способ определения стрептомицина с помощью пьезокварцевого иммуносенсора

Формула изобретения

Способ определения стрептомицина иммунохимическим методом, отличающийся тем, что на поверхность пьезокварцевого иммуносенсора иммобилизуют рецепторное покрытие на основе стрептомицин-белкового (бычий сывороточный альбумин) конъюгата, к пробе добавляют фиксированное количество антител к стрептомицину и выдерживают в течение 2-3 мин до образования иммунокомплекса, вводят в ячейку в фосфатном буферном растворе с рН 7,1-7,5 и регистрируют изменение частоты колебания сенсора при взаимодействии стрептомицин-белкового коньюгата с антителами к стрептомицину, аналитический сигнал обратно пропорционален концентрации стрептомицина в анализируемой пробе, концентрацию определяют по градуировочному графику, регенерацию рецепторного покрытия осуществляют нанесением на поверхность 0,03 мM раствора тиоцианата калия.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть рекомендовано для селективного определения стрептомицина в пищевых продуктах.

В настоящее время для определения стрептомицина применяют методы: микробиологические [Haasnoot W. Immunochemical detection of aminoglycosides in milk and kidney/ W.Haasnoot, P.Stouten, G.Cazemier, A.Lommen, Jacques F.M. Nouws, Henk J. Keukens // State Institute for Quality Control of Agricultural Products (RIKILT-DLO), Borrsesteeg 45. - 1999; Jin Y.], недостатком таких методов является невысокая чувствительность (предел обнаружения равен 0,01 мг/л); хроматографические [Bruijnsvoort M. Determination of streptomycin and dihydrostreptomycin in milk and honey by liquid chromatography with tandem mass spectrometry/ M. Bruijnsvoort, S.J.M. Ottink, K.M. Jonker, E.Boer // J.Chromatogr. - 2004. - V.1-2. - P.137-142; Kaufmamn A. Determination of 11 Aminoglycosides in Meat and liver by liquid chromatography with tandem mass spectrometry / A. Kaufmamn, K. Maden // Journal of AOAC International. - 2005 - V.88. - P.1118-1125], имеющие достаточно сложную процедуру пробоподготовки, требующую для повышения селективности применять сложные способы разделения пробы. Наиболее близким по технике выполнения является метод поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (ПФИА) [Kathryn S. Schwenzer Automated Fluorescence Polarisation Immunoassay for Monitoring Streptomycin / Kathryn S. Schwenzer, John P. Anhalt // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 1983. - V.23, № 5. - P.683-687], метод экспрессен, селективен, однако чувствительность данного метода невысока, предел обнаружения 2,41 мг/л.

Задачей настоящего изобретения являются снижение предела обнаружения стрептомицина и увеличение чувствительности определения, автоматизация анализа, проведение измерений в замкнутом цикле, включающем регенерацию сенсора.

Поставленная задача решается тем, что анализируемую пробу предварительно подготавливают, а затем проводят конкурентный анализ при проточно-инжекционном определении.

Для определения следовых концентраций стрептомицина на поверхности электродов сенсора иммобилизовали конъюгат бычьего сывороточного альбумина со стрептомицином, а в пробу, содержащую аналит, вводили заранее установленное количество антител, соответствующее 50%-ному связыванию. Аналитический сигнал сенсора обратно пропорционален содержанию стрептомицина в анализируемой пробе. После каждого цикла измерения осуществляют регенерацию рецепторного покрытия, нанося на поверхность 0,03 мМ раствор тиоцианата калия.

Отличительными признаками предложенного способа являются:

- высокая чувствительность способа, позволяющая осуществлять определение стрептомицина в пищевых продуктах в интервале концентраций 1,0-50,0 нг/мл, при этом предел обнаружения равен 0,6 нг/мл;

- высокая селективность определения стрептомицина в сложных по составу смесях, в том числе в присутствии родственных соединений (ПР% <6,00%);

- многократное (более 20 раз) использование иммуносенсора вследствие регенерации биорецепторного покрытия после каждого цикла измерения;

- относительно невысокая продолжительность анализа (15-20 мин).

Это позволяет проводить определение стрептомицина в диапазоне концентраций 1,0-50,0 нг/мл в пищевых продуктах. Высокая селективность обеспечивается использованием специфичных иммунореагентов - поликлональных антител к стрептомицину. Многократное (более 20 раз) использование иммуносенсора после регенерации биорецепторного покрытия обеспечивает снижение затрат на осуществление анализа.

Способ осуществляется следующим образом.

Для создания иммуносенсора используется пьезокварцевый масс-чувствительный резонатор АТ-среза с золотыми электродами диаметром 5-8 мм и собственной частотой колебаний (5-10 МГц)±1 Гц. После тщательной очистки и обезжиривания поверхность серебряного электрода пьезокварцевого резонатора обрабатывают 0,6 мкл 2,5%-ного раствора -аминопропилтриэтоксисилана в ацетоне, высушивают на воздухе и выдерживают 30-40 минут при 90°С. После нанесения 15 мкл 2,5% свежеприготовленного раствора глутарового альдегида и 10 мкл 0,05% раствора стрептомицин-белкового конъюгата происходит прочное закрепление биослоя. Сенсор выдерживают 10-12 часов при 4°С во влажной камере

Перед началом первого измерения пьезокварцевый иммуносенсор выдерживают в фосфатном буферном растворе (рН 7,2) в течение 30 мин до стабилизации сигнала сенсора. В пробу для определения антибиотика вводили фиксированное количество антител (100 мл) и выдерживали в течение 2-3 минут до завершения образования гомогенного иммунного комплекса определяемого соединения с соответствующими антителами. Затем пробу вводили в поток раствора-носителя и после попадания ее в ячейку детектирования измеряли аналитический сигнал сенсора в результате взаимодействия несвязавшихся антител со стрептомицин-белковым конъюгатом на поверхности электродов сенсора.

После измерения аналитического сигнала сенсора осуществляли разрушение образовавшегося иммунокомплекса и регенерацию биослоя. Частота колебаний сенсора при этом возвращается к исходному значению. После предварительной пробоподготовки, описанной выше, определяли концентрацию стрептомицина в пробе по предварительно построенному градуировочному графику.

Для построения градуировочного графика к 50 мкл анализируемого раствора с концентрацией стрептомицина 0,05, 0,1, 5,0, 10,0, 30,0, 50,0, 70,0 нг/мл прибавляют раствор антител, соответствующий 50%-ному связыванию, смесь доводят фосфатным буферным раствором до 1 мл и выдерживают до завершения реакции.

Значение аналитического сигнала обратно пропорционально содержанию аналита в пробе.

Градуировочный график для определения стрептомицина линеен в диапазоне концентраций 1,0-50,0 нг/мл: f=-1,2 с+ 112,0, где f - аналитический сигнал; с - концентрация стрептомицина в пробе.

Пример 1. Раствор стрептомицина с концентрацией 0,05 нг/мл объемом 200 мкл вводили в ячейку в фосфатном буферном растворе (рН 7,1-7,5) и регистрировали изменение аналитического сигнала в результате образования комплекса. Предварительно к раствору добавляли фиксированное количество антител к стрептомицину и выдерживали в течение 3 минут до образования иммунокомплекса. Аналитический отклик сенсора обратно пропорционален содержанию стрептомицина в растворе.

Регенерацию биочувствительного покрытия пьезокварцевого сенсора осуществляли нанесением на поверхность раствора KCNS 0,03 мМ. Определение концентрации стрептомицина осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Аналитический сигнал f=111,8 Гц; чувствительность определения 11184,0 Гц/нг, предел обнаружения стрептомицина - 0,5 нг/мл.

Пример 2. Раствор стрептомицина с концентрацией 0,1 нг/мл объемом 200 мкл вводили в ячейку в фосфатном буферном растворе (рН 7,1-7,5) и регистрировали изменение аналитического сигнала в результате образования комплекса. Предварительно к раствору добавляли фиксированное количество антител к стрептомицину и выдерживали в течение 3 минут до образования иммунокомплекса. Аналитический отклик сенсора обратно пропорционален содержанию стрептомицина в растворе.

Регенерацию биочувствительного покрытия пьезокварцевого сенсора осуществляли нанесением на поверхность раствора KCNS 0,03 мМ. Определение концентрации стрептомицина осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Аналитический сигнал f=111,7 Гц; чувствительность определения 5585,0 Гц/нг, предел обнаружения стрептомицина - 0,5 нг/мл.

Пример 3. Раствор стрептомицина с концентрацией стрептомицина 5,0 нг/мл объемом 200 мкл вводили в ячейку в фосфатном буферном растворе (рН 7,1-7,5) и регистрировали изменение аналитического сигнала в результате образования комплекса. Предварительно к раствору добавляли фиксированное количество антител к стрептомицину и выдерживали в течение 3 минут до образования иммунокомплекса. Аналитический отклик сенсора обратно пропорционален содержанию стрептомицина в растворе.

Регенерацию биочувствительного покрытия пьезокварцевого сенсора осуществляли нанесением на поверхность раствора KCNS 0,03 мМ. Определение концентрации стрептомицина осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Аналитический сигнал f=106,0 Гц; чувствительность определения 106,0 Гц/нг, предел обнаружения стрептомицина - 0,6 нг/мл.

Пример 4. Раствор стрептомицина с концентрацией 10,0 нг/мл объемом 200 мкл вводили в ячейку в фосфатном буферном растворе (рН 7,1-7,5) и регистрировали изменение аналитического сигнала в результате образования комплекса. Предварительно к раствору добавляли фиксированное количество антител к стрептомицину и выдерживали в течение 3 минут до образования иммунокомплекса. Аналитический отклик сенсора обратно пропорционален содержанию стрептомицина в растворе.

Регенерацию биочувствительного покрытия пьезокварцевого сенсора осуществляли нанесением на поверхность раствора KCNS 0,03 мМ. Определение концентрации стрептомицина осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Аналитический сигнал f=100,0 Гц; чувствительность определения 50,0 Гц/нг, предел обнаружения стрептомицина - 0,6 нг/мл.

Пример 5. Раствор стрептомицина с концентрацией 30,0 нг/мл объемом 200 мкл вводили в ячейку в фосфатном буферном растворе (рН 7,1-7,5) и регистрировали изменение аналитического сигнала в результате образования комплекса. Предварительно к раствору добавляли фиксированное количество антител к стрептомицину и выдерживали в течение 3 минут до образования иммунокомплекса. Аналитический отклик сенсора обратно пропорционален содержанию стрептомицина в растворе.

Регенерацию биочувствительного покрытия пьезокварцевого сенсора осуществляли нанесением на поверхность раствора KCNS 0,03 мМ. Определение концентрации стрептомицина осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Аналитический сигнал f=76,0 Гц; чувствительность определения 12,7 Гц/нг, предел обнаружения стрептомицина - 0,6 нг/мл.

Пример 6. Раствор стрептомицина с концентрацией 50,0 нг/мл объемом 200 мкл вводили в ячейку в фосфатном буферном растворе (рН 7,1-7,5) и регистрировали изменение аналитического сигнала в результате образования комплекса. Предварительно к раствору добавляли фиксированное количество антител к стрептомицину и выдерживали в течение 3 минут до образования иммунокомплекса. Аналитический отклик сенсора обратно пропорционален содержанию стрептомицина в растворе.

Регенерацию биочувствительного покрытия пьезокварцевого сенсора осуществляли нанесением на поверхность раствора KCNS 0,03 мМ. Определение концентрации стрептомицина осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Аналитический сигнал f=52,0 Гц; чувствительность определения 10,4 Гц/нг, предел обнаружения стрептомицина - 0,6 нг/мл.

Пример 7. Раствор стрептомицина с концентрацией 70,0 нг/мл объемом 200 мкл вводили в ячейку в фосфатном буферном растворе (рН 7,1-7,5) и регистрировали изменение аналитического сигнала в результате образования комплекса. Предварительно к раствору добавляли фиксированное количество антител к стрептомицину и выдерживали в течение 3 минут до образования иммунокомплекса. Аналитический отклик сенсора обратно пропорционален содержанию стрептомицина в растворе.

Регенерацию биочувствительного покрытия пьезокварцевого сенсора осуществляли нанесением на поверхность раствора KCNS 0,03 мМ. Определение концентрации стрептомицина осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Аналитический сигнал f=30,0 Гц; чувствительность определения 4,3 Гц/нг, предел обнаружения стрептомицина - 0,7 нг/мл.

Пример 8. Раствор стрептомицина, содержащий стрептомицин и структурный аналог - гентамицин в соотношении концентраций 1:1, объемом 200 мкл вводили в ячейку в фосфатном буферном растворе (рН 7,1-7,5) и регистрировали изменение аналитического сигнала в результате образования комплекса. Далее аналогично примеру 1.

Введено стрептомицина:	Найдено стрептомицина:
10,0 нг/мл	10,00±0,02

f=100,1 Гц; чувствительность определения 100 Гц/нг. Присутствие структурного аналога (гентамицина) не оказывает влияния на определение стрептомицина.

Пример 9. Раствор стрептомицина, содержащий стрептомицин и структурный аналог - тетрациклин в соотношении концентраций 1:1, объемом 200 мкл вводили в ячейку в фосфатном буферном растворе (рН 7,1-7,5) и регистрировали изменение аналитического сигнала в результате образования комплекса. Далее аналогично примеру 1.

Введено стрептомицина:	Найдено стрептомицина:
10,0 нг/мл	10,00±0,03

f=100,5 Гц; чувствительность определения 101 Гц/нг. Присутствие структурного аналога (тетрациклина) не оказывает влияния на определение стрептомицина.

Пример 10. Раствор стрептомицина, содержащий стрептомицин и структурный аналог - бацитрацин в соотношении концентраций 1:1, объемом 200 мкл вводили в ячейку в фосфатном буферном растворе (рН 7,1 -7,5) и регистрировали изменение аналитического сигнала в результате образования комплекса. Далее аналогично примеру 1.

Введено стрептомицина:	Найдено стрептомицина:
10,0 нг/мл	10,00±0,04

f=100,7 Гц; чувствительность определения 101 Гц/нг. Присутствие структурного аналога (бацитрацина) не оказывает влияния на определение стрептомицина.

Пример 11. Раствор стрептомицина, содержащий стрептомицин и структурный аналог - гентамицин в соотношении концентраций 1:4, объемом 200 мкл вводили в ячейку в фосфатном буферном растворе (рН 7,1-7,5) и регистрировали изменение аналитического сигнала в результате образования комплекса. Далее аналогично примеру 1.

Введено стрептомицина:	Найдено стрептомицина:
10,0 нг/мл	10,00±0,05

f=100,0 Гц; чувствительность определения 100 Гц/нг. Присутствие структурного аналога (гентамицина) не оказывает влияния на определение стрептомицина.

Пример 12. Раствор стрептомицина, содержащий стрептомицин и структурный аналог - тетрациклин в соотношении концентраций 1:4, объемом 200 мкл вводили в ячейку в фосфатном буферном растворе (рН 7,1-7,5) и регистрировали изменение аналитического сигнала в результате образования комплекса. Далее аналогично примеру 1.

Введено стрептомицина:	Найдено стрептомицина:
10,0 нг/мл	10,00±0,04

f=100 Гц; чувствительность определения 100 Гц/нг. Присутствие структурного аналога (тетрациклина) не оказывает влияния на определение стрептомицина.

Пример 13. Раствор стрептомицина, содержащий стрептомицин и структурный аналог - бацитрацин в соотношении концентраций 1:4, объемом 200 мкл вводили в ячейку в фосфатном буферном растворе (рН 7,1-7,5) и регистрировали изменение аналитического сигнала в результате образования комплекса. Далее аналогично примеру 1.

Введено стрептомицина:	Найдено стрептомицина:
10,0 нг/мл	10,00±0,06

f=99,9 Гц; чувствительность определения 100 Гц/нг. Присутствие структурного аналога (бацитрацина) не оказывает влияния на определение стрептомицина.

Данный способ позволяет существенно увеличить чувствительность определения стрептомицина в пищевых продуктах, а также обеспечивает многократное использование иммуносенсора после регенерации биорецепторного покрытия, что снижает затраты на осуществление анализа. Предел обнаружения стрептомицина равен 0,6 нг/мл.

Сравнительная характеристика известного и предлагаемого способа определения стрептомицина приведена в таблице.

Таблица
Сравнительная характеристика известного и предлагаемого способа детектирования стрептомицина в жидких средах
Показатели	Известный способ (поляризационный флуоресцентный иммуноанализ)	Предлагаемый способ
Диапазон определяемых содержаний стрептомицина	300,0-5000,0 нг/мл	1,0-50,0 нг/мл
Предел обнаружения стрептомицина	116,0 нг/мл	0,6 нг/мл
Применение дополнительных меток стрептомицин	Не требуется	Не требуется
Объем анализируемой пробы	1000 мкл	200 мкл
Вид анализа стрептомицин	Дискретный/прямой	Дискретный/прямой
Регенерация иммунореагентов	Отсутствует	После каждого цикла измерения
Продолжительность измерения аналитического сигнала, мин стрептомицин	7-10 мин	15-20 мин
Кратность использования иммунореагентов	1	20
Определение в меде (ПДК-20 нг/мл)	невозможно	возможно