способ получения культуры клеток дальневосточных лососей

Формула изобретения

Способ получения культуры клеток дальневосточных лососей, характеризующийся тем, что в качестве материала для культивирования клеток берут плавники у молоди рыб, обрабатывают раствором Хенкса, содержащим 1 мкг/мл амфотерицина Б и 200 ед./мл гентамицина и центрифугируют, при этом обработку с центрифугированием осуществляют не менее 5 раз, а затем проводят механическое измельчение ткани до кусков размером 1 мм в среде DMEM с содержанием глюкозы не менее 4,5 г/л, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 ед./мл гентамицина и далее инкубируют в той же среде с добавлением 1 мг/мл коллагеназы 1 типа в течение 60 мин при температуре 18-20°С, затем коллагеназу отмывают путем двукратного центрифугирования, а осадок ресуспендируют средой DMEM с содержанием глюкозы 4,5 г/л, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 25 мМ Hepes, 40 ед./мл гентамицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина Б и 10 нг/мл человеческого рекомбинантного основного фактора роста фибробластов и помещают в культуральный флакон для инкубации при температуре 18°С, с заменой среды каждые 3-4 дня, и после достижения клетками монослоя осуществляют пересев, используя трипсин или смесь трипсин версен.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения культуры клеток дальневосточных лососей.

Известен способ получения эмбриональных клеток морского двустворчатого моллюска, где отдельные клетки получают диссоциацией эмбрионов 0,1%-ным раствором коллагеназы на искусственной морской воде без ионов Са²⁺ и Mg²⁺ при температуре 6-10°С. Этот способ приемлем для узкого круга клеток морских беспозвоночных животных (см. авторское свидетельство 1745767, C12N 5/00, 1992).

Известен способ получения культур клеток путем обработки органов ферментным препаратом коллагеназы, полученным из патогенного микроорганизма Clostridium histolyticum. Основным недостатком данного способа является то, что препарат клостридиальной коллагеназы, полученный из вышеуказанного микроорганизма, содержит значительное количество патогенных и пирогенных примесей, которые практически невозможно исключить при очистке любым известным способом, что отрицательно сказывается на проценте выхода живых клеток. Кроме того, клостридиальная коллагеназа не способна гидролизовать неколлагеновые белки, что необходимо для более полной дезагрегации тканей и органов и, как следствие, увеличения выхода живых клеток. Данная коллагеназа проявляет максимальную активность при температуре 37°С (заявка ФРГ № 3413960, MKИ C12N 5/00).

Известен способ получения культур клеток, включающий обработку тканей и органов раствором комплекса коллагенолитических ферментов, полученного из пищеварительных органов гидробионтов, согласно изобретению в качестве указанного комплекса используют комплекс, полученный из пищеварительных органов головоногих моллюсков, при концентрации комплекса по белку 0,01-0,4 мг/мл при температуре 0-18°С (патент РФ 2126832, C12N 5/00, 1997).

Однако до настоящего времени не получали культуру клеток лососей из плавников данного вида.

Технической задачей заявленного способа является получение клеток из плавников рыб и повышение выхода жизнеспособных клеток.

Поставленная задача решается в способе получения культуры клеток дальневосточных лососей, при котором в качестве материала для культивирования клеток берут плавники у молоди рыб, обрабатывают раствором Хенкса, содержащим 1 мкг/мл амфотерицина Б и 200 ед./мл гентамицина, и центрифугируют, при этом обработку с центрифугированием осуществляют не менее 5 раз, а затем проводят механическое измельчение ткани до кусков размером 1 мм в среде DMEM с содержанием глюкозы не менее 4,5 г/л, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 ед./мл гентамицина и далее инкубируют в той же среде с добавлением 1 мг/мл коллагеназы 1 типа в течение 60 мин при температуре 18-20°С, затем коллагеназу отмывают путем двукратного центрифугирования, а осадок ресуспендируют средой DMEM с содержанием глюкозы 4,5 г/л, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 25 мМ Hepes, 40 ед./мл гентамицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина Б и 10 нг/мл человеческого рекомбинантного основного фактора роста фибробластов и помещают в культуральный флакон для инкубации при температуре 18°С, с заменой среды каждые 3-4 дня, и после достижения клетками монослоя осуществляют пересев, используя трипсин или смесь трипсин версен.

На фиг.1. Мальки кеты (сверху) и горбуши (снизу), фиг.2. Миграция клеток из фрагмента хвостового плавника горбуши, фиг.3. Миграция клеток из фрагмента грудного плавника горбуши.

Получение культуры клеток

Молодь кеты и горбуши была доставлена с Соколовского завода (о.Сахалин). Икра была отложена в 2008 г. Размер кеты составлял около 35 мм при весе около 1 г. Размер горбуши около 20 мм при весе около 250 мг.

После полной остановки дыхания на воздухе мальков кратковременно (до 4 сек) обрабатывали 85%-ным этиловым спиртом, после чего переносили в условия стерильного ламинарного шкафа. С помощью стерильных хирургических инструментов отделяли либо хвостовой плавник, либо грудной, либо спинной. Фрагменты ткани размером несколько мм переносили в пробирки со стерильным раствором Хенкса, содержащим 1 мкг/мл амфотерицина Б и 200 ед./мл гентамицина. Пробирки с фрагментами центрифугировали 200g в течение 10 мин при 4°С, при этом обработку с центрифугированием осуществляли не менее 5 раз, с тем чтобы с большой вероятностью избавиться от контаминации бактериями или дрожжами, супернатант выбрасывали, а образцы переносили в новые стерильные пробирки. Для переноса использовали стерильные Пастеровские пипетки с широким носиком.

После последнего центрифугирования образцы с помощью стерильных Пастеровских пипеток переносили в чашки Петри диаметром 3 см, далее в среде DMEM с содержанием глюкозы не менее 4,5 г/л, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 ед./мл гентамицина, с помощью стерильных ножниц в условиях шкафа со стерильным протоком воздуха образцы измельчали до размера не более 1 мм.

После этого аккуратно отсасывали среду и заливали образцы той же средой с добавлением 1 мг/мл коллагеназы 1 типа и инкубировали при температуре 18-20°С в течение 60 мин, затем коллагеназу отмывали путем двукратного центрифугирования, а осадок ресуспендируют средой DMEM с содержанием глюкозы 4,5 г/л, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 25 мМ Hepes, 40 ед./мл гентамицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина Б и 10 нг/мл человеческого рекомбинантного основного фактора роста фибробластов и помещают в культуральный флакон для инкубации при температуре 18°С, с заменой среды каждые 3-4 дня, и после достижения клетками монослоя осуществляют пересев, используя трипсин или смесь трипсин версен.

Пример 1.

Берут молодь кеты, размер которой составляет около 35 мм при весе около 1 г, после полной остановки дыхания на воздухе мальков кратковременно (до 4 сек) обрабатывают 85%-ным этиловым спиртом, после чего переносят в условия стерильного ламинарного шкафа. Затем отделяют хвостовой плавник. Фрагменты ткани переносят в пробирки со стерильным раствором Хенкса, содержащим 1 мкг/мл амфотерицина Б и 200 ед./мл гентамицина. Пробирки с фрагментами центрифугировают 200g в течение 10 мин при 4°С, при этом обработку с центрифугированием осуществляют 5 раз, с тем чтобы избавиться от контаминации бактериями или дрожжами, супернатант выбрасывают, а образцы переносят в новые стерильные пробирки.

После последнего центрифугирования образцы с помощью стерильных Пастеровских пипеток переносят в чашки Петри диаметром 3 см, далее в среде DMEM с содержанием глюкозы не менее 4,5 г/л, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 ед./мл гентамицина, с помощью стерильных ножниц в условиях шкафа со стерильным протоком воздуха образцы измельчают до размера не более 1 мм.

После этого отсасывают среду и заливают образцы той же средой с добавлением 1 мг/мл коллагеназы 1 типа и инкубируют при температуре 20°С в течение 60 мин, затем коллагеназу отмывают путем двукратного центрифугирования, а осадок ресуспендируют средой DMEM с содержанием глюкозы 4,5 г/л, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 25 мМ Hepes, 40 ед./мл гентамицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина Б и 10 нг/мл человеческого рекомбинантного основного фактора роста фибробластов и помещают в культуральный флакон для инкубации при температуре 18°C, с заменой среды каждые 4 дня. После достижения клетками монослоя осуществляют пересев, используя трипсин.

Пример 2.

Берут молодь горбуши, размер которой составляет около 30 мм при весе около 0,8 г, после полной остановки дыхания на воздухе мальков кратковременно (до 4 сек) обрабатывают 85%-ным этиловым спиртом, после чего переносят в условия стерильного ламинарного шкафа. Затем отделяют спинной плавник. Фрагменты ткани переносят в пробирки со стерильным раствором Хенкса, содержащим 1 мкг/мл амфотерицина Б и 200 ед./мл гентамицина. Пробирки с фрагментами центрифугировают 200g в течение 10 мин при 4°С, при этом обработку с центрифугированием осуществляют 5 раз, с тем чтобы избавиться от контаминации бактериями или дрожжами, супернатант выбрасывают, а образцы переносят в новые стерильные пробирки.

После последнего центрифугирования образцы с помощью стерильных Пастеровских пипеток переносят в чашки Петри диаметром 3 см, далее в среде DMEM с содержанием глюкозы не менее 4,5 г/л, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 ед./мл гентамицина, с помощью стерильных ножниц в условиях шкафа со стерильным протоком воздуха образцы измельчают до размера 0,8 мм.

После этого отсасывают среду и заливают образцы той же средой с добавлением 1 мг/мл коллагеназы 1 типа и инкубируют при температуре 18°С в течение 60 мин, затем коллагеназу отмывают путем двукратного центрифугирования, а осадок ресуспендируют средой DMEM с содержанием глюкозы 4,5 г/л, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 25 мМ Hepes, 40 ед./мл гентамицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина Б и 10 нг/мл человеческого рекомбинантного основного фактора роста фибробластов и помещают в культуральный флакон для инкубации при температуре 18°С, с заменой среды каждые 3 дня. После достижения клетками монослоя осуществляют пересев, используя смесь трипсин версен.