набор реагентов для определения активности панкреатической -амилазы

Формула изобретения

Набор реагентов для определения активности панкреатической -амилазы, патент № 2417373" SRC="/images/patents/43/2417051/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -амилазы, включающий реагент 1, содержащий хлорид натрия, калий роданистый, азид натрия, водорастворимую соль кальция, моноклональные антитела к слюнной -амилазы, патент № 2417373" SRC="/images/patents/43/2417051/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -амилазе (MAT), 2-морфолиноэтансульфоновую кислоту (MES) и воду и реагент 2, содержащий 2-хлор-4-нитрофенил-4-O- -амилазы, патент № 2417373" SRC="/images/patents/43/2417033/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактопиранозилмальтозит (GalG₂CNP), MES и воду, отличающийся тем, что реагент 1 дополнительно содержит EDTA и бычий сывороточный альбумин (БСА), а в качестве соли кальция - ацетат кальция, а реагент 2 дополнительно содержит EDTA и азид натрия, при следующем соотношении компонентов:

реагент 1	-амилазы, патент № 2417373" SRC="/images/patents/43/2417043/8202.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle">
Хлорид натрия, ммоль/л	50,0-500,0
KSCN, ммоль/л	50,0-400,0
Азид натрия, ммоль/л	1,0-90,0
EDTA, ммоль/л	0,2-5,0
Ацетат кальция, ммоль/л	0,7-10,0
БСА, мас.%	0,5-2,0
МАТ, мг/л	12,0-25,0
MES, ммоль/л	50,0
Вода, л	Остальное до 1 л;
реагент 2	-амилазы, патент № 2417373" SRC="/images/patents/43/2417043/8202.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle">
Азид натрия, ммоль/л	1,0-90,0
EDTA, ммоль/л	0,2-5,0
GalG2CNP, ммоль/л	2,5-20,0
MES, ммоль/л	50,0
Вода, л	Остальное до 1 л,

при этом значение рН реагента 1 и реагента 2 составляет 5,5-6,5.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и биохимии, а именно к созданию реагентов, позволяющих определять активность панкреатической -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -амилазы в сыворотке, плазме крови и моче.

Наиболее распространенным для определения активности панкреатической -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -амилазы является метод, одобренный Международной федерацией клинической химии (IFCC), с использованием в качестве субстрата 4,6-ethylidene-(G₇)-p-nitrophenil-(G₁)- -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,D-maltoheptaoside (4,6-этилден-(G₇)-п-нитрофенил-(G ₁)- -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,D-мальтогептазид; Et-G₇PNP). Первой стадией реакции является селективное ингибирование активности слюнного изофермента -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -амилазы с помощью моноклональных антител (MAT) к слюнной -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -амилазе. Оставшаяся активной панкреатическая -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -амилаза расщепляет Et-G₇PNP до G₂ PNP, G₃PNP, G₄PNP, Et-G₃, Et-G ₄ и Et-G₅. После этого -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюкозидаза гидролизует G₂PNP, G₃ PNP и G₄PNP с образованием глюкозы и окрашенного вещества п-нитрофенола. Скорость накопления окрашенного продукта прямо пропорциональна активности панкреатической -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -амилазы в образце (Kruse-Jarres J.D., Kaiser С., Hafkenscheid J.С.М. et al. Evaluation of a new -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -amylase assay using 4,6-ethylidene-(G₇)-1-4-nitrophenil-(G ₁)- -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-maltoheptaoside as substrate // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1988. Vol.27. P.103-113).

Основным недостатком метода является использование дополнительного фермента для получения окрашенного продукта.

Наиболее близким к заявленному набору реагентов - прототипом, является набор реагентов для определения активности панкреатической -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -амилазы кинетическим колориметрическим методом, состоящий из двух реагентов, имеющих следующий состав компонентов: реагент 1 - хлорид натрия 50-500 ммоль/л, калий роданистый (KSCN) 50-400 ммоль/л, азид натрия 1-90 ммоль/л, хлорид кальция 0,5-10,0 ммоль/л, MAT 5-100 мг/л, MES (2-морфолиноэтансульфоновая кислота) 50 ммоль/л, рН 5-8, вода - остальное; реагент 2 - 2-chloro-4-nitrophenyl-4-O- -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-galactopyranosylmaltoside (2-хлор-4-нитрофенил-4-O- -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-галактопиранозилмальтозит; GalG₂CNP) 2,4-12 ммоль/л, MES 50 ммоль/л, рН 5-8, вода - остальное (Morishita Y., IinumaY., Nakashima N., et al. Total and pancreatic amylase measured with 2-chloro-4-nitrophenyl-4-O- -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-galactopyranosylmaltoside // Clinical Chemistry. 2000. Vol 46. P.928-933).

В основу набора для определения панкреатической -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -амилазы положен кинетический колориметрический метод, заключающийся в том, что на первой стадии слюнной изофермент -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -амилазы ингибируется с помощью MAT, на второй стадии - панкреатическая -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -амилаза гидролизует GalG₂CNP с образованием окрашенного продукта 2-chloro-4-nitrophenol и неокрашенного - 4-O- -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-galactopyranosylmaltose. Скорость накопления окрашенного продукта прямо пропорциональна активности панкреатической -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -амилазы в образце.

Недостатком прототипа является небольшой срок хранения реагентов - 3 месяца при температуре 4°С.

Технической задачей изобретения является повышение стабильности набора реагентов для определения панкреатической -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -амилазы в сыворотке, плазме крови и моче и продление срока его хранения при сохранении высокой точности и воспроизводимости результатов анализа.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым набором реагентов, включающим два жидких реагента, готовых к использованию, при этом первый реагент (реагент 1) дополнительно содержит EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) и бычий сывороточный альбумин (БСА), а хлорид кальция заменен на ацетат кальция; второй реагент (реагент 2) дополнительно содержит EDTA и азид натрия.

Предлагаемый набор реагентов включает следующие компоненты:

реагент 1, содержащий хлорид натрия 50-500 ммоль/л, KSCN 50-400 ммоль/л, азид натрия 1-90 ммоль/л, EDTA 0,2-5,0 ммоль/л, ацетат кальция 0,7-10,0 ммоль/л, БСА 0,5-2 мас.%, MAT 12,0-25,0 мг/л, MES 50 ммоль/л, рН 5,5-6,5, вода - остальное; реагент 2, содержащий азид натрия 1-90 ммоль/л, EDTA 0,2-5,0 ммоль/л, GalG₂CNP 2,5-20 ммоль/л, MES 50 ммоль/л, рН 5,5-6,5, вода - остальное.

Данный набор реагентов характеризуется правильностью определения активности панкреатической -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -амилазы 100±5% с воспроизводимостью результатов (коэффициент вариации) менее 5%. Срок хранения набора реагентов при температуре 2-8°С составляет 1 год.

Включение в состав реагента 1 новых компонентов - EDTA, образующей комплексные соединения с большинством катионов, БСА - способствующего стабильности антител, а также замена хлорида кальция на консервант ацетат кальция, позволяет повысить стабильность реагента 1 и продлить срок его годности до 1 года.

Включение в состав реагента 2 нового компонента - EDTA, образующей комплексные соединения с большинством катионов, а также добавление консерванта - азида натрия позволяет повысить стабильность реагента 2 и продлить срок его годности до 1 года.

Определение активности панкреатической -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -амилазы осуществляется при температуре реагентов 37°С следующим образом: к 25 мкл пробы добавляют 1 мл реагента 1, выдерживают 5 минут и добавляют 0,25 мл реагента 2, через 1 мин начинают считывать оптическую плотность через равные промежутки времени в течение 1-3 мин при длине волны 405 нм, при этом количество считываний должно быть не менее трех. Активность панкреатической -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -амилазы (А) в Е/л рассчитывают по формуле:

А= -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> Е/мин×2757,

Где -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> Е/мин - среднее изменение оптической плотности за минуту;

2757 - фактор пересчета по уравнению Бугера-Ламберта-Бера.

Определяющими существенными отличиями предлагаемого набора реагентов для определения активности панкреатической -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, по сравнению с прототипом, являются:

- реагент 1 дополнительно содержит EDTA и БСА, что позволяет повысить стабильность набора реагентов при хранении;

- в реагенте 1 хлорид кальция заменен на ацетат кальция, что позволяет повысить стабильность набора реагентов при хранении;

- реагент 2 дополнительно содержит EDTA, что позволяет повысить стабильность набора реагентов при хранении;

все компоненты в наборе использованы в оптимальных, экспериментально подобранных концентрациях, что позволяет повысить функциональность и расширить область применения набора.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1

Готовят реагент 1 и реагент 2.

Для приготовления реагента 1 делают навески на аналитических весах каждого компонента. Переносят их в стеклянный стакан и растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Раствор тщательно перемешивают на магнитной мешалке и доводят рН под контролем рН-метра до 6,0. Затем раствор переносят в мерную колбу вместимостью 1 литр, доводят объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Для приготовления реагента 2 делают навески на аналитических весах каждого компонента. Переносят все навески, кроме GalG₂CNP, в стеклянный стакан и растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Раствор тщательно перемешивают на магнитной мешалке, доводят рН под контролем рН-метра до 6,0. Далее раствор переносят в мерную колбу вместимостью 1 литр, доводят объем до метки дистиллированной водой, перемешивают, добавляют навеску GalG₂CNP и вновь тщательно перемешивают на магнитной мешалке.

В результате получают набор реагентов для определения панкреатической -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, который включает:

реагент 1, содержащий:

Хлорид натрия, ммоль/л - 50,0

KSCN, ммоль/л - 400,0

Азид натрия, ммоль/л - 90,0

EDTA, ммоль/л - 0,2

Ацетат кальция, ммоль/л - 0,7

БСА, мас.% - 2,0

MAT, мг/л-12,0

MES, ммоль/л - 50,0

Вода - остальное;

реагент 2, содержащий:

Азид натрия, ммоль/л - 90,0

EDTA, ммоль/л - 0,2

GalG ₂CNP, ммоль/л - 2,5

MES, ммоль/л - 50,0

Вода - остальное.

При этом значение рН реагента 1 и реагента 2 составляет 5,9

Пример 2

Приготовление реагента 1 и реагента 2 осуществляют аналогично примеру 1. Получают набор реагентов для определения панкреатической -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, который включает:

реагент 1, содержащий:

Хлорид натрия, ммоль/л - 200,0

KSCN, ммоль/л - 150,0

Азид натрия, ммоль/л - 20,0

EDTA, ммоль/л - 2,5

Ацетат кальция, ммоль/л - 5,0

БСА, мас.% - 1,0

MAT, мг/л - 25,0

MES, ммоль/л - 50,0

Вода - остальное;

реагент 2, содержащий:

Азид натрия, ммоль/л - 20,0

EDTA, ммоль/л - 2,5

GalG ₂CNP, ммоль/л - 20,0

MES, ммоль/л - 50,0

Вода - остальное.

При этом значение рН реагента 1 и реагента 2 составляет 5,5.

Пример 3

Приготовление реагента 1 и реагента 2 осуществляют аналогично примеру 1. Получают набор реагентов для определения панкреатической -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, который включает:

реагент 1, содержащий:

Хлорид натрия, ммоль/л - 500,0

KSCN, ммоль/л - 50,0

Азид натрия, ммоль/л - 1,0

EDTA, ммоль/л - 5,0

Ацетат кальция, ммоль/л - 10,0

БСА, мас.% - 0,5

MAT, мг/л - 20,0

MES, ммоль/л - 50,0

Вода - остальное;

реагент 2, содержащий:

Азид натрия, ммоль/л - 1,0

EDTA, ммоль/л - 5,0

GalG ₂CNP, ммоль/л - 10,0

MES, ммоль/л - 50,0

Вода - остальное.

При этом значение рН реагента 1 и реагента 2 составляет 6,5.

Пример 4 Определение активности панкреатической -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -амилазы в контрольных сыворотках.

К 1 мл реагента 1, прогретому до температуры 37°С, добавили 25 мкл контрольной сыворотки «Precinorm U», выдержали 5 минут при температуре 37°С и добавили 0,25 мл реагента 2. Через 1 мин начали считывать оптическую плотность через равные промежутки времени в течение 1-3 мин при длине волны 405 нм. Аналогичную процедуру повторили для контрольных сывороток «Precipath U», «c.f.a.s.», «Contornorm», «Contropath», «BioCal E». Результаты анализа приведены в таблице.

Таблица
Контрольная сыворотка	Аттестованное значение активности панкреатической -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -амилазы (IFCC), Е/л	Полученный результат, Е/л
«Precinorm U» («Roche», Германия)	40,8 (33,6-48,0)	40
«Precipath U» («Roche», Германия)	102(84-120)	102
«c.f.a.s.» («Roche», Германия)	162	164
«Contornorm» («Biocon», Германия)	40,1 (32,9-47,3)	41
«Contropath» («Biocon», Германия)	102 (84-120)	101
«BioCal E» («Biocon», Германия)	171	177

Из таблицы 1 видно, что предлагаемый реагент обеспечивает высокую точность определения активности панкреатической -амилазы, патент № 2417373" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -амилазы в сыворотке, плазме крови и моче.

Использование предлагаемого набора реагентов позволит, по сравнению с прототипом:

- увеличить срок годности набора до 1 года путем обеспечения стабильности реагентов;

- расширить область применения и повысить функциональность набора за счет обеспечения возможности работы с ним в условиях клинико-диагностических, поликлинических и биохимических лабораторий.

Предлагаемый набор реагентов доступен для любой клинико-диагностической, поликлинической и биохимической лаборатории и позволяет получать точные, достоверные результаты анализа, соответствующие зарубежным стандартам.