способ определения тритерпеновых сапонинов в растительном сырье и лекарственных препаратах

Формула изобретения

Способ определения тритерпеновых сапонинов в растительном сырье и лекарственных препаратах, включающий приготовление сапониносодержащей фракции, определение ее оптической плотности и расчет содержания сапонинов по предварительно построенному калибровочному графику, отличающийся тем, что для приготовления фракции в качестве растворителя используют смесь вода: аммиачный буфер 1:1, оптическую плотность определяют при =210 нм, а содержание сапонинов рассчитывают в пересчете на олеаноловую кислоту.

Описание изобретения к патенту

Способ определения тритерпеновых сапонинов в растительном сырье и лекарственных препаратах.

Изобретение относится к методам количественного определения действующих лекарственных веществ в растительном сырье и в получаемых из него препаратах и может быть использовано в химико-фармацевтической и пищевой областях промышленности.

Известны способы определения сапонинов методом колориметрии с использованием различных хромогенных реактивов - раствор хлорида железа, раствор фенилгидразина, пятихлористой сурьмы [Нагорная В.А., Жижина Р.Т., Карташов A.K. // Сахарная промышленность. 1966. № 8. С.39-43]. Однако окраска образующихся соединений неустойчива во времени, и результаты анализа плохо воспроизводимы.

Известен способ определения сапонинов в экстракте женьшеня (Патент РФ № 1480568 МПК G01N 33/68 от 30.11.1994 г), в котором полученные из сырья и лекарственных форм женьшеня извлечения, содержащие сапонины, смешивают с ванилином и серной кислотой и нагревают до получения пурпурно-красного окрашивания, затем полученный раствор спектрофотометрируют при =544 нм. В качестве стандартного образца используют спиртовой раствор витамина D₂.

Технический результат заключается в универсальности и экспрессности способа определения тритерпеновых сапонинов в растительном сырье и лекарственных препаратах.

Технический результат достигается тем, что в способе определения тритерпеновых сапонинов в растительном сырье и лекарственных препаратах, включающем приготовление сапониносодержащей фракции, определение ее оптической плотности и расчет содержания сапонинов по предварительно построенному калибровочному графику, согласно изобретению для приготовления фракции в качестве растворителя используют смесь вода - аммиачный буфер 1:1, оптическую плотность определяют при =210 нм, а содержание сапонинов рассчитывают в пересчете на олеаноловую кислоту.

Поскольку определение сапонинов спектрофотометрическими методами основано на поглощении электромагнитного излучения хромофорными группировками не всей молекулы сапонина, а только его агликона, в нашем случае - олеаноловой кислоты, предлагаемый нами способ предусматривает возможность определения количественного суммарного содержания индивидуальных сапонинов в анализируемом объекте в пересчете на олеаноловую кислоту - наиболее реакционноспособную часть молекулы, определяющую ее фармакологическую активность. Максимумы поглощения сапонинов и олеаноловой кислоты совпадают и являются стабильным в течение длительного времени (1 ч), что облегчает анализ и повышает степень надежности полученных результатов.

Сапонинсодержащую фракцию, полученную из растительного сырья или лекарственного препарата, растворяют в смеси вода - аммиачный буфер [Государственная фармакопея СССР: Вып.2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. - 11-е изд. - М.: Медицина, 1989 - 400 с.] (1:1), спектрофотометрируют при длине волны =210 нм, измеряют величину оптической плотности раствора сапонинов, рассчитывают содержание их во фракции по предварительно построенному калибровочному графику. Содержание сапонинов рассчитывается в пересчете на олеаноловую кислоту

Пример 1. Определение сапонинов в растительном сырье (корнеплоды сахарной свеклы).

1. Построение калибровочного графика.

Исходные растворы олеаноловой кислоты (Патент на изобретение № 2258709 от 28.06.2004 г. Способ получения олеаноловой кислоты) готовят растворением точной навески олеаноловой кислоты с последующим приготовлением серии рабочих растворов путем разбавления исходных до нужной концентрации аммиачным буфером исходя из соотношения водная фаза - буфер 1:1. Рабочий диапазон концентраций олеаноловой кислоты составляет 0.01-0.4 мг/мл. В качестве раствора сравнения используют смесь дистиллированная вода - аммиачный буфер (1:1). Спектрофотометрические измерения проводят с использованием спектрофотометра СФ-46. Используя раствор средней концентрации, снимают спектр поглощения в диапазоне длин волн 180-300 нм и устанавливают максимум поглощения олеаноловой кислоты ( =210 нм). В установленном максимуме поглощения получают градуировочную зависимость оптической плотности стандартных растворов олеаноловой кислоты от их концентрации. Уравнение градуировки D=11.84С-0.0044 (С - концентрация, мг/мл; D - оптическая плотность).

2. Приготовление испытуемого раствора.

Навеску полученной из растительного сырья (например, 250 г корнеплодов сахарной свеклы) сапонинсодержащей фракции, массой около 0,25 г (точная навеска), растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл в смеси вода - аммиачный буфер (1:1). Аликвоту полученного раствора объемом 1 мл помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят до метки вышеуказанной смесью (концентрация сапонинов около 0,08 мг/мл).

3. Проведение измерений и расчет содержания сапонинов. Полученный раствор спектрофотометрируют при =210 нм. В качестве раствора сравнения используют смесь дистиллированная вода - аммиачный буфер (1:1). Содержание тритерпеновых сапонинов в пересчете на олеаноловую кислоту рассчитывают по формуле:

Если оптическая плотность испытуемого раствора D=0,412, то содержание сапонинов в растворе в пересчете на олеаноловую кислоту составляет С=0,03648 мг/мл. С учетом средней молекулярной массы сапонинов 1000 г/моль содержание сапонинов в растворе составило 0,08 мг/мл, в полученной фракции - 80%.

Полученные данные хорошо коррелируют с данными по определению сапонинов по известной методике [Нагорная В.А., Жижина Р.Т., Карташов А.К.//Сахарная промышленность. 1966. № 8. С.39-43]. Относительная ошибка определения в случае анализа растительного сырья не превышает ±6%.

Пример 2. Определение сапонинов в таблетках «Сапарал».

1. Построение градуировочного графика аналогично примеру 1.

2. Приготовление испытуемого раствора.

Навеску растертых таблеток около 0,15 г (точная навеска) растворяют в смеси аммиачный буфер - вода 1:1 в мерной колбе вместимостью 50 мл. Аликвоту полученного раствора объемом 1 мл помещают в колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки вышеуказанной смесью.

3. Проведение измерений и расчет содержания сапонинов.

Раствор спектрофотометрируют - при =210 нм, значение оптической плотности составляет 0,501. Содержание сапонинов пересчете на агликон рассчитывают по вышеприведенной формуле, в испытуемом растворе оно составляет 0,0427 мг/мл. Используя значение их средней молярной массы, учитывая разбавление и среднюю массу таблетки, получают содержание сапонинов - 0,039 г в одной таблетке. Ошибка определения сапонинов этим методом составляет ±3%, что укладывается в указанный в НД диапазон содержаний (0,036-0,044 г в одной таблетке, отн. погрешность ±10%).

Разработанный способ определения сапонинов не требует использования специфических реагентов, является экспрессным - время, необходимое для проведения анализа, составляет около 20 минут. Стабильность максимума поглощения позволяет при необходимости провести повторные измерения той же пробы. Предлагаемый способ пересчета содержания сапонинов на агликон является рациональным, так как позволяет оценить их количество в пересчете на реакционноспособную часть молекулы, определяющую ее химическую, фармакологическую и другие виды активностей.