE4D) gene variants and risk of ischemic stroke in the Taiwanese population // Lab. Medicine. 2009. V.40. № 2. P.87-90].
Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием программы GraphPad InStat (США) (http://www. graphpad. corn/), с помощью которой проверяли соответствие наблюдаемого распределения частот генотипов формуле Харди-Вайнберга и величину относительного риска (ОР). Достоверность различий частот аллелей и генотипов полиморфных локусов в сравниваемых группах определяли с помощью критерия 2. Сравнение частот генотипов проводили с использованием таблиц сопряжения 2×3, а частот аллелей и объединенных генотипов - с использованием таблиц сопряжения 2×2. Достоверным считали уровень значимости p<0,05.
Результаты генотипирования полиморфизмов SNP87 (С Т) и SNP41 (G A) представлены в табл.1. Распределение частот генотипов и аллелей в контрольной группе по обоим ОНП соответствует закону Харди-Вайнберга ( 2=0,73, 0,00; p=0,69, 1,00 соответственно).
Из табл.1 видно, что нет статистически достоверных различий между распределением частот генотипов и аллелей по полиморфизму SNP87 между исследуемыми группами. Частоты генотипа СС в группе больных острым инсультом и в контрольной выборке составляют 19,9% и 18,9% соответственно, генотипа СТ - 53,6% и 53,3% соответственно, генотипа ТТ - 26,5% и 28,1% соответственно. Так, частота минорного аллеля С составляет 46,7% и 45,4% в группе больных острым инсультом и контрольной выборке соответственно.
Частоты генотипа GG по полиморфизму SNP41 составляют 77,8% и 85,2% в группе больных с острым инсультом и контрольной выборке соответственно (p=0,04), т.е. в контрольной выборке частота генотипа GG на 7,4% выше, чем в группе больных с острым инсультом. В выборке больных с острым инсультом в 2,3 раза повышена частота генотипа АА. Частота аллеля G также выше в контрольной группе на 4,1% (p=0,014). В выборке больных с острым инсультом носители аллеля А (лица с генотипами GA и АА) встречаются с частотой 22,2%, тогда как в контрольной группе с частотой 14,8% (p=0,02).
Основываясь на полученных данных, можно утверждать, что аллель А SNP41 и генотипы, его содержащие, ассоциированы с повышенным риском развития острого инсульта в московской субпопуляции. Относительный риск развития инсульта у лиц с генотипами АА и GA повышен в 1,6 раза (OR=1,639; 95% ДИ от 1,1 до 2,4). Таким образом, полиморфизм SNP41 в гене PDE4D, обусловленный заменой G A, ассоциирован с риском развития острого инсульта в русской популяции.
SNP41 расположен в некодирующей области гена PDE4D, фланкирующей экзон D7-1. Возможно, что не сам SNP41 вносит вклад в увеличение риска развития инсульта, а находится в неравновесии по сцеплению с аллелем риска, и значения неравновесия по сцеплению этих локусов могут различаться между популяциями.
Таким образом, представленные примеры достоверно демонстрируют возможность использования молекулярно-генетической диагностики по полиморфному варианту SNP41 гена PDE4D в качестве молекулярно-генетического маркера индивидуальной предрасположенности к инсульту в русской популяции с целью выявления группы риска и соответственно возможности использовать указанный ген в способе прогнозирования предрасположенности к инсульту.
Таблица 1. | |||||
Сравнительный анализ генотипов и аллелей гена PDE4D гена PDE4D по полиморфизмам SNP87 и SNP41 у больных с острым инсультом и в контрольной выборке | |||||
Генотип, аллель | Острый инсульт | Контроль | P | ||
N | Частота % | N | Частота % | ||
SNP87 | |||||
С/С | 115 | 19,9 | 51 | 18,9 | 0,84* |
С/Т | 309 | 53,6 | 143 | 53,3 | 0,84* |
T/T | 153 | 26,5 | 76 | 28,1 | 0,84* |
C/Т+Т/Т | 462 | 80,1 | 219 | 81,4 | 0,79** |
С | 539 | 46,7 | 245 | 45,4 | 0,86*** |
Т | 615 | 53,3 | 295 | 54,6 | 0,86*** |
SNP41 | |||||
G/G | 449 | 77,8 | 230 | 85,2 | 0,04* |
G/A | 119 | 20,6 | 38 | 14,1 | 0,04* |
А/А | 9 | 1,6 | 2 | 0,7 | 0,04* |
G/A+А/А | 128 | 22,2 | 40 | 14,8 | 0,02** |
G | 1017 | 88,1 | 498 | 92,2 | 0,014*** |
А | 137 | 11,9 | 42 | 7,8 | 0,014*** |
- рассчитывали с использованием программы GraphPad InStat для таблиц сопряжения 2×3 **, *** - рассчитывали с использованием программы GraphPad InStat для таблиц сопряжения |
Класс C12N15/00 Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев