клетка-хозяин, содержащая вектор для продуцирования белков, требующих гамма-карбоксилирования

Формула изобретения

1. Эукариотическая клетка-хозяин для продуцирования гамма-карбоксилированного белка, содержащая вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, и

вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую витамин К-эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, где данная клетка-хозяин дополнительно содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую -глутамилкарбоксилазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии.

2. Клетка-хозяин по п.1, где

указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, содержит первый промотор, и

указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая витамин К-

эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, содержит второй промотор,

где первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем второй промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и витамин К-эпоксидоредуктаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 5:1.

3. Клетка-хозяин по п.2, где первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем второй промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и витамин К-эпоксидоредуктаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 10:1.

4. Клетка-хозяин по п.2, где первый промотор представляет собой немедленный-ранний промотор человеческого цитомегаловируса (hCMV), и второй промотор представляет собой ранний промотор SV40.

5. Клетка-хозяин по п.1, где указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, содержит первый промотор, и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая -глутамилкарбоксилазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, дополнительно содержит третий промотор, где первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем третий промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и -глутамилкарбоксилаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 5:1.

6. Клетка-хозяин по п.5, где первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем третий промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и -глутамилкарбоксилаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 10:1.

7. Клетка-хозяин по п.5, где третий промотор представляет собой ранний промотор SV40.

8. Клетка-хозяин по п.1, где указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, требующий гамма-карбоксилирования, и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая -глутамилкарбоксилазу, находятся в одном векторе экспрессии.

9. Клетка-хозяин по п.1, где белок, который требует гамма-карбоксилирования, и витамин К-эпоксидоредуктаза экспрессируются в соотношении от 5:1 до 500:1.

10. Клетка по п.1, где белок, который требует гамма-карбоксилирования, выбран из группы, состоящей из фактора свертывания крови FVII, фактора свертывания крови FIX, протромбина, фактора свертывания крови FX, FVIIa, FIXa, FXa, протеаз змеиного яда, подобных фактору X, белка С, белка S, белка Z, костного Gla белка, матриксного Gla белка, белка 6, специфичного для задержки роста.

11. Клетка по п.1, где белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой фактор свертывания крови, зависимый от витамина К.

12. Клетка по п.1, где белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой фактор FIX.

13. Клетка по п.1, где белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой FX.

14. Клетка по п.1, где белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой протеазы змеиного яда, подобные фактору X.

15. Клетка по п.1, где белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой протромбин.

16. Клетка по п.1, где белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой FVII.

17. Клетка по любому из пп.1-16, которая представляет собой клетку млекопитающего.

18. Способ получения гамма-карбоксилированного белка, включающий (1) культивирование клетки по любому из пп.1-17 и (2) выделение гамма-карбоксилированного белка.

19. Способ по п.18, где указанная клетка экспрессирует белок, который требует гамма-карбоксилирования, и витамин К-эпоксидоредуктазу в соотношении по меньшей мере 10:1 при условиях, подходящих для экспрессии обоих белков.

20. Способ получения фармацевтической композиции, пригодной для индукции свертывания крови или стимуляции повышенного или пониженного свертывания крови, включающий получение активного карбоксилированного белка по любому из пп.18 или 19, очистку указанного белка и смешивание очищенного карбоксилированного белка с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями или эксципиентами.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую витамин K-эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, и -глутамилкарбоксилазу и ассоциированные контрольные последовательности. Данное изобретение дополнительно относится к способу получения белка, требующего гамма-карбоксилирования, с высокими выходами.

Предшествующий уровень техники

Кровотечение является обычной клинической проблемой. Оно является следствием заболевания, травмы, хирургического вмешательства и медицинского лечения. Механическая остановка кровотечения является настоятельной необходимостью. Это может быть затруднительным или даже невозможным из-за локализации кровотечения или из-за того, что кровь диффундирует из многих (маленьких) сосудов. Пациентам, которые имеют кровотечение, таким образом, может требоваться лечение агентами, которые поддерживают гемостаз. Это могут быть продукты, происходящие из крови (гемотерапия), агенты, которые вызывают высвобождение эндогенных гемостатических агентов, рекомбинантные факторы свертывания крови (F) или агенты, которые задерживают растворение сгустков крови.

Среди продуктов, происходящих из крови, часто получаемых из местного госпиталя, лечением первого ряда являются цельная кровь для замещения объема и поддержки гемостаза, упакованные красные кровяные клетки для улучшения способности транспортировать кислород, концентраты тромбоцитов для повышения числа тромбоцитов (если оно является низким, или они являются дефективными) и свежая замороженная плазма для поддержки гемостаза (свертывание крови и агрегация тромбоцитов). Второй линией продуктов, происходящих из плазмы, которые поддерживают гемостаз, являются криопреципитат, концентраты комплекса протромбина, концентраты активированного комплекса протромбина и очищенные факторы свертывания крови. Несколько факторов свертывания крови доступны сегодня в виде человеческих рекомбинантных белков, неактивных (факторы свертывания крови VIII и IX) и активированных (фактор свертывания крови VIIa).

Гемофилия представляет собой наследственное или приобретенное расстройство, связанное с кровотечением, либо с ненормальным или находящимся в недостатке фактором свертывания крови, или с антителами, направленными на фактор свертывания крови, которые ингибируют функцию прокоагулянта. Самыми обычными гемофилиями являются гемофилия А (недостаток фактора свертывания крови VIII) и гемофилия В (фактор IX). Очищенные или рекомбинантные одиночные факторы свертывания крови являются главным способом лечения пациентов с гемофилией. У пациентов с ингибиторными антителами имеется проблема с лечением, так как они также могут нейтрализовать фактор свертывания крови, который вводится пациенту.

Активная форма белка С (АРС) представляет собой ингибитор свертывания плазмы путем деградации активированных факторов свертывания крови Va и VIIIa. Было показано, что рекомбинантный АРС является эффективным средством для лечения чрезмерного свертывания крови у пациентов с сепсисом.

Факторы свертывания крови для терапевтического применения можно получить из человеческой плазмы, хотя процесс их очистки является непростым и требует многих стадий, несколько из которых нацелено на устранение загрязняющих вирусов. Но даже при расширенных мерах безопасности и тестирования продуктов, происходящих из крови, нельзя исключить загрязнения инфекционными вирусами или прионами. Из-за этого риска весьма желательным является получение человеческих терапевтических белков из рекомбинантных клеток, выращенных в средах без компонентов животного происхождения. Этот подход не всегда является прямым, так как для того, чтобы многие белки вырабатывались в полностью функциональной форме, т.е. были правильно посттрансляционно модифицированными, требуется млекопитающее-хозяин. Среди факторов свертывания крови, выпускаемых в рекомбинантных клетках в промышленном масштабе, находятся FVII (NovoSeven), FVIII (Kogenate, Recombinate, Refacto) и FIX (BeneFix) (Roddie and Ludlam. Blood Rev. 11:169-177, 1997) и активный белок С (Xigris). Одним из главных препятствий при получении больших количеств полностью функциональных рекомбинантных человеческих факторов свертывания крови является домен Gla, присутствующий у FII, FVII, FIX, FX, белка S и белка С. Этот домен содержит остатки глутаминовой кислоты, которые посттрансляционно модифицируются добавлением карбоксильных групп. Выработка этих факторов затруднена тем фактом, что их сверхэкспрессия приводит к образованию недокарбоксилированного и, следовательно, неактивного белка. Модификации Gla представляют собой результат действия фермента, зависимого от витамина K, называющегося -глутамилкарбоксилазой (GGCX). Этот фермент был подробно исследован многими учеными, конкретно теми, которые участвуют в исследовании факторов свертывания крови (WO-A-8803926; Wu et al. Science 254(5038); 1634-1636, 1991; Rehemtulla et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:4611-4615, 1993; Stanley J. Biol. Chem. 274(24): 16940-16944, 1999; Vo et al., FEBS Letters 445:256-260, 1999; Begley et al., The Journal of Biological Chemistry 275(46):36245-36249, 2000; Walker et al., The Journal of Biological Chemistry 276(11):7769-7774, 2001; Bandyopadhyay, et al. Proc Natl Acad Sci USA 99(3):1264-1269, 2002; Czerwiec et al., Eur J Biochem 269:6162-6172, 2002; Hallgren et al., Biochemistry 41(50):15045-15055, 2002; Harvey et al., The Journal of Biological Chemistry 278(10):8363-8369, 2003). Попытки коэкспрессировать GGCX с фактором свертывания крови FIX были предприняты по меньшей мере двумя научными группами, но они не были успешными (Rehemtulla, et al. 1993, ibid; Hallgren et al. 2002, ibid). Принимая во внимание большой интерес к ферментам GGCX, можно предположить, что значительно больше исследований потерпели неудачу и поэтому не были описаны. GGCX требует в качестве кофактора восстановленного витамина К. Восстановленный витамин К превращается с помощью GGCX в эпоксид витамина К, который рециклируется до восстановленного витамина К с помощью витамин K-эпоксидоредуктазы (VKOR). Таким образом, для эффективного зависимого от витамина К карбоксилирования белков требуются два фермента - GGCX и VKOR. Клонирование и идентификацию VKOR описали в 2004 году (Li et al., Nature 427:541-543, 2004, Rost et al., Nature 427:537-541, 2004). Белок VKOR представляет собой полипептид из 163 аминокислот с по меньшей мере одним предсказываемым трансмембранным участком. В рекомбинантных клетках, экспрессирующих VKOR, данная активность локализуется в микросомальной субклеточной фракции.

Для человеческого FII (протромбин) по меньшей мере 8 из 10 остатков Glu должны быть правильно модифицированы для того, чтобы получить полностью функциональный протромбин (Malhotra, et al., J. Biol. Chem. 260:279-287, 1985; Seegers and Walz. Prothrombin and other vitamin K proteins. CRC Press, 1986). Аналогично свертывающая активность человеческого фактора свертывания крови IX требует -карбоксилирования по меньшей мере 10 из 12 остатков глутаминовой кислоты в домене Gla (White et al., Thromb. Haemost. 78:261-265, 1997). Были предприняты большие усилия по получению высоких уровней выработки rhFII с использованием нескольких разных систем, таких как системы экспрессии на основе клеток СНО, клеток ВНК, клеток 293 и вируса осповакцины, но все они потерпели неудачу или привели к недокарбоксилированному продукту и, таким образом, функционально неактивному протромбину (Jorgensen et al., J. Biol. Chem. 262:6729-6734, 1987; Russo et al., Biotechnol Appl Biochem 14(2):222-233, 1991; Fischer et al., J Biotechnol 38(2):129-136, 1995; Herlitschka et al. Protein Expr. Purif. 8(3):358-364, 1996; Russo et al., Protein Expr. Purif. 10:214-225, 1997; Vo et al. 1999, ibid; Wu and Suttie Thromb Res 96(2):91-98, 1999). Сообщавшиеся ранее продуктивности карбоксилированного рекомбинантного человеческого протромбина являются низкими - 20 мг/л для мутантного протромбина (Côte et al., J. Biol. Chem 269:11374-11380, 1994), 0,55 мг/л для человеческого протромбина, экспрессируемого в клетках СНО (полностью карбоксилированный, Jørgensen et al. 1987, ibid), 25 мг/л в клетках СНО (степень карбоксилирования не указана, Russo et al. 1997, ibid).

Насколько известно, о коэкспрессии белка, требующего -карбоксилирования, и VKOR ранее не сообщалось.

WO 92/19636 раскрывает клонирование и идентификацию последовательности человеческой и коровьей витамин K-зависимой карбоксилазы. В данной заявке говорится о коэкспрессии витамин K-зависимой карбоксилазы (GGCX) и витамин K-зависимого белка в подходящей клетке-хозяине для того, чтобы получить витамин K-зависимый белок. Коэкспрессия данной карбоксилазы и витамин K-зависимого белка не проиллюстрирована примерами.

В WO 2005/038019 заявлен способ увеличения общей продуктивности -карбоксилированного белка контролируемой коэкспрессией -карбоксилированного белка и GGCX. Данное изобретение проиллюстрировано примерами с улучшенной продуктивностью факторов свертывания крови II и FIX.

WO 2005/030039 говорит о коэкспрессии витамин K-зависимых белков с витамин K-эпоксидредуктазой (VKOR) для того, чтобы улучшить -карбоксилирование. Однако такая коэкспрессия не проиллюстрирована примерами.

Sun et al. (Blood 106: 3811-3815, 2005) было показано, что коэкспрессия фактора свертывания крови Х (FX) и VKOR увеличивает долю -карбоксилированного белка. Кроме того, Wajih et al. (JBC 280:31603-31607, 2005) продемонстрировали увеличение доли -карбоксилированного фактора свертывания крови IX (FIX) путем коэкспрессии с VKOR. В обеих публикациях сообщили, что VKOR увеличивал долю -карбоксилированного белка, но коэкспрессия VKOR не улучшала общую продуктивность фактора свертывания крови.

Существует потребность в улучшенных способах получения активированных факторов свертывания крови с повышенными выходами. Настоящее изобретение предложено для удовлетворения этой потребности.

Краткое изложение сущности изобретения

Согласно первому аспекту данного изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, и вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую витамин K-эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, где данная клетка-хозяин дополнительно содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую -глутамилкарбоксилазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии.

В другом аспекте предложена клетка, которая модифицирована генно-инженерным образом для экспрессии (1) белка, который требует -карбоксилирования, и (2) витамин K-эпоксидоредуктазы, где данные белки (1) и (2) экспрессируются в соотношении от 10:1 до 500:1.

Согласно другому аспекту предложена генетически модифицированная эукариотическая клетка, содержащая: (1) полинуклеотид, кодирующий белок витамин K-эпоксидоредуктазу, где указанная кодирующая последовательность белка витамин К-эпоксидоредуктаза функциональным образом связана с последовательностями контроля экспрессии, обеспечивающими экспрессию белка витамин K-эпоксидоредуктаза указанной клеткой; (2) полинуклеотид, кодирующий белок, требующий карбоксилирования белком -глутамилкарбоксилазой, функциональным образом связанный с последовательностями контроля экспрессии, обеспечивающими экспрессию указанного белка, требующего карбоксилирования, указанной клеткой, и (3) полинуклеотид, кодирующий гамма-глутамилкарбоксилазу.

Согласно еще одному другому аспекту предложен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую витамин K-эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии.

Согласно другому аспекту предложен способ получения гамма-карбоксилированного белка, включающий: (1) культивирование клетки, экспрессирующей рекомбинантный белок, который требует гамма-карбоксилирования, витамин K-эпоксидоредуктазу и -глутамилкарбоксилазу, и (2) выделение гамма-карбоксилированного белка.

Согласно другому аспекту предложен способ получения фармацевтической композиции, пригодной для индукции свертывания крови или стимуляции повышенного или пониженного свертывания крови, включающий проведение очистки активного карбоксилированного белка, полученного согласно описанным выше способам, и смешивание очищенного карбоксилированного белка с одним или более чем одним фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом.

Согласно другому аспекту предложен способ стимуляции повышенного или пониженного свертывания крови у субъекта, включающий введение фармакологически эффективного количества выделенного гамма-карбоксилированного белка, полученного описанными выше способами, нуждающемуся в этом пациенту.

Данный белок, требующий гамма-карбоксилирования, полученный способами по настоящему изобретению, можно использовать в гемостатической или антитромботической терапии.

Краткое описание графических материалов

Фиг.1 показывает карту плазмиды вектора коэкспрессии F10NopA (фактор Х+GGCX) и карту плазмиды вектора экспрессии VKORzeo (VKOR).

Фиг.2 показывает карты плазмид векторов, используемых для коэкспрессии FII, GGCX и VKOR.

Подробное описание изобретения

Согласно первому аспекту данного изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, и вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую витамин K-эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, где данная клетка-хозяин дополнительно содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую -глутамилкарбоксилазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии.

В одном воплощении указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, содержит первый промотор, и указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая витамин K-эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, содержит второй промотор. В другом воплощении первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем второй промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и витамин K-эпоксидоредуктаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 10:1. В другом воплощении первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем второй промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и витамин K-эпоксидоредуктаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 5:1.

В другом воплощении данная клетка дополнительно содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую -глутамилкарбоксилазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии. В одном воплощении данная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая -глутамилкарбоксилазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, дополнительно содержит третий промотор, где первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем третий промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и -глутамилкарбоксилаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 10:1. В другом воплощении первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем второй промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и витамин K-эпоксидоредуктаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 5:1.

Первый промотор может быть немедленным-ранним промотором человеческого цитомегаловируса (hCMV), и второй и третий промотор могут быть ранним промотором SV40.

В одном конкретном воплощении и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая, витамин K-эпоксидоредуктазу, и, возможно, -глутамилкарбоксилазу, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, локализуются в том же самом векторе экспрессии. В другом воплощении эти две или, возможно, три молекулы нуклеиновой кислоты локализуются в двух или более чем в двух отдельных векторах экспрессии.

В другом аспекте предложена клетка, которая модифицирована генно-инженерным образом для экспрессии (1) белка, который требует гамма-карбоксилирования, и (2) витамин K-эпоксидоредуктазы, где белки (1) и (2) экспрессируются в соотношении от 10:1 до 500:1. В другом воплощении белки (1) и (2) экспрессируются в соотношении от 5:1 до 500:1.

Белок, который требует гамма-карбоксилирования, выбран из группы, состоящей из фактора свертывания крови VII, фактора свертывания крови FVII, фактора свертывания крови IX, фактора свертывания крови FIX, протромбина, фактора свертывания крови II, фактора свертывания крови FII, фактора свертывания крови X, фактора свертывания крови FX и их активированных форм FVIIa, FIXa, FXa, белка С, белка S, белка Z, костного белка Gla, матриксного белка Gla, белка 6, специфичного для задержки роста, протеаз змеиного яда, аналогичных факторам свертывания крови, таких как протеазы змеиного яда, подобные фактору X, и белок, подобный FXa Acanthophiinae.

В одном воплощении белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой фактор свертывания крови, зависимый от витамина K. В другом воплощении белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой фактор IX. В третьем воплощении белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой протромбин. В четвертом воплощении белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой фактор X. В пятом воплощении белок, который требует гамма-карбоксилирования, представляет собой фактор VII.

Белок, который требует гамма-карбоксилирования, предпочтительно представляет собой человеческий белок, но все эукариотные белки охвачены данным изобретением. Витамин K-эпоксидоредуктаза предпочтительно представляет собой человеческий белок, но в настоящем изобретении могут быть использованы все эукариотические витамин K-эпоксидоредуктазы. -глутамилкарбоксилаза предпочтительно представляет собой человеческий белок, но в настоящем изобретении могут быть использованы все эукариотические -глутамилкарбоксилазы.

Согласно другому аспекту предложена генетически модифицированная эукариотическая клетка-хозяин, содержащая:

(1) полинуклеотид, кодирующий белок витамин K-эпоксидоредуктазу, где указанная последовательность, кодирующая белок витамин K-эпоксидоредуктазу, функциональным образом связана с последовательностями контроля экспрессии, обеспечивающими экспрессию белка витамин K-эпоксидоредуктазы указанной клеткой;

(2) полинуклеотид, кодирующий белок, требующий карбоксилирования белком -глутамилкарбоксилазой, функциональным образом связанный с последовательностями контроля экспрессии, обеспечивающими экспрессию указанного белка, требующего карбоксилирования, указанной клеткой;

(3) полинуклеотид, кодирующий гамма-глутамилкарбоксилазу, где указанная последовательность, кодирующая белок гамма-глутамилкарбоксилазу, функциональным образом связана с последовательностями контроля экспрессии, обеспечивающими экспрессию белка гамма-глутамилкарбоксилазы указанной клеткой.

В одном воплощении данная клетка способна экспрессировать белок витамин K-эпоксидоредуктазу и белок, требующий карбоксилирования, в соотношении по меньшей мере 1:10. В другом воплощении указанное соотношение составляет по меньшей мере 1:5.

Клетка-хозяин предпочтительно представляет собой эукариотическую клетку. Типичные клетки-хозяева включают, но не ограничиваются, клетки насекомых, дрожжевые клетки и клетки млекопитающих. Клетки млекопитающих являются особенно предпочтительными. Подходящие линии клеток млекопитающих включают клетки СНО, НЕK, N50, 293, Per С.6, ВНК и COS и их производные, но не ограничиваются ими. В одном воплощении клеткой-хозяином является клеточная линия млекопитающих CHO-S.

Согласно еще одному другому аспекту предложен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую витамин K-эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии. В одном воплощении данная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, требующий гамма-карбоксилирования, и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, содержит первый промотор, и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая витамин K-эпоксидоредуктазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, содержит второй промотор. Первый промотор может быть в достаточной степени более сильным, чем второй промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и витамин K-эпоксидоредуктаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 10:1. В другом воплощении это соотношение составляет 5:1. Данный вектор также может содержать молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую -глутамилкарбоксилазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии. Указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая -глутамилкарбоксилазу и ассоциированные последовательности контроля экспрессии, может содержать третий промотор, где первый промотор является в достаточной степени более сильным, чем третий промотор, так что белок, требующий гамма-карбоксилирования, и -глутамилкарбоксилаза экспрессируются в соотношении по меньшей мере 10:1. В другом воплощении это соотношение составляет 5:1. Белок, который требует гамма-карбоксилирования, можно выбрать из группы, состоящей из фактора свертывания крови VII, фактора свертывания крови FVII, фактора свертывания крови IX, фактора свертывания крови FIX, протромбина, фактора свертывания крови II, фактора свертывания крови FII, фактора свертывания крови X, фактора свертывания крови FX и их активированных форм FVIIa, FIXa, FXa, протеаз змеиного яда, аналогичных факторам свертывания крови, таких как протеазы змеиного яда, подобные фактору Х и белку, подобному FXa Acanthophiinae, белка С, белка S, белка Z, костного Gla белка, матриксного Gla белка, белка 6, специфичного для задержки роста.

Согласно другому аспекту предложен способ получения гамма-карбоксилированного белка, включающий: (1) культивирование клетки, экспрессирующей рекомбинантный белок, который требует гамма-карбоксилирования, витамин K-эпоксидоредуктазу и -глутамилкарбоксилазу, и (2) выделение гамма-карбоксилированного белка.

Указанная клетка экспрессирует белок, который требует гамма-карбоксилирования, и витамин K-эпоксидоредуктазу в соотношении по меньшей мере 10:1 при условиях, подходящих для экспрессии обоих белков.

Можно ожидать, что факторы свертывания крови, зависимые от витамина K (FII, FVII, FIX, FX и их активированные формы FIIa или тромбин, FVIIa, FIXa, FXa), полученные настоящим способом коэкспрессии с одним VKOR или в комбинации с GGGX, являются полезными при предупреждении и лечении кровотечения после травмы, хирургического вмешательства или заболеваний печени, почек, тромбоцитов или заболеваний, связанных с факторами свертывания крови (гемофилия). Подобным образом, можно ожидать, что фактор свертывания крови белок С и его активированная форма АРС являются полезными при предупреждении и лечении расстройств, связанных с повышенным свертыванием крови, в присутствии или в отсутствие пониженных уровней белка С. Данный способ также применим к другим белкам, которые требуют посттрансляционного карбоксилирования.

Настоящее изобретение будет применимо для улучшения продуктивности любого белка, который зависит от -карбоксилирования, причем такие белки включают протромбин, фактор свертывания крови II (FII), фактор свертывания крови VII (FVII), фактор свертывания крови IX (FIX), фактор свертывания крови Х (FX), белок С, белок S, белок Z, костный Gla белок (также известный как BGP или остеокальцин), матриксный Gla белок (MGP), обогащенный пролином Gla полипептид 1 (PRRG1), обогащенный пролином Gla полипептид 2 (PRRG2), белок 6, специфичный для задержки роста (Gas 6), но не ограничиваются ими. Другими подходящими белками являются: FXa-подобный белок в яде змей семейства Elapidae (пoдceмeйcтвa Acanthophiinae) и в яде конических улиток (Conus textile).

Каждый из этих белков, включая кодирующие их последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности, является хорошо известным. Таблица 1 определяет репрезентативные последовательности дикого типа и мутантных форм разных белков, которые можно использовать в настоящем изобретении.

Будет понятно, что данное изобретение не ограничивается конкретным белком или последовательностью, кодирующей белок, одного из этих белков, подлежащих коэкспрессии. Кроме того и конкретно по отношению к факторам свертывания крови, в данной области были раскрыты многочисленные мутантные формы данных белков. Настоящее изобретение в равной степени приложимо к этим мутантным формам, включая встречающиеся в природе аллельные варианты, данных белков, а также к последовательностям дикого типа. В одном воплощении данное изобретение может иметь дело с любым белком дикого типа или с белком по меньшей мере с 90%-ной, предпочтительно по меньшей мере 95%-ной идентичностью последовательности с ним.

Идентичность последовательности между двумя последовательностями можно определить компьютерным анализом попарного выравнивания, используя такие программы, как BestFit, Gap или FrameAlign. Предпочтительным инструментом выравнивания является BestFit. На практике при поиске последовательностей, сходных/идентичных с запрашиваемой последовательностью, из базы данных последовательностей обычно необходимо проводить первоначальную идентификацию аналогичных последовательностей, используя подходящее программное обеспечение, такое как Blast, Blast2, NCBI Blast2, WashU Blast2, FastA, Fasta3 и PILEUP, и матрицу подсчета, такую как Blosum 62. Такие программные пакеты стремятся к близкому приближению к «золотому стандарту» алгоритма выравнивания Смита-Уотермана (Smith-Waterman). Таким образом, предпочтительное программное обеспечение/программное средство поиска для применения в оценке сходства, т.е. того, как две первичные полипептидные последовательности выравниваются, основано на алгоритме Смита-Уотермана. Термин «идентичность» относится к прямым соответствиям, термин «сходство» допускает консервативные замены.

Термин «витамин K-эпоксидоредуктаза» или «VKOR» в том виде, как он здесь используется, относится к ферменту, который катализирует восстановление эпоксида витамина K и витамина K с образованием восстановленного витамина K.

Витамин K-редуктазы являются широко распространенными, и они были клонированы из нескольких разных видов, таких как мышь (Mus musculus), крыса (Rattus norveigicus), курица (Gallus gallus) и крупный рогатый скот (Bos taurus). Гомологичные белки можно предсказать из последовательностей из организмов самого разнообразного филогенетического происхождения, таких как млекопитающие, птицы, земноводные, костистые рыбы, двукрылые, кинетопластиды и бактерии. Таблица 2 представляет неограничивающий список репрезентативных последовательностей предсказанных белков-гомологов человеческой VKOR (которые отсортированы согласно виду, из которого они происходят), которые можно использовать в настоящем изобретении.

Термин « -глутамилкарбоксилаза» или «GGCX» в том виде, как он здесь используется, относится к ферменту, зависимому от витамина К, который катализирует карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты.

Ферменты GGCX являются широко распространенными, и они были клонированы из многих разных видов, таких как белуха (Delphinapterus leucas), рыба-жаба (Opsanus tau), курица (Gallus gallus), миксина (Myxine glutinosa), мечехвост (Limulus polyphemus) и коническая улитка (Conus textile) (Begley et al., 2000, ibid; Bandyopadhyay et al. 2002, ibid). Карбоксилаза из конической улитки схожа с карбоксилазой крупного рогатого скота, и ее экспрессировали в клетках COS (Czerwiec et al. 2002, ibid). Другие белки, аналогичные GGCX, можно найти у насекомых и прокариот, таких как Anopheles gambiae, Drosophila melanogaster и Leptospira с номерами доступа NCBI: gi 31217234, gi 21298685, gi 24216281 и gi 24197548 (Bandyopadhyay et al. 2002, ibid) соответственно. Карбоксилазные ферменты демонстрируют замечательный эволюционный консерватизм. Несколько ферментов, не являющихся человеческими, показали, или для них можно было предсказать активность, аналогичную активности человеческой GGCX, которую использовали авторы данного изобретения, и, следовательно, их можно использовать в качестве альтернативы человеческому ферменту.

Таблица 3 определяет репрезентативные последовательности предсказываемых белков, гомологичных человеческой GGXC (отсортировано согласно виду, из которого они происходят), которые можно использовать в настоящем изобретении.

Каждый из определенных выше белков GGCX можно использовать в настоящем изобретении в качестве карбоксилазного фермента.

Одним способом осуществления коэкспрессии белков является применение разных промоторов в виде части соответствующих последовательностей контроля экспрессии. Данная область насыщена примерами разных векторов клонирования, промоторов и других последовательностей контроля экспрессии, которые способны к экспрессии гетерологичных белков до разного уровня или в разной степени. Методика рекомбинантной экспрессии является подходящим образом разработанной так, что специалист в области экспрессии белка способен выбрать промоторы и другие контрольные последовательности для осуществления коэкспрессии белка, требующего карбоксилирования, витамин K-эпоксидоредуктазы и, возможно, -карбоксилазы. Выбор того, какие конкретные промоторы и другие последовательности контроля экспрессии следует использовать, является вопросом иднивидуального выбора.

В одном воплощении контрольные последовательности, ассоциированные с белком, требующим гамма-карбоксилирования, содержат сильный промотор. В одном воплощении это - немедленный-ранний промотор человеческого цитомегаловируса (hCMV). Сильный промотор здесь определяется как промотор, дающий по меньшей мере в 5 раз более высокое число транскриптов мРНК, чем слабый промотор, используемый в той же самой клетке при аналогичных условиях.

В другом воплощении контрольные последовательности, ассоциированные с витамин K-эпоксидоредуктазой и, когда она присутствует, с -глутамилкарбоксилазой, содержат слабый промотор. В одном воплощении - это ранний промотор SV40. В другом воплощении белок, требующий гамма-карбоксилирования, витамин K-эпоксидоредуктаза и, возможно, -глутамилкарбоксилаза, находятся под контролем разных промоторных элементов с промотором, контролирующим экспрессию витамин K-эпоксидоредуктазы и, возможно, -глутамилкарбоксилазы, являющимся более слабым, чем промотор, контролирующий экспрессию белка, требующего гамма-карбоксилирования.

Данное изобретение было проиллюстрировано примерами использования сильного промотора CMV (Boshart et al. Cell 41:521-530, 1985) для сверхэкспрессии фактора Х и более слабого промотора SV40 (Wenger et al. Anal Biochem 221:416-418, 1994) для контроля экспрессии витамин K-эпоксидоредуктазы и, возможно, экспрессии GGCX. Другой сильный промотор, который можно было использовать согласно настоящему изобретению, включает, но не ограничивается pEF-1 [ген субъединицы человеческого фактора элонгации 1 (Mizushima and Nagata, Nuc Acids Res 18:5322, 1990; Goldman et al., BioTechniques 21:1013-1015, 1996)], pRSV [вирус саркомы Рауса (German et al., Proc Natl Acad Sci USA 79:6777-6781, 1982)] и pUbC [человеческий убиквитин (Schorpp et al., Nuc Acids Res 24:1787-1788, 1996)].

Данное изобретение также распространяется на очищенный гамма-карбоксилированный белок, получаемый способами по настоящему изобретению, и на его применение в коагуляционной терапии.

Согласно еще одному другому аспекту данного изобретения предложен способ стимуляции повышенного или пониженного свертывания крови у субъекта, включающий введение фармакологически эффективного количества выделенного гамма-карбоксилированного белка, полученного способами, описанными выше, пациенту, нуждающемуся в этом.

Согласно другому аспекту данного изобретения предложен способ получения фармацевтической композиции, пригодной для индукции свертывания крови, включающий очистку активного карбоксилированного белка, экспрессируемого в клетке-хозяине, адаптированной для экспрессии белка, требующего гамма-карбоксилирования, и -глутамилкарбоксилазы в соотношении по меньшей мере 5:1, и смешивание очищенного карбоксилированного белка с одним или более чем одним фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом.

Композиции по изобретению можно получить традиционными методиками с использованием традиционных фармацевтических эксципиентов, хорошо известных в данной области, но вероятнее всего она будет находиться в форме, подходящей для инъекции либо парентерально, либо непосредственно в место поражения.

Порошки, подходящие для получения водного препарата для инъекции путем добавления подходящего разбавителя, обычно содержат активный ингредиент совместно с подходящими носителями и эксципиентами, суспендирующим агентом и одним или более чем одним стабилизатором или консервантом. Данный разбавитель может содержать другие подходящие эксципиенты, такие как консерванты, модификаторы тоничности и стабилизаторы.

Фармацевтические композиции по изобретению также могут находиться в форме эмульсий масло-в-воде. Масляная фаза может представлять собой растительное масло, такое как оливковое масло или арахисовое масло, или минеральное масло, такое как, например, жидкий парафин, или смесь любых из этих масел. Подходящие эмульгаторы могут представлять собой, например, встречающиеся в природе камеди, такие как аравийская камедь или камедь трагаканта, встречающиеся в природе фосфатиды, такие как лецитин из соевых бобов, сложные эфиры или неполные эфиры, происходящие от жирных кислот или ангидридов гекситола (например сорбитанмоноолеат), и продукты конденсации указанных неполных эфиров с этиленоксидом, такие как полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат.

Фармацевтические композиции по данному изобретению также могут находиться в форме стерильного раствора или суспензии в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, который можно приготовить согласно известным методикам, используя один или более чем один подходящий диспергирующий или увлажняющий агент и суспендирующий агент, которые были упомянуты выше. Стерильный инъецируемый препарат также может представлять собой стерильный инъецируемый раствор или суспензию в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например раствор в 1,3-бутандиоле.

Для дополнительной информации в отношении композиций читатель отсылается к Главе 25.2 в Томе 5 Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansh; председатель редакционного совета), Pergamon Press 1990; или к Тому 99 Drugs and the pharmaceutical sciences; Protein formulation and delivery (Eugen J. McNally, ответственный редактор), Marcel Dekker Inc. 2000.

Количество активного ингредиента, которое объединяют с одним или более чем одним эксципиентом для получения стандартной лекарственной формы с необходимостью будет варьировать в зависимости от хозяина, подлежащего лечению, и конкретного пути введения. Например, композиция, предназначенная для инъекции человеку, обычно будет содержать, например, от 0,2 мг до 6 г или от 0,5 мг до 2 г активного агента, смешанного с подходящим и удобным количеством эксципиентов, которое может варьировать от примерно 5 до примерно 98 процентов от общей массы композиции. Стандартные лекарственные формы обычно будут содержать от примерно 0,2 мг до примерно 10 г или от примерно 1 мг до примерно 500 мг активного ингредиента. Белковые терапевтические агенты обычно хранят замороженными или лиофилизированными. Для дополнительной информации по путям введения и схемам дозирования читатель отсылается к Главе 25.3 в Томе 5 Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansh; председатель редакционного совета), Pergamon Press 1990.

Величина дозы соединения для терапевтических или профилактических целей естественно будет варьировать согласно природе и тяжести состояний, возрасту и полу животного или пациента и пути введения согласно хорошо известным принципам медицины. При использовании соединения для терапевтических или профилактических целей его обычно будут вводить так, чтобы получалась суточная доза в интервале, например, от 20 мкг до 75 мг на кг массы тела или от 0,5 мг до 75 мг на кг массы тела, которое, при необходимости, дают в раздельных дозах. В общем, при использовании парентерального пути будут вводиться меньшие дозы. Таким образом, например, для внутривенного введения обычно будет использоваться доза в интервале, например, от 20 мкг до 30 мг на кг массы тела или от 0,5 мг до 30 мг на кг массы тела. Аналогично, для введения ингаляцией будет использоваться доза в интервале, например, от 20 мкг до 30 мг на кг или от 0,5 мг до 25 мг на кг массы тела. В качестве альтернативы, данное соединение можно вводить в виде инфузии 1 мкг - 10 мг на кг массы тела в час на протяжении периода времени от нескольких часов до нескольких суток.

Экспериментальный раздел

Данное изобретение будет дополнительно описано следующими неограничивающими примерами.

При осуществлении настоящего изобретения на практике будут использоваться, если не указано иначе, традиционные способы молекулярной биологии и генной инженерии, находящиеся в пределах квалификации специалиста в данной области. Такие методики полностью раскрыты в литературе. Смотрите, например, Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3^rd ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY (2002); Glover & Hames, eds., DNA Cloning 3: A Practical Approach, Vols. I, II & III, IRL Press, Oxford (1995); Colowick & Kaplan, eds., Methods in Enzymology, Academic Press; Weir et al., eds., Handbook of Experimental Immunology, 5^th ed., Blackwell Scientific Publications, Ltd., Edinburgh, (1997).

Пример 1

Для исследования важности VKOR в экспрессии карбоксилированных белков авторы данного изобретения экспрессировали человеческий фактор свертывания крови Х (FX) в клетках СНО. Полностью функциональный FX экспрессировали ранее Camire et al. 2000 (Biochemistry 39:14322-14329), которые получили приблизительно 1 мкг карбоксилированного FX на миллион клеток в сутки, и Himmelspach et al. 2000 (Thromb Res 97:51-67), которые заявили получение вплоть до 25% (19,5 мкг) активного FX на миллион клеток в сутки, используя линию клеток СНО, которую подвергали DHFR амплификации. Himmelspach et al. сообщали о неполном процессинге рекомбинантного FX, и действительно показанная максимальная продуктивность FX составляла 5 мкг/мл культуральной среды. В обеих публикациях клетки выращивали как прикрепленные клетки в среде, содержащей сыворотку. Клетки выращивали до желательной конфлюентности, среду заменяли средой, не содержащей сыворотки, и продолжали инкубацию для обеспечения накопления продукта. Затем оценивали количество продукта из этой «бессывороточной» среды. Эта методика культивирования не подходит для получения белка в большом масштабе, так как клетки будут вырабатывать продукт только в течение короткого периода времени. Кроме того, данный продукт будет загрязнен сывороточными белками, такими как бычий FX, что является крайне нежелательным, так как сывороточные белки будет трудно удалить, и они, в случае присутствия в продукте, инъецированном пациенту, могут вызвать образование антител. Таким образом, не было показано, что полученные линии клеток являются подходящими для промышленного получения фармацевтического FX.

Создание стабильных линий клеток, продуцирующих рекомбинантный человеческий фактор Х

Кодирующую последовательность FX ПЦР-амплифицировали из кДНК печени человека, используя праймеры:

F10F1: 5'-CACACCATGGGGCGCCCACT-3' (SEQ ID NO:2)

F10R1: 5'-GAGTGGGATCTCACTTTAATGGA-3' (SEQ ID NO:3)

Клонирование продукта ПЦР сначала осуществляли ТА-ТОРО клонированием в pCDNA3.1-V5His (Invitrogen). Клоны, содержащие правильную последовательность FX, идентифицировали секвенированием ДНК и кратковременной экспрессией в клетках COS-7. Фрагмент с тупым концом, содержащий кодирующую последовательность FX, затем клонировали в вектор экспрессии nopА, расщепленный EcoRV и обработанный фосфатазой. Полученные клоны F10nopA (SEQ ID NO:6) подтверждали секвенированием ДНК вставленной последовательности и кратковременной экспрессией в COS-7.

Кодирующую последовательность VKOR ПЦР-амплифицировали из кДНК печени человека, используя праймеры:

VF1: 5'-CACCATGGGCAGCACCTGGGGGA-3' (SEQ ID NO:4)

VR1: 5'-GCTCAGTGCCTCTTAGCCTT-3' (SEQ ID NO:5)

Клонирование продукта ПЦР сначала осуществляли ТА-ТОРО клонированием в pCDNA3.1-V5His (Invitrogen). Клоны, содержащие правильную кодирующую последовательность VKOR (SEQ ID NO:1), идентифицировали секвенированием ДНК. Фрагмент HindIII-NotI, содержащий последовательность VKOR, затем переносили в вектор экспрессии pZeoSV2+ (Invitrogen), расщепленный теми же самыми ферментами. Полученные клоны VKORzeo (SEQ ID NO:7) подтверждали секвенированием ДНК.

Клетки CHO-S (Invitrogen) выращивали в среде DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла) F12, содержащей Glutamax I и 9% FBS (фетальная бычья сыворотка), обработанную нагреванием, по существу как рекомендовано Invitrogen. Трансфекцию CHO-S осуществляли F10nopA, расщепленным PvuI (линеаризованным), VKORzeo, расщепленным SspI, и Lipofectamine 2000, по существу как рекомендовано Invitrogen. Смесь для трансфекции ДНК содержала 1,6-кратный молярный избыток F10NopA по сравнению с VKORzeo. В сутки после трансфекции трансфицированные клетки высевали в 96-луночные планшеты в селективную среду: ростовая среда плюс 400 мкг/мл G418. Таким образом, конструкт VKORzeo не был выбран, но был случайным образом интегрирован в G418-устойчивых трансфектантов. На следующие сутки проверяли планшеты для подтверждения получения подходящего числа клонов на лунку (5-10). Через шесть суток после трансфекции селективную среду заменяли ростовой средой, дополненной витамином К (1 мкг/мл). На следующие сутки отбирали образцы из планшетов и анализировали на активность FX, используя анализ, основанный на яде цепочной гадюки (RVV-X), который активирует FX до FXa. Затем измеряли активность FXa с использованием хромогенного субстрата (S2765, Chromogenix, Mölndal, Sweden). Анализ RVV-X эквивалентен анализу, использованному Himmelspach et al. для той же самой цели. Идентифицировали лунки с наивысшей активностью и содержащиеся в них клоны наращивали и подвергали клонированию при низкой плотности клеток. После клонирования при низкой плотности клеток и выбора лучших клонов выбранные клоны наращивали и переводили на рост в среде, не содержащей белка (CD-CHO, дополненная, как рекомендовано Invitrogen, плюс 1 мкг/мл витамина K). Продуктивность рекомбинантного FX оценивали в культурах в Т-колбах. Экспрессию VKOR оценивали анализами ПЦР в реальном времени. Обнаружили, что все выбранные клоны, экспрессирующие полностью активный FX, также экспрессировали VKOR. Из этого авторы данного изобретения заключают, что коэкспрессия VKOR улучшает экспрессию полностью активного человеческого фактора свертывания крови X. Полученные линии клеток хорошо растут в среде, не содержащей белка и животных компонентов, и продуцируют FX в отсутствие селективного давления антибиотиков. Полученные линии клеток, следовательно, считаются подходящими для продуцирования белка в большом масштабе и способны продуцировать большие количества активного FX. Доля полностью активного FX также является значительно более высокой, чем сообщали ранее.

Пример 2

Анализы продуктивности и соотношений мРНК для коэкспрессии FX, VKOR и GGCX

Клоны, полученные в Примере 1, выращивали в Т-колбах в химически определенной среде для СНО, не содержащей белков, без антибиотиков (Invitrogen). Пробы для получения кДНК отбирали из 4-суточных культур и пробы для оценок продуктивности отбирали из культур через 5 суток после обычного гидролиза. Контрольные пробы также получали из родительской нетрансфицированной линии клеток CHO-S, выращенной в той же самой среде, и анализы контрольных проб давали ожидаемые результаты. Спин-культуры выращивали в CD-CHO, дополненной или не дополненной добавками, не содержащими животные компоненты. Количество активного rhFX оценивали анализом, основанным на RVV-X, как в Примере 1, и на стандарте серийно разбавленного фактора X, происходящего из очищенной плазмы (Haematologic Technologies Inc., Vermont, USA). РНК выделяли с Trizol согласно протоколу, предоставленному поставщиком, Invitrogen. Выделенную РНК обрабатывали ДНКазой I из набора DNA-free от Ambion. Синтез кДНК проводили, используя гексамерные праймеры и содержимое набора из системы синтеза первой нити Superscript для ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой, Invitrogen). Праймеры и зонды, меченные Vic, для ОТ-ПЦР в реальном времени выбирали, используя программное обеспечение Primer Express от Applied Biosystems.

Олигонуклеотиды человеческой -карбоксилазы

5' ACACCTCTGGTTCAGACCTTTCTT 3' прямой праймер (SEQ ID NO:8)

5' AATCGCTCATGGAAAGGAGTATTT 3' обратный праймер (SEQ ID NO:9)

5' CAACAAAGGCTCCAGGAGATTGAACGC 3' зонд (SEQ ID NO:10)

Олигонуклеотиды человеческого фактора Х

Праймеры были изготовлены Operon/Qiagen, и зонды были заказаны у Applied Biosystems.

5' CCGCAACAGCTGCAAGCT-3' прямой праймер (SEQ ID NO:11)

5' TGTCGTAGCCGGCACAGA-3' обратный праймер (SEQ ID NO:12)

5' CAGCAGCTTCATCATCACCCAGAACATG зонд (SEQ ID NO:13)

Олигонуклеотиды человеческого VKOR

5' GCTGGGCCTCTGTCCTGAT-3' прямой праймер Seq(SEQ ID NO:14)

5' ATCCAGGCCAGGTAGACAGAAC-3' обратный праймер Se(SEQ ID NO:15)

5' CTGCTGAGCTCCCTGGTGTCTCTCG зонд S(SEQ ID NO:16)

Также использовали контрольные праймеры и зонд GAPDH грызунов (Applied Biosystems; ABI # 4308318 TaqMan® Rodent GAPDH Control Reagents Protocol) - длина ампликона 177 п.н. Реакции ОТ-ПЦР в реальном времени проводили на 7500 Real Time PCR System, Applied Biosystems. Ожидаемую длину амплифицированных продуктов ПЦР подтверждали на агарозных гелях.

Таблица 4
Результаты анализов клонов, экспрессирующих FX, ПЦР в реальном времени
Название клона	FX мРНК/клетку	VKOR мРНК/клетку	GGCX мРНК/клетку	GAPDH мРНК/клетку
FX1-5	137	0,62	1	1553
FX2-5	13	0,48	0,26	2985
FX3-9	3	0,03	0,17	1891
FX6	267	3	11	2289
FX17-2	319	2	37	2381

Таблица 5
Оценка продуктивности и соотношения мРНК. Соотношения рассчитывали из данных в таблице 4. Продуктивность оценивали из анализов активности разбавленных проб культуры
Название клона	Соотношение FX:VKOR	Соотношение FX:GGCX	Активный FX мкг/мл Т-колбы	Активный FX мкг/мл спин-культуры
FX1-5	221:1	137:1	0,5	не делали
FX2-5	27:1	50:1	2,4	не делали
FX3-9	100:1	18:1	0,8	не делали
FX6	89:1	24:1	6,9	14
FX17-2	160:1	9:1	8,7	21

Все показатели продуктивности, перечисленные в Таблице 5, выше показателей продуктивностей, полученных ранее от неамплифицированных линий клеток. Оценка общей концентрации FX, включая неактивный FX, была проведена с использованием анализа Biacore и посредством SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) и Вестерн-блоттинга.

Анализ Biacore для оценки концентрации общего rhFX

Аналитические системы BIAcore3000 , проточный буфер (10 мМ HEPES, 0,15 М NaCl, 3,4 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) и 0,05% Р20, рН 7,4), кроличьи антимышиные Fc в 0,15 М NaCl (RAM Fc, № партии 610) и сенсорные чипы СМ5 приобретали у Biacore AB (Uppsala, Sweden). Процедуру проводили при скорости тока 5 мкл/мин при 25°. Для ковалентного сочетания 11000 RU (крысиные единицы) улавливающего антитела RAM Fc (35 мкл, 30 мкг/мл в 10 мМ натрий-ацетате, рН 5,0) с каналом 4 чипа СМ5 использовали стандартизированную методику аминного сочетания (35 мкл время активации) при 25°. После иммобилизации регенерировали поверхность 5 мкл 10 мМ глицинового буфера, рН 1,8 и проводили дополнительное уравновешивание проточным буфером. С помощью 20 мкл тока мышиного моноклонального антитела IgG против FX N77121M (Biodesign, Maine, USA) (разбавленного 1/100 в проточном буфере) улавливали 660 RU. Связывание FX в среде приводило к образованию очень стабильного комплекса с пренебрежимо малой диссоциацией. Для каждой новой пробы FX поверхность RAM Fc воспроизводимо регенерировали для множественных сэндвич-экспериментов. Для количественной оценки связывания 5 мкл FX использовали разницу RU между каналом 4 со связанным RAM Fc и каналом 3 с чистой поверхностью. Прогоняли стандарт (2, 4, 6, 8, 10, 15 и 20 мкг/мл в среде) pdFX от Haematologic Technologies Inc. (Vermont, USA), разницу RU откладывали на графике по отношению к концентрации phFX и аппроксимировали к данным уравнение для одного сайта связывания. Разницу RU неизвестных проб использовали для расчета концентрации rhFX из стандартной кривой.

Таблица 6
Доля полностью активного продуцированного rhFX. Общее количество rhFX оценивали из проб спин-культуры, используя анализ Biacore, и количество активного rhFX оценивали анализом RVV-X. Все пробы происходят из спин-культур в ростовой среде, не содержащей животных компонентов
Клон/проба	Общий FX мкг/мл (анализ Biacore)	Активный FX мкг/мл (RVV-X)	% активного FX
FX17-2/p050131	18,6	10,1	54
FX17-2/p050202	20,6	9,6	47
FX17-2/p050225	11,8	12,1	103
FX17-2/sp2050309	38,3	16,3	43
FX17-2/sp1050309	25,1	13,6	54
FX17-2/sp2050310	39,7	21,1	53
FX17-2/sp1050310	28,1	13	46

Результаты в Таблице 6 показывают, что коэкспрессия VKOR увеличивает экспрессию полностью активного rhFX. Высокая доля (43-103%) полностью активного rhFX согласуется с данными SDS-PAGE, Вестерн-блоттинга и очистки белка.

Пример 3

Коэкспрессия человеческого протромбина, GGCX и VKOR

Для получения линии клеток, способной продуцировать высокие уровни полностью активного человеческого протромбина (hFII), авторы данного изобретения ранее коэкспрессировали зависимую от витамина К модификацию фермента -глутамилкарбоксилазы (GGCX) и hFII. Используя эту стратегию, авторы данного изобретения получили клон Р1Е2. Р1Е2 представляет собой высокопродуктивный клон, экспрессирующий rhFII, но, несмотря на то что экспрессия правильно модифицированного rhFII является значительно усиленной по сравнению с другими клонами, вырабатывающими FII, все же только 20-60% (в зависимости от условий культивирования) общего количества этого выработанного rhFII являются полностью -карбоксилированными. В попытке дополнительно улучшить уровень полностью -карбоксилированного rhFII и, следовательно, снизить стоимость выработки rhFII была протестирована новая стратегия экспрессии с использованием витамин K-эпоксидредуктазы (VKOR). Авторы данного изобретения клонировали VKOR в двух разных векторах под контролем двух разных промоторов: pCMV - в векторе рHygro, и pSV40 - в векторе pZeo. Установлено, что в клетках СНО промотор pCMV имеет приблизительно в 6 раз более высокую промоторную активность, чем промотор pSV40. Оба конструкта использовали в двух отдельных котрансфекциях для получения клеточных линий, вырабатывающих rhFII.

Создание линии клеток и оценки продуктивности

Создание линии клеток инициировали котрансфекциями CHO-S конструктом РР6 (кодирующим hFII и hGGCX) (SEQ ID NO:20) и любым из конструктов VKOR (Фиг.1-2). Молярные соотношения, используемые при данных трансфекциях, составляли 2:3 (PP6:VKOR). После посева и селекции трансфектантов в 96-луночных планшетах затем подвергали скринингу в общей сложности 5500-8500 клонов на трансфекцию, используя хромогенный анализ на основе экарина. После первоначального скрининга выбрали 18 пулов клонов. После второго скрининга выбрали 9 пулов клонов, нарастили их и подвергли третьему скрининговому анализу. Для каждой трансфекции выбирали лучший продуцирующий пул клонов для ограничивающего разбавления. В шесть 96-луночных планшетов высевали 0,5 клеток/лунку. Выбирали 24 клона и увеличивали их объем после скрининга. Так как не производилась селекция на векторы, кодирующие VKOR, провели анализ Taqman для подтверждения экспрессии VKOR. Во всех трех лучших выбранных клонах A3F4 (РР6/pZeoVKOR), В11Е8 и В9А12 (РР6/pHygroVKOR) определяли мРНК VKOR. Для оценки и сравнения продуктивности rhFII для клонов PP6/VKOR по сравнению с клоном Р1Е2 проводили четыре раунда экспериментов со спин-культурами.

Таблица 7
Выработка rhFII в колбах для спин-культур
Клеточ- ная линия	ID пробы	Серия эксперимента	Активный rhFII (мкг/мл)	SPR (пг/клетку/сутки)	Доля активного rhFII (активный rhFII/общий rhFII в %)
A3F4	050317	А	10,3	1,38	100
A3F4	050415	Б	27,6	1	100
A3F4	050425	В	23	2,6	100
В9А12	050317	А	10,3	0,84	68
В9А12	050413	Б	27,4	1	100
В9А12	050424	В	14,4	6,06	79
В11Е8	050317	А	13	1,74	75
В11Е8	050414	Б	27,4	2,2	80
В11Е8	050424	В	22,2	4	78
Р1Е2	050415	Б	37,6	2,1	61
Р1Е2	050424	В	25,4	2,5	21

Новый подход для коэкспрессии VKOR, GGCX и rhFII привел к получению нескольких клонов, экспрессирующих rhFII, продуцирующих значительно более высокую долю (60-100%) полностью активного rhFII по сравнению с клоном Р1Е2 (20-60%, смотрите Таблицу 1). Для двух из клонов, В11Е8 и В9А12 (в обоих случаях котрансфекция РР6/рHygro VKOR), была получена более высокая удельная скорость продуцирования (количество активного белка, продуцированного на клетку в сутки, SPR), чем для клона Р1Е2, при тех же самых условиях культивирования. Клон A3F4 продуцировал 100% полностью карбоксилированного rhFII во всей серии экспериментов по культивированию. Этот клон имеет наивысшее отношение мРНК обоих модифицированных ферментов (GGCX и VKOR) по отношению к FII по сравнению с двумя другими клонами. Однако A3F4 не продуцирует больше полностью активного rhFII по сравнению с другими клонами.

Пример 4

Улучшенное -карбоксилирование путем сверхтрансфекции VKOR

Во второй попытке использовать VKOR для улучшения продуцирования rhFII клон Р1Е2 (Пример 3) модифицировали для коэкспрессии VKOR. В этом случае для трансфекции Р1Е2 (смотрите Приложение, Фиг.1) использовали конструкт pHydroVKOR (SEQ ID NO:22) и клоны подвергали скринингу на улучшенную продуктивность анализом активности протромбиназы. Всего 7000-8000 клонов подвергали скринингу, используя конечную точку анализа протромбиназы, адаптированного к 96-луночному формату. После первоначального скрининга выбирали шестнадцать пулов клонов. Выбранные пулы клонов наращивали и подвергали скринингу как анализом с экарином, так и анализом протромбиназы, для того, чтобы оценить долю активного rhFII. После этого скрининга выбирали и наращивали 6 пулов клонов. Выбирали три пула лучше всего продуцирующих клонов для клонирования ограниченным разведением. Выбирали двадцать восемь клонов, происходящих из всех трех пулов, и увеличивали их объем после первоначального протромбиназного скрининга. После второго скрининга выбирали восемь клонов и увеличивали их объем. Для подтверждения экспрессии VKOR в одном клоне из каждого клонированного пула проводили анализы Taqman. Во всех трех лучших выбранных клонах, M3F6, Р4А4 и O3G3, определяли мРНК VKOR. Для оценки продуктивности rhFII для клонов P1E2/VKOR по сравнению с родительским клоном Р1Е2 проводили три серии шейкерных или спин-культур.

Для подтверждения экспрессии VKOR в одном клоне из каждого клонированного пула проводили анализы Taqman. Во всех трех лучших выбранных клонах, M3F6, Р4А4 и O3G3, определяли мРНК VKOR. В силу процедур селекции и скрининга, использованных для получения этих клонов, считается, что они экспрессируют оптимальный уровень VKOR. Этот оптимальный уровень экспрессии дополнительно охарактеризован в Примере 5.

Родительскую линию клеток Р1Е2, не содержащую конструкта VKOR, выращивали параллельно при тех же самых условиях, что и контроль.

Результаты экспериментов по культивированию показали, что количество и доля активного rhFII варьировала при разных условиях культивирования, но для большинства серий количество полностью активного продуцированного rhFII было большим для новых клонов P1E2/VKOR, чем для исходной линии клеток Р1Е2.

Пример 5

Установление оптимальных соотношений экспрессии мРНК

Матричную РНК, полученную из линий клеток в Примере 4 и 5, анализировали ПЦР в реальном времени аналогично Примеру 3. Для GGCX и VKOR использовали те же самые олигонуклеотиды, что и в Примере 3.

Олигонуклеотиды для протромбина представляли собой следующее:

5' TGGAGGACAAAACCGAAAGAGA 3' прямой праймер (SEQ ID NO:17)

5' CATCCGAGCCCTCCACAA 3' обратный праймер (SEQ ID NO:18)

5' CTCCTGGAATCCTACATCGACGGGC 3' зонд (SEQ ID NO:19)

Таблица 9
Анализы соотношений мРНК при пиковой экспрессии человеческого протромбина (rhFII)
Линия клеток	Соотношение мРНК FII/GGCX	Соотношение мРНК FII/VKOR	Соотношение мРНК VKOR/GGCX	Лучшая полученная продуктивность* (активный rhFII мг/л)
A3F4	5	13	0,4	27,6
В9А12	86	32	3	27,4
В11Е8	29	33	0,9	27,4
M3F6	304	15	20	74,7
O3G3	218	17	13	76,8
Р4А4	255	128	2	64,2
Р1Е2 (контроль без VKOR)	221	VKOR не определяется	VKOR не определяется	48,4
* Измерение продуктивности, проведенное при аналогичных условиях в спин-колбах или шейкерных колбах

Результаты в таблице 9 показывают, что существует оптимальный уровень экспрессии GGCX и VKOR по отношению к выработанному -карбоксилированному белку. Клоны M3F4, O3G3 и Р4А4 получали трансфекцией Р1Е2 (полученного ранее трансфекцией конструктом, содержащим rhFII+GGCX) конструктом, содержащим VKOR, под контролем сильного промотора CMV. Скрининг проводили анализом, специфически определяющим клоны с улучшенной продуктивностью полностью активного rhFII. Таким образом, выбрали клоны с оптимальным уровнем экспрессии VKOR по отношению к rhFII и GGCX.

Матричную РНК, полученную из линий клеток в Примерах 4 и 5, анализировали ПЦР в реальном времени аналогично Примеру 3. Все анализы включали контрольную реакцию с GAPDH, как и в Примере 3.