способ иммунофлуоресцентного анализа маркеров множественной лекарственной резистентности в солидных опухолях человека

Формула изобретения

Способ иммунофлуоресцентного анализа маркеров множественной лекарственной резистентности в солидных опухолях человека, отличающийся тем, что из опухолевой ткани и культуры сравнения готовят одноклеточные суспензии, фиксируют их, инкубируют с первичными (к Pgp -клон 17F9; к MRP1 - клон MRP1m5) и вторичными антителами (F2772), дважды отмывают, анализ данных проводят на проточном цитофлуориметре; в качестве культур сравнения используют суспензионную культуру Т-лимфобластного лейкоза человека линии Jurkat и монослойную культуру рака шейки матки человека HeLa; рассчитывают значение D статистического теста Колмогорова-Смирнова, умножают на 100 и полученное число принимают за процент специфически окрашенных клеток; рассчитывают коэффициент уровня экспрессии Pgp и MRP1 в клетках исследуемых образцов по формуле

коэффициент уровня экспрессии= D_n·100/n,

где индекс n - количество (концентрация) антител;

D - значение статистического теста Колмогорова-Смирнова;

результаты делят на три группы по уровню экспрессии:

низкий уровень экспрессии (значение коэффициента уровня экспрессии от 0 до 10);

средний уровень экспрессии (значение коэффициента уровня экспрессии от 10 до 15);

высокий уровень экспрессии (значение коэффициента уровня экспрессии выше 15).

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам диагностики фенотипа множественной лекарственной резистентности, и позволяет количественно определять в солидных опухолях белки, ответственные за устойчивость к различным классам препаратов, широко применяемым для лечения онкологических заболеваний.

Врожденная или приобретенная множественная лекарственная резистентность проявляется в снижении терапевтического эффекта препаратов, относящихся к разным классам как по структуре, так и по применению. Спектр таких препаратов широк: к ним относятся противоопухолевые препараты (антрациклины, винкаалкалоиды, таксаны, подофилотоксины, камптотецины, актиномицин Д, митоксантрон, амскарин, топотекан и иринотекан, митрамицини, митомицин С), а также противовирусные средства (ритонавир, саквинавир).

Механизм такого рода устойчивости обусловлен экспрессией в опухолевой клетке транспортных белков, функциональная активность которых выражается в изоляции лекарства от его мишени путем внутриклеточного перераспределения и удаления препарата из клетки. Признанными маркерами множественной лекарственной резистентности являются транспортные белки Pgp (P-glycoprotein) и MRP1 (multidrug resistance protein 1). Pgp и MRP1 относятся к семейству АТФ-зависимых белков - АВС-транспортерам и широко представлены, в отличие от других белков данного семейства, как в нормальных, так и в опухолевых тканях человека. Экспрессия этих белков или кодирующих их генов коррелирует с чувствительностью опухоли к химиопрепаратам и прогнозом заболевания.

Известно, что экспрессию АВС-транспортеров, на основании которой прогнозируют чувствительность к химиотерапии и агрессивность течения некоторых злокачественных заболеваний, определяют способами обратной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуногистохимии. Первый фиксирует экспрессию в клетке мРНК гена, кодирующего АВС-транспортер, второй идентифицирует белок.

Однако факт присутствия в клетке мРНК, кодирующей транспортер, не означает, что с этой матрицы происходит трансляция белка. В клетке может присутствовать нетранслируемая мРНК, для инициации считывания которой необходим сигнал. Продемонстрирована регуляция образования белка Pgp на уровне стабилизации мРНК и инициации трансляции [Yague E., Armesilla A.L., Harrison G. et al. P-glycoprotein (MDR1) expression in leukemic cells is regulated at two distinct steps, mRNA stabilization and translational initiation. J. Biol. Chem. 2003; 278(12): 10344-10352]. Показано, что кратковременная инкубация опухолевых клеток с цитостатиком приводит к увеличению жизни РНК, при этом стабилизированная мРНК не транслируется. Продолжительная инкубация с препаратом приводит к снятию блока, инициации трансляции и образованию белка Pgp.Следствием этого является факт, что экспрессия мРНК выявляется в большем числе случаев, чем присутствие в клетке белка [Schwarzenbach H.A diagnostic tool for monitoring multidrug resistance expression in human tumor tissues. Anal. Biochem 2002; 308(1); 26-33].

Прототипом заявляемого способа является способ иммуногистохимического определения белков множественной лекарственной резистентности. Иммуногистохимия как микроскопический метод, идентифицирующий в клетке белок, позволяет дифференцировать экспрессию АВС-транспортеров именно в опухолевых клетках, а также характеризовать внутриклеточное распределение транспортных белков. Присутствие транспортных белков в опухоли оценивается визуально по положительной реакции окрашенных срезов ткани, то есть рассматриваемый способ оценки экспрессии АВС-транспортеров является качественным, то есть субъективным. В случае характеристики фенотипа множественной лекарственной резистентности методами иммуногистохимии по наличию в клетке транспортного белка возникают сложности из-за разной специфичности антител к различным белковым эпитопам, низкой специфичности антител и трудностей подбора адекватного положительного контроля. Наиболее подробно методические аспекты изучены в отношении Pgp, для выявления которого в каждой из исследуемых опухолей рекомендовано использовать не менее 2-3 антител к разным (внутренним и внешним) эпитопам Pgp, полученных от разных производителей [Beck W., Grogan Т., Willman С.et al. Methods to detect P-glycoprotein-associated multidrug resistance in patients^, tumors: consensus recommendations. Cancer Res 1996; 56: 13: 3010-3020].

Способ иммуногистохимического определения белков множественной лекарственной резистентности заключается в том, что: опухолевую ткань фиксируют и помещают ее в парафиновый блок, готовят срез ткани для окрашивания, депарафинизируют и обезвоживают ткань, проводят процесс восстановления антигена, инкубируют с Tween 20 для увеличения проницаемости клеточной мембраны, инкубируют с первичными антителами, инкубируют с вторичными антителами и дважды отмывают.

Недостатком прототипа является трудоемкость, которая ограничивает его применение в клинической практике и, как следствие, - противоречивость заключений об уровне экспрессии маркеров множественной лекарственной резистентности в солидных опухолях человека. Приведенные данные демонстрируют несоответствие результатов, полученных при помощи способов ПЦР и иммуногистохимии на примере немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), что относится ко всем изученным к настоящему времени солидным опухолям человека [Oka М., Fukuda M., Sakamoto A. et al. The clinical role of MDR1 gene expression in human lung cancer. Anticancer Res. 1997; 17: 721-724; Dingemans A.M., van Ark-Otte J., van der Valk P. et al. Expression of the human major vault protein LRP in human lung cancer samples and normal lung tissues. Ann. Oncol.1996; 7: 625-630; Wright S.R., Boag A.H., Valdimarsson G. et al. Immunohistochemical detection of multidrug resistance protein in human lung cancer and normal lung. Clin. Cancer Res. 1998; 4: 2279-2289; Wang J., Liu X., Jiang W. Expression of LRP, MRP and MDR1 in non-small-cell lung cancer and its clinical significance. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi 2000; 22:304-307].

Кроме того, способ иммуногистохимического определения белков множественной лекарственной резистентности требует значительной затраты времени на подготовку материала для исследования, при этом процесс фиксации, обезвоживания и депарафинизации ткани могут нарушать структуру многих белковых опухолевых маркеров, что снижает точность и специфичность анализа.

Заявляемый способ иммунофлуоресцентного анализа маркеров множественной лекарственной резистентности в солидных опухолях человека решает следующие задачи, возникающие в клинической практике:

1. Позволяет количественно (процент клеток и в каждой клетке) определять уровень экспрессии белков Pgp и MRP1 в фиксированной клеточной суспензии, избегая при этом немедленной (при получении образца) оценки данных параметров.

2. Сведение к минимуму «человеческого фактора» за счет использования ряда концентраций специфических антител для одного маркера.

3. Сокращение времени проведения исследования.

4. Повышение точности и специфичности анализа.

Для решения поставленных задач предложен способ иммунофлуоресцентного анализа маркеров множественной лекарственной резистентности в солидных опухолях человека путем окрашивания специфическими моноклональными антителами к Pgp и MRP1 клеточных суспензий из операционных опухолевых образцов ткани и культуры Jurkat (Т-лимфобластный лейкоз человека).

Заявленный способ осуществляется следующим образом:

готовят одноклеточную суспензию из опухолевой ткани, полученную суспензию фиксируют, инкубируют с Tween 20 для увеличения проницаемости клеточной мембраны, инкубируют с первичными антителами, инкубируют с вторичными антителами и дважды отмывают.

Приготовление одноклеточной суспензии культуры сравнения для Pgp

(Т-лимфобластный лейкоза человека линии Jurcat)

Клетки культивируют в среде RPMI-1640, содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки. Суспензию клеток центрифугируют в течение 10 минут при 1500 тыс.об/мин, осадок ресуспендируют в фосфатном буферном растворе рН 7,4. Количество клеток в полученной суспензии подсчитывают в камере Горяева и доводят до концентрации 700 тыс/мл путем разведения с дополнительным центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут или без него. Затем добавляют формальдегид до 4% конечной концентрации.

Приготовление одноклеточной суспензии культуры сравнения для MRP1 (рак шейки матки человека линии HeLa)

Для получения суспензии клеток HeLa из культурального матраца сливают питательную среду, дважды промывают монослой раствором фосфатного буфера рН 7,4, добавляют раствор Версена до покрытия клеток тонким слоем жидкости и помещают в термостат на 20 мин при t=37°C. Раствор Версена осторожно сливают, клетки снимают со дна матраца рабером, переносят в пробирку с раствором фосфатного буфера рН 7,4 и пипетируют до получения одноклеточной суспензии. Количество клеток в полученной суспензии подсчитывают в камере Горяева и доводят до концентрации 700 тыс/мл путем разведения без или с дополнительным центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут.Затем добавляют формальдегид до 4% конечной концентрации.

Приготовление одноклеточной суспензии из операционного материала солидных опухолей различных локализаций

Для получения суспензии клеток из хирургического биопсийного материала, опухолевую ткань разрезают ножницами на мелкие кусочки (объемом <1 мм³) и переносят в пластиковую центрифужную 15 мл пробирку. Затем добавляют в полученную кашицу раствор Версена так, чтобы покрыть ее тонким слоем, и инкубируют 20 минут в термостате при t=37°C. После инкубации в пробирку добавляют раствор фосфатного буфера рН 7,4 в количестве, в три раза превышающем объем измельченной опухолевой ткани, энергично встряхивают 15-30 сек и помещают пробирку в штатив. Через 2 мин, когда взвесь расслаивается, аккуратно извлекают пипеткой не содержащий клеток верхний слой и выбрасывают его. Также аккуратно отбирают средний слой, который представляет не содержащую кусочков опухолевой ткани суспензию клеток. К оставшемуся осадку неразбитых кусочков ткани добавляют раствор Версена так, чтобы покрыть его тонким слоем, помещают на 20 мин в термостат при t=37°C и далее повторяют описанные выше действия. Эту процедуру проводят 2-3 раза до полного перехода клеток в одноклеточную суспензию. Полученные на разных этапах суспензии переносят в одну пробирку и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 минут. Ресуспендируют осадок в 5 мл раствора фосфатного буфера рН 7,4. Количество клеток в полученной суспензии подсчитывают в камере Горяева и доводят до концентрации 700 тыс/мл путем разведения с дополнительным центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут или без него. Затем добавляют формальдегид до 4% конечной концентрации.

Окрашивание одноклеточных суспензий антителами к Pgp

Для определения Pgp используют мышиные моноклональные антитела фирмы BD Pharmingen, меченые FITC либо РЕ, клон 17F9. Данные антитела характеризуются специфичностью к внешнему эпитопу трансмембранного белка Pgp человека. В исследовании используют пять концентраций антител, выраженные в объемных единицах неразведенного коммерческого раствора: 0,5; 1; 2,5; 5 и 10 мкл на 100 мкл клеточной суспензии. В качестве изотипического контроля используют мышиные моноклональные антитела IgG2b, k, меченые FITC либо РЕ в эквивалентных специфическим антителам концентрациях.

В пластиковые пробирки для проточного цитофлуориметра к 100 мкл суспензии исследуемых клеток добавляют соответствующие разведения специфических и изотипических антител и инкубируют при t=4°C в течение 30 минут. После окончания инкубации для отмывания свободных антител в каждую пробирку добавляют по 2 мл фосфатного буферного раствора рН 7,4 и центрифугируют при 1500 тыс. об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отбирают вакуумным насосом и процедуру отмывки проводят повторно. Осадок ресуспендируют в 300 мкл фосфатного буферного раствора рН 7.4.

Окрашивание одноклеточных суспензий антителами к MRP1

Для определения MRP1 используют первичные мышиные моноклональные антитела MRPm5 (Abeam) и вторичные мышиные моноклональные антитела F2772 (Sigma), меченые FITC. Эти антитела характеризуются специфичностью к внутриклеточному эпитопу белка MRP1 человека. В исследовании используют четыре концентрации антител, 0,05; 0,125; 0,25 и 0,5 мкг на 100 мкл клеточной суспензии, что соответствует объемам 1; 2,5; 5 и 10 мкл, добавляемым к 100 мкл клеточной суспензии. В качестве изотипического контроля используют мышиные моноклональные антитела IgG2a в эквивалентных специфическим антителам концентрациях.

В пластиковые пробирки для проточного цитофлуориметра к 100 мкл суспензии исследуемых клеток с определенной концентрацией добавляют 100 мкл 0,5% Tween 20 и инкубируют при комнатной температуре 20 минут. После окончания инкубации в каждую пробирку добавляют по 2 мл фосфатного буферного раствора рН 7,4 и центрифугируют при 1500 тыс.об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отбирают вакуумным насосом и процедуру отмывки проводят повторно.

Затем в пробирки для проточного цитофлуориметра добавляют соответствующие разведения специфических и изотипических антител и инкубируют при t=4°C в течение 30 минут. После окончания инкубации для отмывания свободных антител в каждую пробирку добавляют по 2 мл фосфатного буферного раствора рН 7,4 и центрифугируют при 1500 тыс.об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отбирают вакуумным насосом и процедуру отмывки проводят повторно. Осадок ресуспендируют в 300 мкл фосфатного буферного раствора рН 7.4.

Измерение флуоресценции проводят на проточном цитофлуориметре при ех=488 нм, ем=576 нм. Число анализируемых событий 5 тысяч. Анализ гистограмм проводят по количеству специфически окрашенных клеток, которое оценивают статистическим методом Колмогорова-Смирнова.

Для оценки экспрессии белков Pgp и MRP1 используют значение D статистического теста Колмогорова-Смирнова, который отражает количество окрашенных клеток. Значение D рассчитывается по двум гистограммам, первая из которых является результатом измерения на проточном цитофлуориметре средней флуоресценции изотипического контроля, а вторая - аналогичного показателя после окрашивания специфическими антителами (одинаковой концентрации с изотипическими). Значение D умножают на 100 и полученное число принимают за процент специфически окрашенных клеток. На основании этих данных строят на графике кривую зависимости количества специфически окрашенных клеток от количества антител к каждому маркеру для культуры сравнения и для исследуемого образца опухолевой ткани (фиг.1). Кривая 1 (- -) - пример высокого уровня экспрессии маркера множественной лекарственной резистентности. Кривая 2 (- -) - пример среднего уровня экспрессии маркера множественной лекарственной резистентности. По оси абсцисс - количество антител в мкл. По оси ординат - количество (%) окрашенных клеток, рассчитанное при помощи теста Колмогорова-Смирнова.

Для определения различий в полученных кривых рассчитывают коэффициент уровня экспрессии, который позволяет выразить в виде суммы средних значений уровень экспрессии Pgp и MRP1 в клетках исследуемых образцов.

Формула для расчета коэффициента уровня экспрессии:

Коэффициент уровня экспрессии= D_n×100/n,

где индекс n - количество (концентрация) антител

D - значение статистического теста Колмогорова-Смирнова, полученное при наложении гистограммы, отражающей окраску специфическими антителами на гистограмму, отражающую окраску изотипическими антителами

Расчет коэффициента уровня экспрессии для произвольных кривых (фиг.1):

Кривая № 1

при количестве антител 2,5 мкл D_2,5 ×100=30; 30/2,5=12

при количестве антител 5,0 мкл D_5,0×100=60; 60/5,0=12

при количестве антител 10,0 мкл D_10,0×100=70; 70/10,0=7

Коэффициент уровня экспрессии=12+12+7=31

Кривая № 2

при количестве антител 2,5 мкл D_2,5 ×100=21; 17/2,5=6,8

при количестве антител 5,0 мкл D_5,0×100=29; 25/5,0=5,0

при количестве антител 10,0 мкл D_10,0×100=42; 30/10,0=3,0

Коэффициент уровня экспрессии=6,8+5,0+3,0=14,8

При анализе фенотипа множественной лекарственной резистентности результаты, полученные при расчете коэффициента уровня экспрессии, делят на три группы по уровню экспрессии:

низкий уровень экспрессии (значение коэффициента уровня экспрессии от 0 до 10); средний уровень экспрессии (значение коэффициента уровня экспрессии от 10 до 15); высокий уровень экспрессии (значение коэффициента уровня экспрессии выше 15).

Для оценки активности антител к Pgp и MRP1 используют в качестве культур сравнения соответственно клетки Jurkat и HeLa, в которых уровень экспрессии данных маркеров постоянный (фиг.2). На фиг 2 по оси абсцисс - интенсивность флуоресценции (усл.ед), по оси ординат - количество клеток. Закрашенные гистограммы - интенсивность флуоресценции после добавления изотипических антител, незакрашенные - после добавления специфических антител к Pgp в количестве 10 мкл на 100 мкл клеточной суспензии к клеткам Jurkat (фиг.2А) и MRP1 в концентрации 0,5 мкг на 100 мкл клеточной суспензии к клеткам HeLa (фиг.2Б). Количество (%) клеток Jurkat, окрашенных моноклональными антителами к Pgp и MRP1, рассчитанное при помощи теста Колмогорова-Смирнова, составляет соответственно 85 (фиг.2А) и 70% (фиг.2Б).

Технический результат изобретения заключается в том, что заявленный способ позволяет оценить в опухолевом материале степень выраженности фенотипа множественной лекарственной резистентности по уровню экспрессии: низкий, средний и высокий. Подготовка материала по заявленному способу исключает процедуры обезвоживания и депарафинизации ткани и возможность нарушить структуру многих белков, в том числе и маркеров множественной лекарственной резистентности. Способ занимает 2-4 часа и требует минимального количества манипуляций. Использование ряда концентраций антител существенно снижает возможность ошибки определения маркеров множественной лекарственной резистентности, позволяет более точно, в каждой клетке и во всей популяции клеток оценить уровень экспрессии белков, ассоциированных с множественной лекарственной резистентностью. Заявленный способ обладает высокой специфичностью и имеет доступную стоимость проведения анализа. Таким образом, высокая точность, надежность и быстрота определения маркеров множественной лекарственной резистентности делают пригодным заявленный способ для рутинного использования в клинической практике.