противоопухолевое средство

Формула изобретения

Применение в качестве противоопухолевого средства антимикробного белка тромбоцитов человека.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для лечения опухолевых заболеваний.

В настоящее время известно множество способов лечения опухолей. Известны хирургические способы лечения больных новообразованиями. Радикальным считается оперативное вмешательство, которое предполагает удаление опухоли вместе со здоровыми тканями, регионарными лимфоузлами и при необходимости с частью соседних органов (Чиссов В.И., Дарьялова С.Л. Онкология. - М.: Гэотар-Медиа. - 2007). Однако частота развития рецидивов и метастазов, особенно при местно-распространенных формах рака, не позволяет достичь в ряде случаев полного излечения из-за нераспознанных субклинических метастазов и невозможности проведения адекватной резекции органа из-за большого распространения опухоли. Кроме того, в лечении опухолей используется радио- и химиотерапия. Однако современные достижения радиотерапии и химиотерапии как самостоятельных методов лечения приводят к излечению ограниченного числа нозологических форм злокачественных образований, преимущественно на ранних стадиях.

Успехи химиотерапии в последние годы связаны с открытием различных маркеров, позволяющих определить чувствительность опухоли к химиопрепаратам. Тем не менее, существенного улучшения результатов лечения злокачественных заболеваний при использовании химиотерапии добиться не удалось, что связано с недостаточной противоопухолевой активностью современных цитостатиков (Корман Д.Б. Основы противоопухолевой химиотерапии. - М: Практическая медицина, 2006).

В этой связи актуальным является поиск новых препаратов, обладающих высокой противоопухолевой активностью.

Новым перспективным классом противоопухолевых средств являются катионные антимикробные пептиды - дефенсины (Droin N., Hendra J.B., Ducoroy P., Solary E. Human defensins as cancer biomarkers and antitumor molecules. - J. Proteomics. - 2009. - V.72. - P.918-927).

Известна выраженная антимикробная активность катионных антимикробных пептидов лейкоцитарной природы (Ganz Т. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity. - Nature Rev. Immunol. - 2003. - V.3. - P.710-720). Показано противоопухолевое действие дефенсинов (Hoskin D.W., Ramamoorthy A. Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides. - Biochim. Biophys. Acta. - 2008. - V.1778. - P.357-375).

Заявляемое средство решает задачу расширения арсенала противоопухолевых средств.

В качестве противоопухолевого средства предлагается применение антимикробного белка тромбоцитов человека. Антимикробный белок тромбоцитов человека представляет собой низкомолекулярный белок, характеризующийся высоким спектром антибактериальной активности (Бухарин О.В., Черешнев В.А., Сулейманов К.Г. Антимикробный белок тромбоцитов. - Екатеринбург, 2000).

Авторами экспериментально установлена противоопухолевая активность антимикробного белка тромбоцитов человека. Антимикробный белок тромбоцитов человека получали известным способом (Ivanov I.B., Gritsenko V.A. Comparative activities of cattle and swine platelet microbicidal proteins. - Probiotics and Antimicrobial Proteins. - 2009. DOI 10.1007/s12602-009-9016-9).

Испытания in vivo были проведены на перевиваемой модели опухоли молочных желез самок мышей линии BLRB-RB (8.17) 1 Iem, поддерживаемой на сингенных самцах. Данная линия характеризуется высокой частотой возникновения спонтанного рака молочных желез (РМЖ) с возможным участием экзогенного MMTV-ретровируса, обнаруженного у них в лейкоцитарной фракции. Мыши были предоставлены отделением биомоделей лаборатории Биотехнологии Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН г.Москва.

Для эксперимента из 20 самцов мышей данной линии методом пар-аналогов были сформированы 2 группы (n=10) - контрольная и опытная. Перевивка опухолей самцам и последующее наблюдение за динамикой роста опухолевых узлов проводились с учетом рекомендаций (Moiseeva E.V., Vodovozova E.L., Mikchlyov I.I., Molotkovsky J.G. Testing of liposomal formulations of DL-melphalan and rubomycin lipid derivatives on new breast cancer mouse model. Mouse Genome. - 1997. - V.9(4). - P.895-897). Для сингенной перевивки самцам использована опухоль весом 2 г стандартной локализации, возникшая у девственной самки BLRB RB (8.17) 1 Iem. Была получена взвесь опухолевых клеток в 20 мл среды 199. После стандартного разведения 1:2 взвесь была введена подкожно в область холки опытным и контрольным мышам по 0,5 мл каждой, что соответствовало дозе 13,3 млн опухолевых клеток на мышь. Через 24 часа после перевития опухоли мышам опытных групп начинали введение антимикробного белка тромбоцитов человека в объеме 1 мл подкожно в область перевивки, при этом разведение препарата фосфатным буфером в опытной группе составило 0,146 мкг/мл (1/10 от МБК₅₀). Одновременно животным контрольной группы делали инъекции 1 мл фосфатного буфера. Инъекции антимикробного белка тромбоцитов человека в опытной группе проводили в течение 21 дня 1 раз в день. Обследование животных на выявление новообразований проводили еженедельно. Индивидуальный рост визуально определяемой опухоли выражался с помощью динамики роста среднего диаметра опухоли (СДО), вычисляемого по формуле (a+b+h)/3; где a - это максимальная длина, b - максимальная ширина, a h - средняя высота (Moiseeva Е. Original approaches to test anti-breast cancer drugs in a novel set of mouse models. Pathobiology, Utrecht University, The Netherlands. 191 pp, http://igitur-archive.library.uu.nl/dissertations/2005-1130-200033/index.htm, 2005).

По окончанию эксперимента для гистологического исследования брали ткани опухоли, селезенки, печени и почек. Материал фиксировался в 10% растворе забуферного формалина. Приготавливались серийные гистологические срезы, которые окрашивались гематоксилином и эозином. Коллагеновые волокна красились по ван-Гизон, эластические - по Вейгерту. Кислые гликозаминогликаны выявлялись альциановым синим, нейтральные - с помощью PAS-реакции.

На светооптическом уровне в гистологических препаратах опухолей на стандартной площади окулярной сетки подсчитывались площадь сосудистого русла вокруг опухолевого узелка; общий клеточный инфильтрат; число митотически делящихся клеток (митотический индекс). Достоверность различий между группами рассчитывали по t-критерию Стьюдента.

Результаты исследований представлены в таблице
Показатель	Контрольная группа	Опытная группа
Средний размер опухоли, мм	28,3±2,3	19,9±0,8*
Митотический индекс, %	31±8	16±5**
Уменьшение площади сосудистого русла, %	0	29,7**
Уменьшение клеточного инфильтрата, %	0	64,9**
* - p<0,05 ** - p<0,001

Как видно из таблицы, в результате курса лечения экспериментальной опухоли с применением антимикробного белка тромбоцитов человека наблюдаются достоверное уменьшение размера опухоли, снижение митотической активности опухолевых клеток, уменьшение площади сосудистого русла вокруг опухоли и уменьшение клеточного инфильтрата, что позволяет использовать антимикробный белок тромбоцитов человека в качестве нового противоопухолевого средства.