способ получения сыворотки для диагностики коксиеллеза крупного рогатого скота в реакции непрямой иммунофлуоресценции

Формула изобретения

Способ получения сыворотки для диагностики коксиеллеза крупного рогатого скота в реакции непрямой иммунофлуоресценции, включающий гипериммунизацию кроликов антигеном с предусмотренным по схеме введением иммуностимулятора левамизола в первый и четвертый день гипериммунизации, изучение динамики синтеза антител на 7, 14, 21 и 30 сут, обескровливание кроликов и получение сыворотки, отличающийся тем, что в качестве антигена используется инактивированный нагреванием +70° в течение 30 мин вакцинный штамм C.burnetii M-44.

Описание изобретения к патенту

Способ получения коксиеллезной сыворотки для реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) относится к методам лабораторной диагностики коксиеллеза (Ку-лихорадки) крупного рогатого скота и может быть использован в ветеринарной медицине.

Известны способы получения диагностических сывороток при бруцеллезе, лептоспирозе животных путем гипериммунизации кроликов, используемые для РНИФ, ранее описанные в рефератах российских патентных документов за 1994-2007 г.г. ( № № 2257581, 2005.07.27, 95117746, 1997.10.10).

Однако у известных способов присутствует ряд недостатков:

1. Длительные сроки гипериммунизации.

2. Невысокие титры образующихся в крови кроликов антител.

3. Низкая активность полученных сывороток.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является способ получения микоплазмозных сывороток для РНИФ путем гипериммунизации кроликов по схеме D.Shimmel (1967) в модификации Новиковой Н.Н. (2002), (Новикова Н.Н. Экспресс-методы диагностики ассоциативного урогенитального микоплазмоза плотоядных: дис... канд. вет. наук.: 16.00.03. / Н.Н.Новикова; - Новосибирск - 2002. - С.55-60), который проводится следующим образом:

1. Для гипериммунизации используются трехсуточные культуры микоплазм (M.fermentans, M.canis, M.laidlawii, U.urealyticum). Культуральную жидкость центрифугируют при 6 тыс.оборотах /мин в течение часа. Осадок после трехкратного ресуспендирования в физиологическом растворе и последующего центрифугирования доводят до концентрации 1,7 млрд микробных тел в 1 мл по бактериальному стандарту мутности.

2. Гипериммунизацию проводят на 12 кроликах (по 3 головы на каждый штамм) весом 2,5-3 кг. Суть гипериммунизации состоит в дробном внутривенном введении антигена кроликам каждые три дня с двукратным применением иммуностимулятора левамизола подкожно.

Таблица 1
Схема гипериммунизации кроликов культурами микоплазм
Время введения, сут	1	4	7	10	13	16	20	24
Доза антигена, млрд м.т.	0,85	1,7	1,7	1,7	3,4	3,4	3,4	3,4
Левамизол, мл	1	1	-	-	-	-	-	-

Динамику синтеза антител изучают на 7, 14, 21 и 30 сутки после первого введения антигена в реакции непрямой иммунофлуоресценции, которую ставят на предметных стеклах по стандартной методике, учет реакции проводят в крестах, свечение менее чем на два креста считают отрицательным. В качестве антигенов в РНИФ применяют 1 млрд взвеси микоплазм, инактивированных на водяной бане при 70°С - 30 мин. На 30-е сутки всех кроликов тотально обескровливают и получают микоплазмозные диагностические сыворотки.

Таблица 2
Динамика синтеза антител у кроликов, гипериммунизированных культурами
Сроки взятия крови (дни)	Титр антител
7-й день	1:40
14-й день	1:160
21-й день	1:320
30-й день	1:640

Наиболее высокий уровень антител регистрируется на 21-30 дни после гипериммунизации, который колеблется в пределах 1:320-1:640 соответственно (табл.2).

Цель нашего изобретения - получение коксиеллезной сыворотки для диагностики коксиеллеза крупного рогатого скота в реакции непрямой иммунофлуоресценции путем гипериммунизации кроликов.

Поставленная цель достигается при соблюдении ряда приемов:

1. Получение антигена из вакцины Ку-риккетсиозной сухой живой М-44 производства НИИЭиМ им. Н.Ф.Гамалеи.

2. Гипериммунизация кроликов путем дробного внутривенного введения антигена каждые три, четыре дня с применением иммуностимулятора левамизола.

Описание метода получения сыворотки:

Для гипериммунизации используется антиген, полученный из вакцинного штамма С.burnetii М-44. Вакцину разводили стандартным разбавителем и прогревали на водяной бане при +70° в течение 30 минут с целью инактивации возбудителя.

Затем стерильным физиологическим раствором доводили до концентрации 1,7×10⁹ микробных тел в 1 мл по ОСМ ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Гипериммунизацию проводили на 2 кроликах породы шиншилла весом 2,5-3 кг по схеме, указанной в таблице 3.

Титры антител учитывали на 7, 14, 21 и 30 сутки после введения антигена в РНИФ, антиген для которой готовили из этого же штамма и использовали после прогревания в водяной бане при 70°С в течение 30 мин в концентрации 0,85 млрд м.т., т.к. было установлено, что при данной концентрации антигена реакция более демонстративна. Из полученной гипериммунной сыворотки готовили ряд последовательных двукратных разведений на физиологическом растворе, начиная с 1:10. Разведения делали микродозатором в пластиковых планшетах.

Постановка РНИФ

Реакцию непрямой иммунофлуоресценции ставили по следующей методике. На чистые тщательно обезжиренные без царапин предметные стекла наносили параллельно друг другу несколько капель антигена. Антигены высушивали и фиксировали над пламенем спиртовки. Затем на каждую каплю антигена наносили равную по объему каплю сыворотки из каждого разведения, начиная с последнего. Одновременно ставили контроль:

1) антиген+сыворотка положительная;

2) антиген+сыворотка отрицательная;

3) антиген+физиологический раствор.

Стекла выдерживали во влажной камере при 37-38°С в течение 50-60 минут для образования комплекса антиген - антитело. После чего их промывали дистиллированной водой от не связавшихся антител, подсушивали и наносили в красящем титре (подобранном опытным путем) ослиный антикроличий глобулин, меченный ФИТЦ. Затем стекла помещали на 15-20 минут во влажную камеру при температуре 37-38°С. По истечении этого времени мазки промывали дистиллированной водой, просушивали и просматривали в люминесцентном микроскопе при увеличении ×1500.

Интенсивность свечения оценивали в крестах:

1) очень яркая люминесценция по периферии микробной клетки, четко контрастирующая с телом клетки - ++++;

2) яркая люминесцирующая периферия клетки - +++;

3) слабое свечение периферии клетки - ++ или +;

4) при отрицательной реакции люминесценция клеток отсутствует.

За положительный результат принимали яркое специфическое свечение контуров микробов в виде ободков с оценкой в 3 и 4 креста; сомнительные результаты оценивали в 2 креста при наличии слабого свечения контуров клеток.

При этом высокий уровень антител регистрировали на 30 сутки после начала гипериммунизации, который доходил до уровня 1:1280 (табл.4).

Таблица 4
Динамика синтеза антител у кроликов, гипериммунизированных коксиеллезным антигеном
Сроки взятия крови (дни)	Титр антител
1 кролик	2 кролик
7-й день	1:40	1:40
14-й день	1:160	1:320
21-й день	1:320	1:640
30-й день	1:1280	1:1280

Контроль на чувствительность, специфичность и активность коксиеллезной сыворотки в РНИФ.

Для изучения чувствительности, видовой специфичности и активности использовали кроличьи коксиеллезные сыворотки в разведениях: 1:10, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1280, 1:2560, 1:5120, коксиеллезный антиген, полученный вышеописанным способом и гетерологичные антигены (табл.5). Сыворотка, полученная путем гипериммунизации кроликов коксиеллезным антигеном, с разведениия 1:10 была строго специфична к коксиеллезному антигену с высоким уровнем активности антител в титре 1:1280.

Таблица 5
Чувствительность, специфичность и активность коксиеллезной кроличьей сыворотки в РНИФ
Антигены	Разведения коксиеллезной сыворотки
1:10	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320	1:320	1:640	1:1280	1:2560	1:5120
Коксиеллезный М-44	+	+	+	+	+	+	+	+	+	-	-
Микоплазмозный	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Бруцеллезный	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Хламидиозный	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Листериозный	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Лептоспирозный	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
ИРТ-ПВ	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Приемущество данного способа получения противококсиеллезной сыворотки в более высоких диагностических титрах антител и возможность использования полученной сыворотки для диагностики коксиеллеза крупного рогатого скота в РНИФ.