способ прогнозирования церебральных поражений у новорожденных

Формула изобретения

Способ прогнозирования церебральных поражений у новорожденных, включающий исследование биологического материала, отличающийся тем, что в пятипроцентном экстракте из ткани плаценты определяют содержание аргинина и гистидина, вычисляют их соотношение и при его величине ниже 0,86 прогнозируют развитие у новорожденного церебральных поражений.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и перинатологии, и может быть использовано для прогнозирования поражений центральной нервной системы новорожденного.

Перинатальное поражение мозга занимает ведущее место в структуре заболеваемости и детской смертности, что обусловлено прогрессирующим ростом частоты церебральных нарушений у новорожденных, ведущей их ролью в формировании инвалидности с детства. В связи с этим данная проблема выходит за рамки медико-биологической и приобретает также социальное значение (Барашнев Ю.М. Гипоксическая энцефалопатия: гипотезы патогенеза церебральных расстройств и поиск методов лекарственной терапии //Росс. Вестник перинат. и педиат. 2002. - № 1. - С.6-13).

Пренатальные факторы, приводящие к поражению мозга новорожденного, могут быть различными: заболевания, перенесенные женщиной в течение беременности, перинатальные инфекции, иммунологический дисбаланс, метаболические нарушения в организме матери. Однако ведущую роль среди них играет внутриутробная гипоксия, сопровождающая многие осложнения беременности. Несмотря на достигнутые успехи сохраняются определенные трудности в точной и объективной диагностике и особенно прогнозировании перинатального поражения мозга.

Таким образом, существует необходимость разработки новых методов прогнозирования церебральных повреждений новорожденного с целью своевременного проведения адекватной патогенетической терапии, способствующей снижению частоты манифестации и тяжести течения церебральной патологии.

Среди известных в научно-медицинской и патентной литературе методов диагностики мозговых повреждений можно отметить электроэнцефалографию плода в момент родов, однако точность этой диагностики весьма невысока в связи с морфофункциональной незрелостью мозговых структур и большой изменчивостью биоэлектрической активности мозга плода (Барашнев Ю.И., Бубнова Н.И., Сорокина З.Х. и др. Перинатальная патология головного мозга: предел безопасности, ближайший и отдаленный прогноз // Рос. вести. перинатол. и педиатр. - 1998. - № 4. - С.6-12). Данные о диагностической ценности определения уровня -фетопротеина в околоплодных водах с указанной целью касаются, в основном, пороков развития нервной трубки (В.И.Орлов и соавт. Околоплодные воды. - 1998. - С.215). Достаточно точным, однако весьма травматичным, является метод определения нейронспецифического пептида - гомокарнозина в околоплодных водах, взятых в процессе беременности путем амниоцентеза (Модху М. Гомокарнозин околоплодных вод и его значение в диагностике повреждения мозга плода. - Автореф. дисс. канд. мед. наук. 1990. - 19 с.). Травматичной является и диагностика перинатального поражения ЦНС путем определения интенсивности процессов перекисного окисления липидов в крови ребенка на 3 и 6 сутки жизни (Лагодина Н.Н. Ранняя диагностика и превентивная терапия перинатального поражения ЦНС у детей. Ростов-на-Дону. - Автореф. дисс. канд. мед. наук. 1998. - 22 с.).

Известен способ прогнозирования нарушений здоровья детей с перинатальными повреждениями ЦНС на первом году жизни по исследованию пуповинной крови, отличающийся тем, что определяют относительное содержание теофилинчувствительных клеток и при их содержании 9% и более прогнозируют сохранение неврологической симптоматики к концу первого года жизни (патент РФ № 2121682, 1998). К недостаткам данного способа относится неспецифичность - изменение Т-звена иммунной системы имеет место и при других патологических состояниях.

В патенте РФ № 2148262 (1999) предложен способ диагностики гипоксического поражения ЦНС у новорожденных с помощью определения содержания МДА в ликворе ребенка на 2-е и 6-е сутки жизни. При повышении этого показателя на 2-е сутки свыше 0,72 мкмоль/л и на 6-е сутки в 2 раза по сравнению с нормой диагностируют прогрессирование патологического процесса в тканях мозга. Данный способ травматичен, т.к. для его выполнения необходимо взятие ликвора у ребенка в период новорожденности, что может привести к тяжелым последствиям.

Известен способ прогнозирования энцефалопатии у новорожденных (патент РФ № 2157534, 1999), по которому в пуповинной крови определяют антигены локусов А, В, DR системы HLA, и при наличии одного из антигенов А32, В8, В27, DR3 или их сочетания прогнозируют перинатальную гипоксически-ишемическую энцефалопатию. Способ трудоемок и недостаточно специфичный - наличие разных локусов HLA-системы наблюдается при различных заболеваниях, в том числе системных.

В патенте РФ № 2254573 (2005) предложен способ прогнозирования энцефалопатии новорожденного путем определения активности НАДФН-оксидазы в гомогенатах плаценты. Увеличение активности этого фермента до 13,5 ед. оптической плотности и выше позволяет прогнозировать развитие энцефалопатии у новорожденного. Недостатком данного способа является его недостаточная специфичность. Предложенный в этом способе фермент, активность которого определяется в диагностических целях, во-первых, не отражает состояние плацентарного кровотока и гемодинамики, нарушение которых является первостепенной причиной гипоксически-ишемических повреждений мозга плода и новорожденного. Во-вторых, нарушения энергетического обмена, способные привести к серьезной модификации биохимических процессов в мозге, связаны прежде всего с реакциями окислительного фосфорилирования и обменом макроэргов, а уже затем соотношением НАДФН и НАДФ (Дубченко A.M., Лукьянова Л.Д. Триггерная роль энергетического обмена в каскаде функционально-метаболических нарушений при гипоксии. //Проблемы гипоксии: молекулярные, физиологические и медицинские аспекты. - М. 2004. - С.51-84).

Еще одним способом ранней диагностики перинатального поражения ЦНС у новорожденных является определение концентрации МДА в амниотической жидкости (патент РФ № 2289136, 2005), и при повышении этого показателя более 4,50 мкмоль/л диагностируют перинатальное поражение ЦНС. Однако данный способ неспецифичен, поскольку повышение уровня МДА в околоплодных водах может приводить не только к поражению ЦНС, но и к кардиопатии новорожденного и нарушению функций щитовидной железы (В.И.Орлов и соавт. Околоплодные воды.-1998. - 215 с.). Поэтому этот способ может быть использован только в скрининговом обследовании.

Аналогичные недостатки характерны и для способа диагностики последствий перинатального поражения ЦНС легкой степени по патенту РФ № 2312351 (2006), где в качестве диагностического теста предложен суммарный уровень антител в сыворотке крови у детей. Данный показатель также не специфичен по отношению к церебральным повреждениям и может, в частности, повышаться при аутоиммунных заболеваниях у детей (Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Шергин С.М. Биохимия окислительного стресса. Оксиданты и антиоксиданты. Новосибирск. - 1994. - 203 с.).

Известен способ диагностики последствий перинатальных поражений ЦНС легкой степени (патент № 2339043, 2007) путем оценки уровня ИЛ-1 в сыворотке крови. В этом способе не прогнозируется развитие поражений ЦНС у новорожденного, а диагностируются уже возникшие последствия, в связи с чем невозможно своевременное проведение патогенетической терапии до возникновения необратимых осложнений.

Таким образом, основными недостатками вышеуказанных способов прогнозирования и диагностики церебральных нарушений новорожденных являются: в одних случаях - травматичность, в других - неспецифичность или трудоемкость, в ряде случаев - необходимость использования дорогостоящей аппаратуры для выполнения анализа.

Прототипом заявляемого изобретения выбран способ прогнозирования патологии ЦНС у новорожденных (патент № 2317043, 2008).

Сущность способа-прототипа состоит в том, что в пуповинной крови новорожденного определяют уровень эндотелина, а на шестые сутки проводят допплерометрическое исследование среднемозговой артерии, и если уровень эндотелина составляет 8,14 пкг/мл и более, индекс резистентности равен 0,73 и более, прогнозируют развитие неврологической симптоматики у данного ребенка в первые 3 месяца жизни.

Данный способ имеет ряд недостатков:

1. Невозможность прогнозирования неврологических нарушений у новорожденного сразу после родов (допплерометрия проводится лишь на 6 сутки).

2. Способ недостаточно специфичен - изменение уровня эндотелина в пуповиной крови отражает лишь одну составляющую сложного процесса регуляции тонуса кровеносных сосудов. Эффект этого вазоконстриктора может снижаться за счет противоположного действия чрезвычайно активных вазодилататоров и прежде всего оксида азота (Реутов В.П. Цикл окиси азота в организме млекопитающих // Успехи биол. химии. - 1995. - Т.35. - С.189-228).

3. Метод трудоемок, его осуществление требует дорогостоящей аппаратуры и импортных наборов реагентов для иммуноферментного анализа, что затрудняет его широкое применение в клинической практике.

4. Определенную погрешность в результаты допплерометрических изменений может внести чрезвычайная лабильность сосудистых реакций новорожденного и выраженная стадийность течения гипоксических поражений ЦНС (смена вазоспазмов и вазодилатации) в этот период.

Указанные недостатки предлагается устранить в заявляемом способе. Задачей заявляемого способа является разработка нетрудоемкого специфического способа, позволяющего с высокой точностью прогнозировать церебральные повреждения у новорожденного.

Поставленная задача решается следующим образом: после отделения плаценты (на заключительной стадии родов) берут навеску ее ткани, готовят 5%-ный экстракт, в котором определяют содержание аргинина и гистидина, вычисляют соотношение первого ко второму и при величине их отношения ниже 0,86 прогнозируют развитие церебральных поражений у новорожденных.

Технический результат, получаемый в ходе использования изобретения, состоит в повышении точности прогнозирования развития церебральных поражений у новорожденного, что позволяет назначать в раннем неонатальном периоде адекватную патогенетическую терапию.

Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается прогнозировать церебральные поражения у новорожденного как в раннем неонатальном периоде, так и в случае отсроченного их развития по однократному определению в плаценте соотношения содержания аргинина и гистидина.

Биохимические и, как следствие, функциональные изменения в плаценте (плацентарная недостаточность) являются главным пусковым механизмом в развитии нарушений ее гемодинамики и плодово-материнского кровообращения, сопровождающихся внутриутробной гипоксией плода (Савельева Г.М. и соавт., Плацентарная недостаточность М.: «Медицина». - 1991. - 276 с.). Последняя, в свою очередь, способна приводить к развитию церебральных повреждений плода и в последствии новорожденного ребенка.

В настоящее время установлено, что автономный контроль плацентарного кровотока обеспечивается конкурирующим влиянием вазоактивных соединений - сигнальных молекул, вырабатываемых местно, в самой плаценте. К числу последних относится оксид азота (NO), обладающий чрезвычайно широким спектром действия. Он является не только мощным вазодилататором, но и нейротрансмитером (Snyder S.H. //Science. - 1992. - vol. 257. P.494-496), контролирует агрегацию тромбоцитов к эндотелию, регулирует кислородтранспортные процессы (Марков Х.М. //Успехи физиологических наук. - 1996. - Т. 27. - № 4, С.30-43). Однако NO - короткоживущая молекула: в разных тканях существует от долей до нескольких секунд, а его метаболиты дают неполное представление о возможных эффектах оксида азота. Как известно, основным источником синтеза NO является аминокислота аргинин (Северин Е.С., Биохимия. М.: ГЭОТАР-МЕД. 2003, С.181-188), содержание которого позволяет судить о динамике NO. Кроме того, аргинин участвует в регуляции многих физиологических процессов.

Аргинин используется в тканях как строительный и энергетический материал, а также функционирует как самостоятельная сигнальная молекула. Он участвует в коммуникации между нервными клетками (Дмитриенко Н.П., Кишко Т.О., Шандаренко С.Г. Укр. химиотерапевт. журнал. - № 1. - 2008. - С.137-140).

Важной аминокислотой, синтезируемой в плаценте и также выполняющей многочисленные функции, является гистидин, имидазольное кольцо которого расширяет его участие в биохимических реакциях. Образование макроэргических производных имидазола может влиять на тканевой энергетический пул. Продукт декарбоксилирования гистидина - гистамин оказывает противоположный оксиду азота сосудосуживающий эффект, влияя на тонус плацентарных сосудов и, следовательно, интенсивность кровообращения. Одновременное определение в плаценте аминокислот с разнонаправленным влиянием на сосуды, их эндотелиальный компонент позволяют более объективно судить о состоянии плацентарного кровотока и обеспечении плода как кислородом, так и пластическими веществами, необходимыми для полноценного развития мозга плода, а затем и мозга новорожденного.

Нами установлен прогностический параметр развития перинатального поражения мозга по определению в 5%-ном экстракте плаценты соотношения аргинин/гистидин, при величине которого ниже 0,86 прогнозируют церебральные поражения новорожденного.

Способ осуществляется следующим образом.

Перед проведением биохимических исследований участки из центральной части плаценты отмывают от крови охлажденным физиологическим раствором, взвешивают 1 г ткани и проводят экстракцию аминокислот 10% раствором трихлоруксусной кислоты (в соотношении 1:5). Для осаждения белков смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость в количестве 0,1 мл наносят на полоску хроматографической бумаги (плотность 60-80), предварительно смоченную ацетатно-пиридиновым буферным раствором. Электрофорез аминокислот проводят в этом же буфере при рН- 5,2-5,4 в приборе для электрофореза (Институт физиологии им. А.А.Богомольца, Украина). Длительность электрофореза 2 часа при напряжении 120 в/см и силе тока 0,8 мA/см. По окончании электрофореза фореграммы фиксируют в сушильном шкафу при 90° в течение 10 мин и окрашивают 0,5% раствором нингидрина в ацетоне. Интенсивность окраски измеряют на спектрофотометре СФ-26 (Россия) при длине волны 530 нм. Расположение аргинина и гистидина на фореграммах идентифицируют по совпадению подвижности пятна - стандарта соответствующей аминокислоты с подвижностью пятна экстракта плаценты. Расчеты содержания аргинина и гистидина проводят по калибровочным графикам, составленным с использованием растворов стандартных аминокислот (ICN, Belgium).

Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами.

Пример 1. Беременная Я-ва, 25 лет. Ист. № 906. Пациентка состояла на диспансерном учете в женской консультации с 10 недель беременности. Беременность первая. Поступила в родильное отделение 7.10.2008 г. Диагноз: беременность 39 недель, фетоплацентарная недостаточность. Во втором триместре была установлена анемия, по этому поводу проводилось необходимое лечение. Первый период родов. 8.10.2008 г. родился доношенный ребенок, вес ребенка при рождении 3200 г, рост 51 см, оценка по шкале Апгар 8/8 баллов.

Исследование 5%-ного экстракта плаценты позволило установить, что отношение содержания аргинина и гистидина составило 0,85, что свидетельствовало о возможности развития патологии ЦНС у новорожденного. Ребенок был выписан из роддома на 6 сутки в удовлетворительном состоянии. Однако в возрасте 2 месяцев при осмотре невропатологом у ребенка выявлены общее двигательное беспокойство, тремор конечностей, мышечная дистония, рефлексы быстро угасают. Клиническая картина была оценена как перинатальное гипоксически-ишемическое поражение ЦНС.

Таким образом, прогноз, осуществленный по заявляемому способу, подтвердился.

Пример 2. Беременная З-ва, 29 лет. Ист. № 793. Состояла на диспансерном учете в женской консультации с 9 недель беременности. Настоящая беременность первая. Поступила в родильное отделение 4.08.2008 г. Диагноз: беременность 39-40 недель, поздний гестоз, фетоплацентарная недостаточность. Первый период родов. 5.08.2008 г. произошли срочные спонтанные роды. Вес ребенка при рождении 3300 г, рост 52 см, оценка по шкале Апгар 7/8 баллов. При исследовании 5% экстракта плаценты отношение содержания аргинина и гистидина составило 0,80, что позволило прогнозировать развитие перинатального поражения ЦНС. С первых суток жизни у новорожденного отмечалось беспокойство, тремор конечностей, мышечный гипертонус, ослабление сосания, оживление рефлексов. С диагнозом гипоксически-ишемическое поражение ЦНС ребенок был переведен в отделение патологии новорожденных.

Таким образом, прогноз, осуществленный по заявляемому способу, подтвердился.

Пример 3. Беременная Д-на, 28 лет. Ист. № 849. Беременность первая. Пациентка состояла на диспансерном учете в женской консультации с 9 недель беременности. Поступила в родильное отделение 24.09.2008 г. с диагнозом беременность 39-40 недель, ранний гестоз, пиелонефрит. 25.09.2008 г. родился доношенный ребенок, вес ребенка при рождении 3250 г, рост 52 см, оценка по шкале Апгар 8/8 баллов. Состояние при рождении удовлетворительное. При исследовании 5%-ного экстракта плаценты величина соотношения содержания аргинина и гистидина составило 0,86, что указывало на отсутствие риска развития поражения ЦНС у новорожденного. Ребенок был выписан на 6 сутки в удовлетворительном состоянии. Последующие осмотры невропатолога в 2 месяца и 6 месяцев не выявили неврологической патологии.

Таким образом, прогноз по заявляемому способу подтвердился.

По заявляемому способу нами обследовано 102 женщины, у которых в 5%-ном экстракте плаценты определено содержание аргинина и гистидина и рассчитан коэффициент соотношения этих аминокислот. Из обследованных родильниц у 39 соотношение аргинина к гистидину было ниже 0,86, а у 63 - 0,86 и выше. У 38 детей, в плаценте матерей которых изученный показатель ниже 0,86, было выявлено поражение ЦНС, и лишь у одного ребенка из этой группы церебральные поражения ЦНС в течение 6 месяцев наблюдения отсутствовали. Все дети, родившиеся у женщин с плацентарным отношением аргинина к гистидину 0,86 и выше, не имели неврологической симптоматики ни при рождении, ни в последующие периоды постнатального развития (до 6 месяцев). Данные исследования приведены в таблице.

Таблица
Показатель	Количество обследованных
Всего женщин	102
Истинно положительный результат	38
Ложноположительный результат	1
Истинно отрицательный результат	63
Ложноотрицательный результат	0

Из приведенных данных следует, что точность и специфичность способа - 99%.

Вышеизложенное подтверждает прогностическую ценность заявляемого метода.

Таким образом, заявляемый способ более эффективен по сравнению с известными и обладает рядом преимуществ:

1. Высокая точность - 99%, специфичность - 99%.

2. Неинвазивность.

3. Однократность проведения исследования.

4. Доступность применения способа в широкой клинической практике.

5. Возможность прогнозирования перинатального поражения мозга новорожденного и своевременного проведения превентивной терапии этой патологии.

Заявляемый способ прогнозирования церебральных повреждений у новорожденных позволяет своевременно проводить превентивную терапию с целью снижения риска возникновения необратимых осложнений и может широко использоваться в клинической практике.