способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических пестицидов в крови

Формула изобретения

Способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических пестицидов в крови, включающий экстракцию пестицидов из крови n-гексаном, очистку от соэкстративных веществ концентрированной серной кислотой, концентрирование n-гексанового экстракта, отличающийся тем, что для исследования берут 5-7 см³ крови и предварительно перед экстракцией пробу обрабатывают 2 см³ 60% серной кислоты, экстракцию проводят 30 см³ n-гексана однократно и перед газохроматографическим исследованием n-гексановый экстракт однократно обрабатывают 10 см³ концентрированной серной кислоты.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к экологии человека, и может быть использовано для ранней диагностики токсических воздействий хлорорганическими пестицидами малой интенсивности и контроля при детоксикационном лечении больных с патологией пищеварительной системы, осложненной воздействием этих веществ.

Хлорорганические пестициды ( -, -, -ГХЦГ) являются наиболее опасными для здоровья человека химическими факторами антропогенного происхождения, представляя несомненную медико-экологическую проблему с высоким риском поступления этих веществ в организм человека, биокумуляции, развития обусловленной патологии и влияния на общую заболеваемость населения сельскохозяйственных регионов. При отсутствии специфического механизма воздействия хлорорганических пестицидов на развитие и течение заболеваний особую диагностическую ценность приобретают экспозиционные тесты в биологических средах. Вместе с тем большая потенциальная возможность использования крови как биообъекта для оценки уровня биологического носительства пестицидов не нашла достаточного обеспечения в методическом плане.

Известен газохроматографический способ определения микроколичеств пестицидов различного химического строения (хлорорганических, фосфорорганических пестицидов, карбаматов и др.) в биологических жидкостях человека [1].

Недостатком данного способа является многоэтапность, затрата значительного количества времени для подготовки пробы к газохроматографическому определению пестицидов, а также недостаточная селективность.

Описанный способ количественного определения хлорорганических пестицидов в сыворотке крови [2] включает экстракцию смесью n-гексана и ацетона (9:1), очистку экстракта на колонке с оксидом алюминия и анализ на газожидкостном хроматографе. Метод трудоемок, возможны потери на этапе очистки экстракта на колонке.

Основным недостатком способа является тот факт, что используют сыворотку крови, а не цельную кровь, т.к. значительное количество пестицидов сорбируется на эритроцитах.

За ближайший аналог принят способ, в основу которого положены принципы определения галогенопроизводных алициклических углеводородов в биологических средах [3], а именно газохроматографическое определение хлорорганических пестицидов в крови путем трехкратной экстракции порциями по 5 см³ n-гексаном в течение 30 минут, двукратной обработки экстракта концентрированной серной кислотой по 5 см³ в течение 10 мин и последующим аналитическим определением на газожидкостном хроматографе.

Недостатком данного способа является малый объем биоматериала для определения микроколичеств исследуемых пестицидов, неполная экстракция n-гексаном связанных с липидами и белками пестицидов, а также длительность анализа из-за многократности этапов экстракции и очистки экстракта серной кислотой.

Технической задачей, на решение которой направлено предполагаемое изобретение, является разработка более достоверного и ускоренного способа подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических пестицидов в крови.

Существенная новизна изобретения состоит в том, что для исследования берут 5-7 см крови и предварительно перед экстракцией пробу обрабатывают 2 см³ 60% серной кислоты, экстракцию проводят 30 см ³ n-гексана однократно и перед газохроматографическим исследованием n-гексановый экстракт однократно обрабатывают 10 см³ концентрированной серной кислоты.

Техническим результатом использования способа является повышение достоверности результатов выявления содержания хлорорганических пестицидов в крови и сокращение продолжительности анализа за счет того, что для исследования берут 5-7 см³ крови и предварительно перед экстракцией пробу обрабатывают 2 см³ 60% серной кислоты, экстракцию проводят 30 см³ n-гексана однократно и перед газохроматографическим исследованием n-гексановый экстракт однократно обрабатывают 10 см концентрированной серной кислоты.

Способ осуществляется следующим образом: 5-7 см ³ крови помещают во флаконы с широким горлом и притертой пробкой, туда же добавляют по 2 см³ 60% серной кислоты, растирают в течение 10 мин. После чего осуществляют экстракцию пестицидов путем обработки 30 см³ n-гексана однократно в закрытом флаконе при постоянном встряхивании на аппарате в течение 30 мин затем n-гексановый экстракт отделяют и проводят однократно очистку от соэкстрактивных веществ 10 см³ концентрированной серной кислоты в течение 30 мин при встряхивании. Очищенный n-гексановый слой отделяют от кислоты и проводят концентрирование в испарителе до 1,5 см³. В хроматограф вводят по 5 мкл. Режим хроматографирования соответствует описанному в ближайшем аналоге.

Апробацию способа осуществляли у 14 больных хроническими заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки (гастритом, гастродуоденитом), имеющих в процессе профессиональной деятельности контакт с хлорорганическими пестицидами (6 мужчин, 8 женщин в возрасте от 35 до 47 лет).

Параллельно в одном и том образце крови проводили определение - и -ГХЦГ предлагаемым способом и способом, описанным в аналоге. Результаты исследований представлены в таблице.

Таблица
Показатели содержания пестицидов в крови при определении предлагаемым способом (I) и способом, описанным в ближайшем аналоге (II)
Наименование пестицида	Концентрация в крови, мг/дм3
I	II
-ГХЦГ	0,0098±0,0011	0,0052±0,0013	р 0,05
-ГХЦГ	0,0199±0,0015	0,0128±0,0014	р 0,05

Установлено, что при использовании предлагаемого способа подготовки пробы крови для газохроматографического определения выявляемость содержания -ГХЦГ в 1,75 раза, а -ГХЦГ в 1,55 раза выше по сравнению с аналогом. Время подготовки пробы до этапа концентрирования n-гексанового экстракта в испарителе при использовании предлагаемого способа составило 70 мин., а способа в аналоге - 140 мин, т.е. сократилось в 2 раза.

Пример. Больной Н., возраст 42 года, работник склада агрохимикатов. Поступил на стационарное лечение в РЦФХГ с диагнозом хронический гастродуоденит, хронический гепатит. В анамнезе контакт с хлорорганическими пестицидами на протяжении 8 лет. Назначено определение содержания - и -ГХЦГ в крови. Для чего произвели забор венозной крови в объеме 5 см³, поместили образец во флакон с широким горлом и притертой пробкой, туда же добавили 2 см³ 60% серной кислоты, растирали стеклянной палочкой в течение 10 мин. После чего провели экстракцию пестицидов из образца путем обработки 30 см ³ n-гексана в закрытом флаконе при постоянном встряхивании на аппарате в течение 30 мин, затем n-гексановый экстракт отделили и провели однократно очистку от соэкстрактивных веществ 10 см³ концентрированной серной кислоты в течение 30 минут при встряхивании. Очищенный n-гексановый слой отделили от кислоты и провели концентрирование экстракта в ротационном испарителе до 1,5 см³. В хроматограф ввели с помощью микрошприца 5 мкл. Режим хроматографирования соответствовал описанному в аналоге. Рассчитанная концентрация исследуемых пестицидов в крови у обследованного пациента составила для -ГХЦГ 0,0089 мг/дм³, для -ГХЦГ 0,0135 мг/дм³. Время подготовки пробы крови до этапа концентрирования n-гексанового экстракта составило 70 мин.

На основании полученных результатов содержания хлорорганических пестицидов в крови больному Н. назначили детоксикационное лечение на основе пектина (пектин цитрусовый и пектин яблочный - «Медетопект»).

Использование предлагаемого способа представляется перспективным в плане своевременной диагностики хронической интоксикации хлорорганическими пестицидами, патогенетического обоснования, лечения и реабилитационных мероприятий при заболеваниях пищеварительной системы, осложненных воздействием этих факторов.

Источники информации

1. Александрова Л.Г. Определение микроколичеств пестицидов различного химического строения в биологических жидкостях человека. / Гигиена труда. - Киев, 1989. - вып.25. - С.127-131.

2. Minelli E.V. Quantitive method for the determination of organochlorine pesticides in serum / Anal. Toxicol. - 1996. - № 1. - P.23-26.

3. Клисенко М.А. Методы определения микроколичеств пестицидов. - М.: Колос. - 1977. - С.15, 19.