способ количественного определения ципрофлоксацина в лекарственных препаратах

Формула изобретения

Способ определения ципрофлоксацина в лекарственных препаратах методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в изократическом режиме с флуориметрическим детектором, заключающийся в приготовлении двух проб одинакового объема разбавленного испытуемого раствора, в одну из которых вводят стандартную добавку ципрофлоксацина, отличающийся тем, что к каждому раствору добавляют реагент - -циклодекстрин, анализируют на хроматографе, используя в качестве подвижной фазы смесь анетонитрил: ацетатно-аммиачный буфер (43:57 об./об., рН 4.3), измеряют площадь хроматографических пиков и на основе сравнения измеренных параметров по расчетной формуле определяют концентрации антибиотика.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуориметрическим детектором с использованием организованных сред, позволяющих более чем в 8 раз понизить предел обнаружения ципрофлоксацина в лекарственных препаратах и может быть использовано в анализе многокомпонентных лекарственных препаратов в практике контрольно-аналитических лабораторий фармацевтических предприятий и аптечной сети.

Ципрофлоксацин относится к группе фторхинолонов производных 4-хинолон-3-карбоновой кислоты и широко используется в клинической практике. Известны различные методы определения ципрофлоксацина и других антибиотиков группы фторхинолонов: микробиологические, например, диффузии в агар, спектрофотометрические, хроматографические, например высокоэффективная жидкостная хроматография.

Фармакопейный метод [Фирсов А.А., Алексеева M.Е., Кулешов С.У. // Хим.-фарм. журн. 1995. № 3. С.24] определения основан на микробиологическом тесте, включающем диффузию антибиотика в агар (питательную среду) и сравнение угнетения роста тест-микроорганизма определенными концентрациями испытуемого препарата со стандартами антибиотика. Минимальная определяемая концентрация составляет 0.05 мкг/мл. Микробиологические способы широко распространены, просты и не требуют дорогостоящего оборудования. Кроме того, они обеспечивают удовлетворительную чувствительность и точность при терапевтических концентрациях фторхинолонов в исследуемых средах.

Однако они характеризуются длительностью анализа, зависимостью аналитического сигнала от свойств антибиотика (его растворимости, молярной массы и т.п.), не связанных с его активностью, чувствительностью тест-культур к качеству агара, используемого в способе.

Спектрофотометрический метод определения основан на образовании комплексов с ионами Сu²⁺ или Fe³⁺ [Kapetanovic V., Milovanovic I., Erceg M. / / Talanta. 1996. V.43. Р.2123.; Mathur S.C., Kumar Y., Murugesan N. // Indian Drugs. 1992. V.29. P.376], а также ионных ассоциатов с органическими реагентами ряда сульфофталеина [Tosunoglu S., Savci N. // Acta Pharm. Turc. 1993. V.35. P.1; Anal. Abstr. 1994. V.56. 3 G 49]. Этот метод определяет от 3 до 25 мг/мл ципрофлоксацина, невысокая чувствительность и низкая избирательность являются недостатком указанного метода, а в экстракционном варианте - необходимо использование токсичных органических растворителей.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению относится метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для определения ципрофлоксацина в коровьем молоке [Tyczkowska K.L., Voyksner R.D., Anderson K.L. //J.Chromatogr. B. 1994. V.658. P.341] с помощью фотодиодного детектора.

К недостаткам метода можно отнести продолжительность определения (время разделения 15-20 мин), а также использование в качестве подвижной фазы высокотоксичного метанола.

Задачей изобретения является понижение предела обнаружения и расширение спектра исследуемых объектов - смеси антибиотиков группы фторхинолонов, хинолонов и тетрациклинов, например, в лекарственных формах, а также функциональных возможностей способа за счет использования организованных сред циклодекстринов, позволяющих модифицировать подвижную фазу и повысить интенсивность аналитического сигнала антибиотика при образовании комплекса включения состава антибиотик: -циклодекстрин 1:1.

Технический результат заключается в повышении чувствительности обнаружения при уменьшении времени, необходимого для анализа, и снижении токсичности.

Поставленная задача решается тем, что в способе количественного определения ципрофлоксацина в лекарственных препаратах, заключающемся в приготовлении двух одинакового объема проб разбавленного испытуемого раствора, добавляют реагент - -циклодекстрин и в одну из проб вводят стандартную добавку ципрофлоксацина, последовательно анализируют на жидкостном хроматографе с флуоресцентным детектором и обращено-фазовой хроматографической колонкой в изократическом режиме, используя в качестве подвижной фазы смесь ацетонитрил: ацетатно-аммиачный буфер (43:57 об./об., рН 4.3). Время удерживания ципрофлоксацина 2 мин. Расчет концентрации производят но формуле

C_x=C_ст ·S₁/S₂-S₁,

где С_ст - стандартная добавка ципрофлоксацина мг/мл;

S₁ - площадь пика ципрофлоксацина в исследуемом растворе;

S₂ - площадь пика ципрофлоксацина в исследуемом растворе со стандартной добавкой;

С_x - искомая концентрация ципрофлоксацина в лекарственном препарате мг/мл.

Добавление указанного peaгента вызывает образование комплекса включения состава антибиотик: -циклодексирин 1:1. Это понижает предел обнаружения искомого вещества.

Исходный раствор ципрофлоксацина 0,25 мг/мл готовили растворением 0,0125 г его порошка, с содержанием основного вещества не менее 98% в 50 мл дистиллированной воды. Раствор -циклодексирина концентрации 1·10^-2 М приготовлен растворением в 25 мл дистиллированной воды 0.0324 г сухого вещества, содержащего не менее 98% основное компонента. Реакцию проводят в среде ацетатно-аммиачного буферного раствора в слабокислой среде с рH 4-5. Для построения градировочною графика в каждую из восьми пробирок вносили 1 мл ацетатно-аммиачного буферного раствора. 0.25 мл 5·10^-5 М -циклодексирина, затем различные объемы исходного раствора ципрофлоксацина в диапазоне концентраций от 0.10-100 мкг/мл, разбавляли буферным раствором до общего объема 5 мл и из каждой пробирки отбирали аликвоту 50 мкл, которую вводили в хроматограф. В качестве подвижной фазы используют смесь ацетонитрил:ацетатно-аммиачный буфер (43:57 об./об., рН 4,3), время удерживания ципрофлоксацина 2 мин. Градуировочный график строили в координатах площадь пика - концентрация ципрофлоксацина. В таблице 1 представлены некоторые метрологические характеристики определения ципрофлоксацина.

Таблица 1 Метрологические характеристики определения ципрофлоксацина в отсутствии и присутствии -циклодекстрина
Определяемый компонент	Реагент	Диапазон определяемых концентраций, мкг/мл	ПрО, мкг/мл	Уравнение градуировочного графика	r2
Ципрофлоксацин	-	2,5-100	1,7	y=17,6x+80,6	0,998
	-циклодекстрин	0,25-75	0,2	y=28,5x+64,5	0,997
Ципрофлоксацин на фоне антибиотиков	-	2,5-100	1,4	y=15,4x+220	0,996
	-циклодекстрин	0,25-75	0,2	y=26,6x+64.5	0,997

Как видно из таблицы, предел обнаружения ципрофлоксацина в присутствии -циклодекстрина понижается более чем в 8 раз.

Время удерживания составляет 2 мин, что сокращает время анализа. Кроме этого вместо токсичного растворителя метанола используется менее токсичный ацетонитрил.

Определение ЦФ в лекарственных препаратах. Разработанная методика апробирована на дозированных лекарственных препаратах, содержащих ципрофлоксацин - глазных каплях различного производства: «Ципролет» фирмы Dr.Reddy's laboratories (Индия), «Ципрофлоксацин» АКОС Синтез (г.Курган), «Ципромед» Promed Exports (Индия). Кроме определяемого ципрофлоксацина, лекарственный препарат содержит вспомогательные вещества: этилендиаминтетрауксусную кислоту, маннитол, ацетат натрия, уксусную кислоту.

Методика определения.

Исследуемый раствор глазных капель разбавляют в 25 раз. Из полученного раствора отбирают в пробирку аликвоту 0.2 мл, добавляют 0.25 мл 5·10^-3 М -циклодекстрин и разбавляют до общего объема 5 мл ацетатно-аммиачным буферным раствором рН 4.3. Аликвоту полученного раствора 50 мкл вводят в хроматограф, измеряют площадь хроматографического пика ципрофлоксацина и по градуировочному графику определяют содержание ципрофлоксацина в лекарственных препаратах.

Возможен второй вариант реализации. Исследуемый раствор глазных капель разбавляют в 25 раз. Из полученного раствора отбирают в две пробирки одинаковые аликвоты 0.2 мл, добавляют в каждую 0.25 мл 5·10 ^-3 М -циклодекстрина и в одну из них стандартную добавку ципрофлоксацина (20-30 мкг/мл), растворы разбавляют до общего объема 5 мл ацетатно-аммиачным буферным раствором рН 4. Аликвоты полученных растворов 50 мкл последовательно вводят в хроматограф, измеряют площади хроматографических пиков ципрофлоксацина для обеих проб и по расчетной формуле определяют содержание ципрофлоксацина в лекарственных препаратах

C_x=25·C_ст·S₁/S ₂-S₁,

где С_ст - стандартная добавка ципрофлоксацина мг/мл;

S₁ - площадь пика ципрофлоксацина в исследуемом растворе;

S₂ - площадь пика ципрофлоксацина в исследуемом растворе со стандартной добавкой;

C_x - искомая концентрация ципрофлоксацина в лекарственном препарате мг/мл.

Результаты определения представлены в таблице 2.

Таблица 2
Результаты определения ципрофлоксацина в лекарственных препаратах глазных капель* (n=5, Р 0,95)
Препарат	Найдено, мг/мл	Sr
«Ципролет», Индия	2.62±0.07	0.03
«Ципрофлоксацин», Курган	2.49±0.15	0.06
«Ципpoмeд», Индия	2.29±0.05	0.02

где S_r - относительное стандартное отклонение, S_r S/ , где S - стандартное отклонение, равное S= ( _i- )²/n-1) , _i - единичный результат определения, - средний результат, ^* - указанное производителем содержание ЦФ - 3 мг/мл.

Контроль правильности определения осуществляли методом стандартных добавок.

Погрешность определения не превышает 0.06.

Предлагаемый способ может быть использован для определения ципрофлоксацина в присутствии других антибиотиков - окситетрациклина, тетрациклина, налидиксовой кислоты и флюмеквина. Рeзультaты определения, время удерживания оказанных антибиотиков и характеристики их хроматографического разделения представлены в таблице 3.

Taблицa 3 Количественные хроматографические характеристики антибиотиков в присутствии -ЦД
Антибиотик	Время удерживания, мин	Площадь пика	R S		К'	N
ФТОРХИНОЛОНЫ
ЦФ	2,0	810,0	2,4	1,7	1,0	6,30·103
ФЛ	12,8	47,25	11,9	11,6	5,3	1,22·103
ТЕТРАЦИКЛИНЫ
ТТ	2,7	6,90	2,4	1,7	1,7	1,13·103
ОТТ	6,2	642,7	5,2	5,3	2,8	2,96·103
ХИНОЛОНЫ
НК	3,8	534,3	4,8	2,8	12	1,54·103

R_S - разрешение пиков, R_S=(t _R2-t_R1)/{(w₁+w₂)/2}, где t_R2, t_R1 - время удерживания двух соседних пиков, w₁, w₂ - ширина пиков, измеренная при основаниях;

- коэффициент селективности, =(t_R-t_m)₁/(t_R -t_m)₂, где t_R - время удерживания антибиотика, t_m - время пребывания антибиотика в подвижной фазе;

К' - фактор удерживания, (t_R -t_m)/t_m), где t_R - время удерживания антибиотка, t_m - время пребывания антибиотика в подвижной фазе;

N - число теоретических тарелок, N=16(t _R/W)², t_R - удерживания, W - ширина пика у основания.

В качестве подвижной фазы используют подвижную фазу - смесь ацетонитрил: ацетатно-аммиачный буфер в соотношениях 43:57 об./об., рН=4.3.

Правильность методики оценивали по результатам анализа модельных растворов, содержащих смесь антибиотиков, по методу «введено-найдено». Для приготовления модельных растворов в каждую из десяти пробирок вносили 1 мл ацетатно-аммиачного буферного раствора с рН 4.3, затем последовательно добавляли 0.25 мл 10^-3 М -ЦД, 0.6-2.1 мл ЦФ с концентрацией от 0,10-100 мкг/мл, затем добавляли антибиотики в концентрации 50 мкг/мл и разбавляли буферным раствором до общего объема 5 мл. Из каждого раствора отбирали аликвоту 50 мкл и вводили ее в хроматограф. Характеристики хроматографического разделения антибиотиков представлены в таблице 3. Как видно из таблицы, предел обнаружения ципрофлоксацина на фоне других антибиотиков в присутствии -циклодекстрина понижается в 6.8 раз. Погрешность определения составляет не более 0.06.