биоинженерная конструкция для закрытия костных дефектов с восстановлением в них костной ткани и способ получения указанной конструкции

Формула изобретения

1. Биоинженерная конструкция для закрытия костных дефектов с восстановлением в них костной ткани, представляющая собой гибридный имплантат в виде пористой мембраны из политетрафторэтилена с многофункциональным биосовместимым нерезорбируемым покрытием (МБНП), легированным элементами M-Ca-P-C-O-N или M-Ca-C-O-N, где М - металл, выбранный из ряда Ti, Zr, Hf, Nb, Та, на поверхности которого пассированы аутогенные или аллогенные стромальные клетки, выделенные из жировой ткани или костного мозга.

2. Биоинженерная конструкция по п.1, отличающаяся тем, что имплантат имеет размер пор 200-500 мкм.

3. Биоинженерная конструкция по п.1, отличающаяся тем, что покрытие в качестве легирующего металла содержит преимущественно титан.

4. Способ получения биоинженерной конструкции по пп.1-3, заключающийся в том, что выделяют стромальные клетки из жировой ткани или костного мозга реципиента, в том числе предшественники костных клеток, с последующим культивированием из них клеточной популяции, которое включает последовательно: промывку ткани в солевом растворе с антибиотиками, измельчение ткани, инкубирование в растворе 0,1% коллагеназы при 37°С и постоянном перемешивании в течение 90 мин, ингибирование выделенного фермента добавлением 10%-ной фетальной телячьей сыворотки, отделение зрелых адипоцитов центрифугированием при 300 g в течение 10 мин, отмывку полученного клеточного осадка от фермента в среде DMEM (Sigma), содержащей 10% ФТС, фильтрование полученной суспензии клеток через нейлоновый фильтр и ее отделение центрифугированием при 400 g в течение 30 мин при комнатной температуре, тройную отмывку полученной фракции мононуклеарных клеток в виде суспензии в среде DMEM, при этом культуры клеток культивируют до первого пассирования в среде DMEM, содержащей 20% сыворотки, затем в среде DMEM, содержащей 10% ФТС, после чего культуры СКЖТ пассируют на поверхность МБНП гибридного имплантата, представляющего собой пористую мембрану из политетрафторэтилена с размерами пор 200-500 мкм, при этом МБНП легировано элементами M-Ca-P-C-O-N или M-Ca-C-O-N, где М - металл, выбранный из ряда Ti, Zr, Hf, Nb, Та, через 24 ч после пассирования поверхности МБНП среду культивирования меняют на остеогенную и проводят остеогенную стимуляцию с использованием следующего состава: среда DMEM, 10% ФТС, 0,01 мкМ 1,25-дигидроксивитамин D₃ (Sigma), 50 мкМ аскорбат-2-фосфат (Sigma), 10 мМ -глицерофосфат (Sigma), при смене среды каждые 3 суток, затем клетки культивируют в индукционной среде в течение 14 дней, после чего полученную биоинженерную конструкцию используют по назначению.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и медицинской технике, а именно к клеточным технологиям по разделу биоинженерных конструкций для применения в челюстно-лицевой, черепно-мозговой хирургии, стоматологии, травматологии, и может быть использовано для закрытия костных дефектов с восстановлением в них костной ткани, а также устранения и лечения костных дефектов различных отделов лицевого или мозгового черепа или иных костей и хрящей или их поврежденных частей.

Термин «биоинженерная конструкция» в медицине возник сравнительно недавно и распространен среди специалистов, практикующихся в области лечения дефектов костей с применением клеточной технологии (W. Zhang et al. Reconstructing Mandibular Defects with Autologous Bioengineered Tooth and Bone, по материалам журнала Science Daily. Apr. 5, 2008, портал «Вечная молодость» http://www.vechnayamolodost.ru/; У.В.Вольперт, О.О.Янушевич, А.С.Григорьян, Н.Н.Мальгинов, А.И.Воложин. Заживление костных дефектов ветви нижней челюсти кроликов под биоинженерными конструкциями из титана и золотого сплава с ксеногенными мезенхимальными стволовыми клетками // Стоматология, 2009, № 1, с.30).

Авторы монографии А.С.Григорьян и А.К.Топоркова «Проблемы интеграции имплантатов в костную ткань» // Техносфера, Москва, 2007, на с.8, так определяют термин биоинженерные конструкции: «биоинженерные конструкции (гибридные имплантаты) - это комплексы из «неживого» материала и «живой» материи, используемые для замещения утраченных органо-тканевых структур пациентов. При этом восполнение «отсутствующего» органо-тканевого образования осуществляется как за счет специфической структуры «неживой» подложки, так и за счет трансплантированной клеточной или тканевой составляющей биоинженерной конструкции».

Проблемы хирургического лечения костных дефектов в челюстно-лицевой, черепно-мозговой хирургии, стоматологии, особенно дефектов плоских костей черепа, в том числе костей свода черепа, являются одними из самых трудных в своем решении и остаются актуальными на современном этапе, поэтому применение клеточных технологий с использованием резорбируемой либо нерезорбируемой основы в восстановительной хирургии является актуальным и необходимым.

Известно устройство для краниопластики, используемое для лечения дефектов черепа после трепанации, содержащее пластину из самотвердеющей пластмассы с тремя фиксирующими элементами, выполненными в виде шплинтов из пористого никелида титана, при этом каждый шплинт имеет уплощенную головку с шипами и трапециевидный стержень с расходящимся концом, головки шплинтов помещены в тело пластины со стороны торцов, а стержни ориентированы в плоскости пластины ортогонально линии ее кромки (SU 1655477 А1, А61В 17/58, 15.06.1991).

Известно устройство для эндопротезирования дефектов костей черепа, состоящее из пластины для закрытия дефекта с отверстиями для прорастания костной тканью и под крепежные элементы, при этом пластина выполнена из оксидированного металла толщиной 0,15-0,35 мм с возможностью конгруэнтного покрытия дефекта костей черепа, по всей площади пластины в шахматном порядке расположены перфорационные отверстия диаметром 1,5-2,0 мм с расстоянием между центрами в ряду 4 мм, а между рядами - 3 мм, а фиксирующие элементы, выполненные в виде омегообразных скобок из металла с памятью формы, располагаются в упомянутых отверстиях по краю пластины (RU 2133113 C1, A61B 17/80, 20.07.1999).

Более усовершенствованное устройство для закрытия дефектов костей свода черепа предложено в патенте RU 2308909 C1, A61F 2/28, 27.10.2007. Устройство состоит из круглой или овальной пластины, выполненной из оксидированного титана с расположенными по всей площади пластины в шахматном порядке перфорационными отверстиями диаметром 1,5-2,0 мм с расстояниями между центрами в ряду 4 мм, а между рядами 3 мм для прорастания костной тканью и под крепежные элементы в виде омегообразных скобок из металла с памятью формы.

Однако все указанные известные устройства, трудоемкие в исполнении, не обеспечивают стабильной остеоинтеграции вследствие их коррозирования и по этой же причине постепенно теряют качество высокой биосовместимости с костной тканью, что со временем приводит к отторжению имплантата.

Известен имплантат для хирургического лечения заболеваний внутренних органов, который содержит клеточную суспензию, помещенную в иммуноизолированное вместилище, выполненное в виде сплошного объема сферической или уплощенной формы из пористого никелида титана с поперечным размером пор, не превышающим 0,5 мкм, через которые осуществляется обмен веществ клеточной суспензии, соответствующей заболевшему органу и не проникают иммунные клетки, поскольку их размеры превышают размеры пор (RU 2143867 С1, A61F 2/02, 10.01.2000). Известное изобретение направлено на лечение заболеваний внутренних органов и позволяет увеличить срок службы имплантата благодаря высокой биомеханической совместимости. Одним из недостатков имплантата является слабая поверхностная адгезия используемой клеточной культуры, с недостаточно устойчивой ее фиксацией на поверхности никелида титана, что может привести к постепенной обратной диффузии культуры по сквозным каналам ячеек за пределы пористого каркаса. В известном патенте нет сведений об использовании заявленной конструкции для восстановления костных дефектов.

Известен способ иммобилизации остеогенных стромальных стволовых клеток костного мозга на пористом каркасе, сущность которого заключается в следующем: культивацию остеогенных стромальных клеток костного мозга проводят после их выделения с высокой степенью очистки от сопутствующих форменных элементов из аспирата костного мозга без его предварительной механической и ферментативной обработки и применения микроносителей в монослойной культуре; поверхность пористого каркаса покрывают двойным протеиновым гидрофильным остеогенным слоем путем инкубации заготовки в растворе коллагена в уксусной кислоте и затем в среде DMEM, содержащей раствор желатиноля и -глицерофосфат; пористый каркас представляет собой биологически инертный металлический сплав никелида титана с проницаемой сквозной пористой структурой с размерами ячеек 300-400 мкм и соединяющих их каналов 25-35 мкм в диаметре; суспензию очищенных и выращенных в монослойных культурах остеогепных стромальных стволовых клеток наносят на пористый каркас перед использованием ex tempore посредством диффузионного осаждения на гидрофильную проницаемую поверхность (RU 2329055 С2, А61К 35/28; C12N 5/08; A61F 2/02, 20.07.2007). Использование известного способа позволяет создать трехмерную монокультуру остеогенных стромальных клеток костного мозга с заданными параметрами количества и плотности форменных элементов с пролонгированной пролиферативной активностью и тканевой дифференцировкой для моделирования тканевой структуры и репаративной функции губчатой кости.

Полученную заготовку из пористого никелида титана, пропитанную клеточной суспензией остеогенных стромальных клеток костного мозга, можно классифицировать как инженерную конструкцию, обладающую высокими остеогенными свойствами. Единственным недостатком такой конструкции являются лишь ограничения ее использования в области челюстно-лицевой и черепно-мозговой хирургии.

Недостатком для всех металлических имплантатов из титана, никелида титана или сплавов: титан-тантал-ниобий (RU 2302261 C1, A61L 27/04, A61K 6/04, 10.07.2007), сплава титан-кобальт (RU 2341293 C1, A61L 27/04, 27/06, 27/04, A61F 2/28) являются их низкие эстетические характеристики, так как указанные имплантаты выделяются темными пятнами под кожей на голове, требуют жесткой механической фиксации, обладают большим удельным весом и из-за высокой теплопроводности приводят к переохлаждению имплантированной области при минусовых температурах.

Указанный выше патент RU 2329055 С2 является наиболее близким аналогом в части объекта «способ».

Наиболее близким аналогом к заявляемой инженерной конструкции в части объекта «вещество» является имплантационный материал (абиологический гибридный имплантат), который включает основу (мембрану) из политетрафторэтилена (ПТФЭ) пористостью 3,0-40,0% и поверхностный слой покрытия толщиной не менее 50 нм, модифицированный легирующими элементами M-Ca-C-O-N, M-Ca-P-C-O-N, где M-Ti, Zr, Hf, Nb, Та (RU 2325191 C1, A61L 27/06; 27/14, 27/56, 27.05.2008).

В указанном патенте представлены характеристики гибридных имплантатов на основе ПТФЭ с покрытием и культуры клеток, выделенной из кожно-мышечных фибробластов эмбрионов человека. В опытах in vitro с использованием люминисцентной микроскопии и метода сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) было показано, что на поверхности нерезорбируемого полимерного материала политетрафторэтилена с покрытием при культивировании на них эмбриональных фибробластов происходят адгезия и распластывание указанных клеток.

Из текста описания указанного патента следует также, что имплантаты из ПТФЭ с покрытием обладают высоким остеоинтеграционным потенциалом, высокой биосовместимостью с живыми тканями и не токсичны, что позволяет определить эти покрытия как многофункциональные, биосовместимые, нерезорбируемые покрытия (МБНП).

Исходя из этих данных можно сделать вывод о перспективности использования в клинических условиях пористого ПТФЭ с МБНП в качестве абиологического носителя клеточной культуры в биоинженерных конструкциях (гибридных имплантатах) для хирургического лечения дефектов костей, в частности костей лицевого черепа и его свода.

Наиболее перспективные обеспечивающие успешность применения клеточных технологий при лечении костных дефектов являются следующие принципы:

- применение аутогенных стромальных (стволовых) клеток (источники - костный мозг, жировая ткань);

- применение коммитированных стромальных (стволовых) клеток;

- применение аутогенных стромальных (стволовых) клеток и предшественников костных клеток в составе биоинженерных конструкций.

Последнее направление признается наиболее теоретически обоснованным и перспективным для целей хирургического лечения костных дефектов.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка нового типа гибридных имплантатов «биоинженерных конструкций» для закрытия костных дефектов с восстановлением в них костной ткани и способа получения указанной конструкции.

Техническим результатом изобретения является обеспечение надежной степени закрепления культивированных стромальных клеток (клеточной популяции) на поверхности биоинженерной конструкции, при высокой степени адгезии и роста клеточной популяции на биосовместимом носителе.

Следует иметь в виду, что сам по себе ПТФЭ, являясь высоко биосовместимым нерезорбируемым пластическим материалом, обладающим высоким уровнем интеграции в тканевой среде, удобный и легкий, к тому же не подверженный коррозии, в отличие от металлических имплантатов, в то же время не может обеспечить адгезию клеток на его поверхности, что препятствует их культивированию на имплантатах из ПТФЭ. Эта проблема решается нанесением на поверхность ПТФЭ описанного выше покрытия.

Технический результат в части объекта «вещество» достигается тем, что биоинженерная конструкция для закрытия костных дефектов с восстановлением в них костной ткани представляет собой гибридный имплантат в виде пористой мембраны из политетрафторэтилена с многофункциональным, биосовместимым, нерезорбируемым покрытием МБНП, легированным элементами M-Ca-P-C-O-N или M-Ca-C-O-N, где M - металл, выбранный из ряда, включающего Ti, Zr, Hf, Nb, Та, на поверхности которого пассированы аутогенные или аллогенные стромальные клетки, выделенные из жировой ткани или костного мозга.

Основа имплантата имеет размер пор 200-500 мкм. Из металлов покрытие содержит преимущественно титан.

В части объекта «способ» технический результат достигается тем, что способ получения биоинженерной конструкции заключается в том, что выделяют стромальные клетки из жировой ткани СКЖТ или костного мозга реципиента, в том числе предшественники костных клеток, с последующим культивированием из них клеточной популяции, которое включает последовательно: промывку ткани в солевом растворе с антибиотиками, измельчение ткани, инкубирование в растворе 0,1% коллагеназы при 37°С и постоянном перемешивании в течение 90 мин, ингибирование выделенного фермента добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, отделение зрелых адипоцитов центрифугированием при 300 g в течение 10 мин, отмывку полученного клеточного осадка от фермента в среде DMEM (Sigma), содержащей 10% ФТС, фильтрование полученной суспензии клеток через нейлоновый фильтр и ее отделение центрифугированием при 400 g в течение 30 мин при комнатной температуре, тройную отмывку, полученной фракции мононуклеарных клеток в виде суспензии, в среде DMEM, при этом культуры клеток культивируют до первого пассирования в среде DMEM, содержащей 20% сыворотки, затем в среде DMEM, содержащей 10% ФТС, после чего культуры СКЖТ пассируют на поверхность многофункционального, биосовместимого, нерезорбируемого покрытия МБНП гибридного имплантата, представляющего собой пористую мембрану из политетрафторэтилена с размерами пор 200-500 мкм, при этом МБНП легировано элементами M-Ca-P-C-O-N или M-Ca-C-O-N, где М - металл, выбранный из ряда, включающего Ti, Zr, Hf, Nb, Та, через 24 часа после пассирования поверхности МБНП среду культивирования меняют на остеогенную и проводят остеогенную стимуляцию с использованием следующего состава: среда DMEM, 10% ФТС, 0,01 мкМ 1,25-дигидроксивитамин D₃ (Sigma), 50 мкМ аскорбат-2-фосфат (Sigma), 10 мМ -глицерофосфат (Sigma), при смене среды каждые 3 суток, затем клетки культивируют в индукционной среде в течение 14 дней, после чего полученную биоинженерную конструкцию используют по назначению.

В качестве металла покрытие содержит преимущественно титан.

В качестве критериев для оценки адекватности полученных в экспериментах in vitro образцов биоинженерной конструкции (гибридных имплантатов) в исследовании служат:

- интенсивность роста культуры клеток, высеянных из жировой ткани реципиента (для данного изобретения - кролика);

- гетерогенность клеточной культуры, включающей предшественники костных клеток;

- фенотипические характеристики клеток культуры (признаки преостеобластической дифференцировки).

Отработку способа получения биоинженерной конструкции и ее испытания проводили на пористых образцах (мембранах) гибридного имплантата на основе пористого ПТФЭ с МБНП, содержащего Ti-Ca-C-O-N (размер пор ПТФЭ составляет 200 мкм) либо Ti-Ca-P-C-O-N (размер пор ПТФЭ составляет 500 мкм), пассированных клеточной популяцией.

С целью определения эффективности адгезии и роста клеток культуры на поверхности биоинженерных конструкций обеих групп наблюдений оценивали результаты эксперимента in vitro с помощью люминисцентной микроскопии и СЭМ.

Для оценки остеогенной дифференцировки клетки на МБНП сажали в концентрации 2,5×10⁴ клеток/см ² в 6-луночные планшеты и культивировали до достижения конфлюэнтного слоя. Затем среду культивирования меняли на остеогенную. Дифференцировку клеток оценивали через 14 суток по гистологической окраске на активность щелочной фосфатазы (NBT/BCIP Stock solution (Roche Diagnostics), окраске на кальцификацию внеклеточного матрикса (Alizarin Red S (Sigma)) и иммуногистохимическому окрашиванию на экспрессию остеогенных белков.

Для определения экспрессии клетками культуры различных белков использовалось иммунногистохимическое окрашивание антителами: антиостеопонтин, антиостеокальцина, антиостеонектин (Chemicon).

Клетки промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) 3 раза, затем фиксировали в 4%-ном растворе параформальдегида (Fluka) в течение 15 мин. Далее клетки отмывали от фиксатора в течение 50 мин в 4-х сменах ФСБ (рН 7.4). Антитела разводили блокирующим раствором следующего состава: 5% бычьего сывороточного альбумина (Sigma), 0,1% Trition Х-100 (Sigma) на 1М растворе ФСБ в концентрациях, рекомендованных производителем антител. Препараты инкубировали с антителами в течение 12-16 часов при +4°С. Окрашивание вторыми антителами - Alexa-488 или Alexa-546 (Molecular Probe) проводили согласно инструкции производителя.

Результаты культивирования клеток, изученные с помощью люминисцентной микроскопии на биоинженерной конструкции с наноструктурированным МБНП, легированным элементами Ti-Ca-C-O-N или Ti-Ca-P-C-O-N через 14 суток после культивирования в остеогенной среде, показали, что поверхность имплантатов была покрыта биопленкой из фибропластоподобных клеток. На образце конструкции без покрытия клетки на поверхности имплантата отсутствуют.

На фиг.1 и 2 представлены электронограммы СЭМ биоинженерных конструкций на основе пористого ПТФЭ с МБНП, содержащим Ti-Ca-C-O-N (размер пор ПТФЭ составляет 200 мкм), фиг.1, и с МБНП, содержащим Ti-Ca-P-C-O-N (размер пор ПТФЭ составляет 500 мкм), фиг.2, пассированных клеточной популяцией.

Исследования с использованием СЭМ показали, что на поверхности биоинженерных конструкций располагаются многочисленные, многоотросчатые, распластавшиеся фибробластоподобные клетки, наделенные цитологическими характеристиками (фиг.1 и 2), на которых видно их плотное расселения на поверхности конструкции. На поверхности контрольных образцов без покрытия клетки отсутствовали.

Контрольные опыты с окраской клеток на щелочную фосфатазу показали, что СКЖТ кролика после 14 суток культивирования в остеогенной среде на МБНП биоинженерной конструкции образуют многослойные участки, где усиливается экспрессия щелочной фосфатазы - положительная окраска на активность щелочной фосфатазы.

Иммуногистохимический анализ экспрессии специфических белков остеогенеза выявил, что клетки находятся на начальных стадиях дифференцировки, поскольку обнаруживалась экспрессия остеопонтина и остеонектина. Экспрессия остеокальцина, позднего маркера остеогенной дифференцировки, отсутствовала.

При использовании в МБНП циркония и других металлов, указанных в формуле, были получены результаты близкие к титану.

Анализ полученных данных подтверждает технический результат предложенного изобретения. Совокупность признаков, характеризующая биоинженерную конструкцию, обусловливает положительный эффект культивирования стромальных клеток из жировой ткани на поверхности конструкции. Это заключение вытекает из сопоставления результатов культивирования клеток (биоинженерной конструкции с МБНП, легированного элементами Ti-Ca-C-O-N или Ti-Ca-P-C-O-N) и контрольной группах эксперимента: в основной группе обнаруживалось интенсивное заселение поверхности образцов клетками, в контрольной группе - оно отсутствовало. По условиям эксперимента высеянная на биоинженерной конструкции с МБНП культура клеток, подвергалась со вторых суток культивирования и по 14-е остеогенетическому коммитированию.

Для использования биоинженерной конструкции in vivo в опытах на животных были предварительно изучены фенотипические характеристики популяций клеток на МБНП поверхности конструкции с предшественниками костных клеток (коммитированные стромальные клетки).

Известно, что предшественники костных клеток и сами остеобласты наделены рядом специфических фенотипических характеристик (Полежаев Л.В. Замещение дефектов черепа регенерирующей костью // Вопр. Нейрохир., 1982, т.2, 53-56). Одной из них является экспрессия костного изофермента щелочной фосфатазы. Кроме того, в клетках-предшественниках остеогенной дифференцировки с помощью иммуногистохимических методов обнаруживаются остеопонтин, остеонектин и остеокальцин.

Согласно полученным данным в клетках на поверхности образцов были обнаружены признаки экспрессии как щелочной фосфатазы, так и остеопонтина и остеонектина, однако реакция на остеокальцин была отрицательной.

Таким образом, в экспериментах in vitro было показано, что биоинженерная конструкция из ПТФЭ с МБНП является адекватной основой для культивирования стромальных клеток из жировой ткани, а способ остеогенной стимуляции вызывает коммитирование этих клеток до стадии преостеобластов, в связи с чем можно говорить о достижении задачи предложенного изобретения, т.е. получен новый тип гибридного имплантата, названный как биоинженерная конструкция, отвечающий требованиям дальнейших биомедицинских испытаний в опытах in vivo на модели экспериментально воспроизведенных дефектов плоских костей, в частности свода черепа у животных.