средство для деструкции нефтяных углеводородов в среде, содержащей nacl до 24,0%

Формула изобретения

Средство для деструкции нефтяных углеводородов в среде, содержащей до 24,0% NaCl, представляющее собой штамм Bacillus firmus SDS-1, ВКПМ В-9278,обладающий биоэмульгирующими свойствами.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к экологической биотехнологии и микробиологии. Средство представляет собой штамм бактерий Bacillus firmus SDS-1 (депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика, коллекционный номер ВКПМ В-9278), который способен окислять нефтяные углеводороды в среде, содержащей NaCl до 24,0%, и обладает эмульгирующими свойствами. Может быть использован для очистки объектов окружающей среды и загрязненных поверхностей от нефти и нефтепродуктов.

Известен штамм Mycobacterium species ЦКМ В 65-Б [патент РФ № 2129603, 1999], используемый для очистки морской (7,5% солености) и пресной воды от нефти и нефтепродуктов в широком диапазоне температур (10-26°С).

Недостатками использования данного штамма являются низкая степень очистки от нефти пресной (48% в течение 14 суток в стационарных условиях и в течение 7 суток при аэрации на качалке) и морской (44,6% в течение 14 суток в стационарных условиях и 56% в течение 7 суток при аэрации на качалке) воды. Кроме этого, увеличение концентрации морской соли до 7,5% снижает степень очистки от нефти и максимальный уровень биоочистки (56%) достигается при концентрации морской соли 3,5%.

Известен штамм Arthrobacter sp. ОС-1 для разложения нефти и нефтепродуктов, выделенный из образца загрязненных нефтью вод, полученных с месторождения Ван-Еган. Штамм депонирован в ВКПМ института "ВНИИГенетики" под номером Ас-1556 [патент РФ № 2128221, 1999].

Недостатками применения данного штамма является низкая скорость очистки (степень биодеградации по сырой нефти под воздействием штамма составляет 98-99% в течение 30 дней) и то, что убыль нефтепродуктов определяется визуально.

Наиболее близким к предлагаемому средству является способ биологической очистки воды от нефтяных загрязнений [патент РФ № 2303003, 2005], включающий введение в очищаемый объем воды культуры бактерий Pseudomonas putida.

Недостатками данного способа является культивирование бактерий в загрязненной воде при принудительном аэрировании с использованием перфторметилдекалина в качестве биостимулятора.

Технической задачей данного изобретения является получение средства для деструкции нефтяных углеводородов в среде, содержащей NaCl до 24,0%, представляющее собой штамм Bacillus firmus SDS-1 ВКПМ В-9278.

Технический результат - повышение скорости деградации нефтяных углеводородов. Это достигается тем, что для решения поставленной задачи предлагается штамм бактерий Bacillus firmus SDS-1 (Сопрунова О.Б. и др. Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. Эколого-физиологические особенности бактериальных штаммов, изолированных из нефтезагрязненных экосистеме Нижнего Поволжья, № 5, 2008, с.64-68), полученный из тяжей цианобактерий, выделенных из природных вод Северного Каспия методом накопительной культуры (Методы физиолого-биохимического исследования водорослей в гидробиологической практике / Отв. ред. А.В.Топачевский. - Киев: Наукова думка. - 1975. - 247 с.) и культивируемых в лабораторных условиях в присутствии нефти и нефтепродуктов. Штамм выделен при высеве суспензии предварительно гомогенизированных тяжей цианобактерий на питательные среды (МПА и агар Чапека с добавлением 27% NaCl) и в последующем в чистую культуру методом последовательных пересевов по общепринятой методике (Практикум по микробиологии / Под ред. Н.С.Егорова. Учебное пособие. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1976. - 306 с.).

Филогенетическое положение штамма проведено на основании секвенирования гена 16S рРНК в Центре "Биоинженерия" РАН и ИНМИ РАН.

Штамм Bacillus firmus SDS-1 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов 07.11.2005, коллекционный номер ВКПМ В-9278. Справка о депонировании штамма прилагается.

Штамм Bacillus firmus SDS-1 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки

Аэробные грамположительные спорообразующие палочки. Клетки - прямые или слегка изогнутые длиной 3-5 мкм и толщиной 1-1,5 мкм со слегка-заостренными концами. Располагаются одиночно, иногда в цепочках по 2 и более. Споры чечевицеобразные, длиной 1,5-2 мкм, толщиной около 1 мкм, расположены в центре клетки. Активное спорообразование наблюдается на средах с малым количеством органических веществ (Федорова или Эшби). На богатых органикой средах (МПА) спорообразование слабое или отсутствует; наблюдается увеличение размеров клеток до 4-5 мкм в длину, клетки часто образуют цепочки. При росте на МПА образуются выпуклые пастообразные светло-бежевые колонии, с четким слегка фестончатым краем и глянцевой поверхностью.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм оксидазо-, каталозоположительный, использует глюкозу, фруктозу, трегалозу и сахарозу; не использует маннозу, мальтозу, лактозу, манит, ксилозу, арабинозу, галактозу. Нитроредуктаза и аргининдегилролаза отсутствуют; образует ацетилметилкарбинол, не образует индол.

Способен к росту на средах Чапека, Миллса, магниево-калиево-дрожжевой (МКД), Маккланга как с добавлением нефти и нефтепродуктов (солярки, моторного и машинного масел, мазута) в качестве источников углеводородов, так и без добавления. Особенностью штамма является галотолерантность (рост в интервале солености 0,0-24,0% NaCl).

Штамм растет на средах для образования цистоподобных рефракторных форм (ЦРФ), для стационарных форм, по дефициту азота и фосфора (N-0,2 г/л и Р-0,2 г/л; N-0,2 г/л и Р-1,0 г/л; N-1,0 г/л и Р-0,2 г/л), органических (МПА, МПА с добавлением 4,0% NaCl).

Для сохранения штамма используют метод периодических пересевов (3-4 раза в год) на МПА или агаре Чапека. Инкубирование после пересева ведут при температуре 28°С в течение 3-4 дней, затем культуру хранят в холодильнике при температуре 4°С.

Нефтеокисляющая активность штамма оценивалась по убыли суммарных нефтяных углеводородов методом ИК-фотометрии (РД 52.24.476-95. Методические указания. ИК-фотометрическое определение нефтепродуктов в воде. - Ростов-на-Дону, 1995. - 13 с.) и методом измерения массовой доли концентрации нефти после экстракции гексаном и измерения интенсивности флуоресценции экстракта на приборе типа «Флюорат-02» (Другов Ю.С., Родин А.А. Экологические анализы при разливах нефти и нефтепродуктов. - С-Пб, 2000. - 250 с.).

Эмульгирующую активность определяли по методике (Абрамзон А.А., Зайченко Л.П., Файнгольд С.И. Поверхностно-активные вещества. Синтез, анализ, свойства, применение: Учебное пособие для ВУЗов. - М.: Химия, 1988. - 200 с.). В качестве гидрофобной фазы для эмульгирования использовали керосин. Измерение индекса эмульгирования определяли через 24 часа, как величину отношения высоты эмульсионного слоя к общей высоте жидкости в пробирке, и выражали в процентах по формуле

I=h/Н×100, где

I - индекс эмульгирования;

h - объем эмульсионного слоя, мл;

Н - общий объем жидкости, мл.

Эффективность предлагаемого способа в биодеструкции нефти изучали в широком диапазоне солености, что подтверждается следующими примерами.

Пример 1. В колбы Эрленмейера (объемом 250 мл), содержащие 100 мл среды Миллса следующего состава (г/л): NaCl-24,0; MgSO₄·7H ₂O-1,0; КСl-0,7; К₂НРO₄-2,0; Na ₂HPO₄-3,0; NH₄NO₃-1.0, вносили сырую стерильную нефть (1,0% по объему) и 1,0 мл суспензии Bacillus firmus SDS-1 (1,0×16⁷ кл/мл), предварительно выращенных на МПА в течение 2-х суток при 28°С, дважды отмытых от агара дистиллированной водой, отделенных центрифугированием (8 тыс.об/мин) и ресуспендированных в стерильной морской воде. Контролем служили колбы со средой Миллса без добавления суспензии Вас.firmus SDS-1 и с добавлением сырой стерильной нефти (1,0% по объему). Колбы инкубировали на перемешивающем устройстве (45 кол/мин) при комнатной температуре в течение 14 суток.

Через 1, 3, 7, 14 суток в колбах определяли титр клеток и содержание суммарных нефтяных углеводородов (ИК-фотометрия). В ходе экспозиции Вас.firmus SDS-1 показал способность к активизации процесса деструкции нефти. Убыль нефтяных углеводородов в течение 14 суток составила 69,0%. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Убыль нефтяных углеводородов в ходе эксперимента, %
Вариант опыта	Продолжительность эксперимента, сутки
1	3	7	14
Среда Миллса с добавлением 1,0% нефти	0.5	4,6	10,4	24,6
Среда Миллса с добавлением 1,0% нефти и суспензии Bacillus firmus SDS-1	8,1	25.3	62,5	69,0
Титр клеток, кл/мл	1,0×107	2,0×10 7	1,0×10 7	l,0×l0 7

Пример 2. В колбы Эрленмейера (объемом 250 мл), содержащие 100 мл среды Миллса следующего состава (г/л): NaCl-24,0; MgSO₄·7H ₂O-1,0; КСl-0,7; К₂НРO₄-2,0; Na ₂HPO₄-3,0; NН₄NO₃-1,0, вносили сырую стерильную нефть (2,0% по объему) и 1,0 мл суспензии Bacillus firmus SDS-1 (1,0×1,6⁷ кл/мл), предварительно выращенных на МПА в течение 2-х суток при 28°С, дважды отмытых от агара дистиллированной водой, отделенных центрифугированием (8 тыс.об/мин) и ресуспендированных в стерильной морской воде. Контролем служили колбы со средой Миллса без добавления суспензии Вас.firmus SDS-1 и с добавлением сырой стерильной нефти (2,0% по объему). Колбы инкубировали на перемешивающем устройстве (45 кол/мин) при комнатной температуре в течение 14 суток.

Через 1, 3, 7, 14 суток в колбах определяли титр клеток и содержание суммарных нефтяных углеводородов (ИК-фотометрия). В ходе экспозиции Вас.firmus SDS-1 показал способность к активизации процесса деструкции нефти. Убыль нефтяных углеводородов в течение 14 суток составила 62,2%. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Убыль нефтяных углеводородов в ходе эксперимента, %
Вариант опыта	Продолжительность эксперимента, сутки
1	3	7	14
Среда Миллса с добавлением 2,0% нефти	7,9	15.4	22,0	28,4
Среда Миллса с добавлением 2,0% нефти и суспензии Bacillus firmus SDS-1	45,6	46,7	60,9	62,2
Титр клеток, кл/мл	1,0×107	2,0×10 7	1,0×10 8	1,0×10 7

Пример 3. Для проверки штамма на способность к трансформации нефти осуществляли количественный анализ методом измерения массовой доли нефтепродуктов на анализаторе жидкости «Флюорат-02». Культивирование микроорганизмов проводили в пенициллиновых флаконах, содержащих по 10,0 мл жидкой среды для эндоспорообразования (г/л): (NH ₄)₂HPO₄-1,0; KCl-0,2; MgSO₄ ·7H₂O-0,2; СаСl₂-0,2; FеСl₃ -0,001; MnSO₄-0,0017; МПБ-200 мл; глюкоза-20,0 с внесением 2,0% (по объему) сырой стерильной нефти. В качестве инокулята использовали культуры, выращенные на среде МПА с нефтью. Начальная концентрация исследуемого деструктора в опытных пенициллиновых флаконах составляла 10⁷ кл/мл. Инкубирование осуществляли на качалке при 24 об/мин и температуре 25°С в течение 10 суток. Количественное определение нефти и титр клеток проводили на 3-и, 5-е, 7-е и 10-е сутки. В качестве контроля использовались пенициллиновые флаконы без внесения культуры микроорганизмов.

Убыль нефтяных углеводородов в течение 10 суток составила 82,5%. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3. Убыль нефтяных углеводородов в ходе эксперимента, %
Вариант опыта	Продолжительность эксперимента, сутки
3	5	7	10
Среда для эндоспорообразования с добавлением 2,0% нефти	35,8	40,2	43,7	47,6
Среда для эндоспорообразования с добавлением 2,0% нефти и суспензии Bacillus firmus SDS-1	39,7	58,4	64,3	82,5
Титр клеток, кл/мл	1,0×10 7	1,1×l0 7	1,6×10 6	1,4×10 7

Пример 4. Для определения эмульгирующей активности бактерии выращивали в течение 5 суток на чашках с МПА. Полученную биомассу суспендировали в физиологическом растворе и засевали в колбы Эрленмейера (объемом 250 мл) с 50 мл стерильной среды 5 следующего состава (г/л): К₂НРO₄-7,0; КH₂PO₄ -3.0; CaCl₂ (1,0%, мл)-1,0; MgSO₄·7H ₂O-0,1; (NH₄)₂SO₄-1,0; FeSO₄·7H₂O-0,5; ZnSO₄·7H ₂O-0,5; MnSO₄·3H₂O-0,5; H ₂SO₄ (0,1 н, мл) - 10,0 с добавлением 0,6 мл глицерина. Бактериальные клетки осаждали центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин, далее к культуральной жидкости добавляли объем керосина, равный объему супернатанта, и перемешивали на перемешивающем устройстве в течение 20 мин. Полученную эмульсию оставляли на 24 часа при комнатной температуре. Эмульгирующая активность Bacillus firmus SDS-1 составила 46,0%.

Таким образом, применение штамма Bacillus firmus SDS-1 приводит к биодеградации нефтяных углеводородов (62,2-82,5%) в относительно короткие сроки (10-14 суток). Кроме того, штамм обладает способностью к биоэмульгации, что значительно повышает эффективность патентуемого способа для очистки объектов окружающей среды от нефтяного загрязнения. Следует отметить, что патентуемый способ в отличие от аналога не предусматривает использование принудительной аэрации и биостимулятора, а также является эффективным в диапазоне солености (0,0-24,0%).

Представленные экспериментальные данные показывают способность штамма Bacillus firmus SDS-1 продуцировать эмульгирующий агент и использовать нефтяные углеводороды в качестве источника питания и энергии, что позволяет рекомендовать средство для деструкции нефтяных углеводородов в среде, содержащей NaCl до 24,0%, представляющее собой штамм Bacillus firmus SDS-1 ВКПМ В-9278 для очистки объектов окружающей среды и загрязненных поверхностей от нефти и нефтепродуктов.

Источники информации

1. Патент РФ № 2129603 «Штамм Mycobacterium species ЦКМ В 65-Б, используемый для очистки пресной и морской воды от нефти и нефтепродуктов, C12N 1/14, C02F 3/34, C12N 1/14, C12R 1:3, 1999.

2. Патент РФ № 2128221 «Штамм Arthrobacter sp. для разложения нефти и нефтепродуктов», C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, C12R 1:06, 1999.

3. Патент РФ № 2303003 «Способ биологической очистки воды от нефтяных загрязнений», C02F 3/34, C12N 1/20, C12R 1/40, 2005 (прототип).

4. Сопрунова О.Б., Клюянова М.А. Эколого-физиологические особенности бактериальных штаммов, изолированных из нефтезагрязненных экосистеме Нижнего Поволжья // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. - № 5, 2008. - с.64-68.

6. Практикум по микробиологии / Под ред. Н.С.Егорова. Учебное пособие. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1976. - 306 с.

7. РД 52.24.476-95. Методические указания. ИК-фотометрическое определение нефтепродуктов в воде. - Ростов-на-Дону. 1995. - 13 с.

8. Другов Ю.С., Родин А.А. Экологические анализы при разливах нефти и нефтепродуктов. - С-Пб, 2000. - 250 с.

9. Абрамзон А.А., Зайченко Л.П., Файнгольд С.И. Поверхностно-активные вещества. Синтез, анализ, свойства, применение: Учебное пособие для ВУЗов. - М.: Химия, 1988. - 200 с.