эпитопы, индуцирующие гибель т-клеток

Формула изобретения

1. Выделенный пептид, предназначенный для получения антител, индуцирующих гибель активированных Т-клеток, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 20-23, содержащий эпитоп, представленный Х₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄, где

Х₁₁ представляет собой Pro,

X ₁₂ представляет собой Met,

X₁₃ представляет собой Glu или Ser, a

X₁₄ представляет собой Ile,

или

Х₁₁ представляет собой Ala,

X₁₂ представляет собой Met,

Х₁₃ представляет собой Glu, a

X₁₄ представляет собой Ilе,

причем связывание лиганда с эпитопом на активированных Т-клетках индуцирует гибель клеток.

2. Пептид по п.1, где

X₁₁ представляет собой Pro,

X₁₂ представляет собой Met,

Х₁₃ представляет собой Glu или Ser, a

X₁₄ представляет собой Ilе.

3. Способ получения антитела, ингибирующего активированные Т-клетки, включающий введение субъекту эффективного количества пептида по п.1 или 2.

4. Способ идентификации соединения-кандидата для индуцирования гибели активированных Т-клеток, включающий контактирование соединения с пептидом по п.1 или 2, причем связывание соединения с эпитопом показывает, что соединение является кандидатом для индуцирования гибели активированных Т-клеток.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что соединение является антителом.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что соединение является моноклональным антителом.

7. Фармацевтическая композиция, продуцирующая антитела, индуцирующие гибель активированных Т-клеток, включающая пептид по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.

8. Фармацевтическая композиция, продуцирующая антитела, индуцирующие гибель активированных Т-клеток, включающая пептид по п.2 и фармацевтически приемлемый носитель.

Описание изобретения к патенту

Предшествующий уровень теxники

Контроль за нежелательными иммунными реакциями очень важен при лечении аутоиммунных заболеваний, отторжения пересаженных органов, лечении аллергических заболеваний и раковых заболеваний, возникающих из-за Т-клеток. Активность чрезмерно агрессивных Т-клеток может быть подавлена иммуносупрессией или путем индуцирования иммунологической толерантности. Считают, что апоптоз участвует в сохранении соответствующих функций иммунной системы и удалении нежелательных клеток, таких как слишком агрессивные Т-клетки (Kabelitz et al. (1993) Immunol. Today 14, 338-340; Raff (1992) Nature 356, 397-399).

Краткая сущность изобретения

Данное изобретение относится к эпитопам, индуцирующим гибель Т-клеток. Такие эпитопы могут быть использованы, между прочим, для отбора соединений, которые связываются с этими эпитопами. Такие соединения используются для лечения заболеваний, при которых задействованы слишком агрессивные Т-клетки. Примеры таких заболеваний включают аутоиммунные заболевания, отторжение трансплантатов, аллергические заболевания и раковые заболевания, возникающие из-за Т-клеток.

С одной стороны, изобретение характеризуется трехмерной структурой выделенного эпитопа. Связывание лиганда с эпитопом на активированных Т-клетках приводит к гибели клеток. Такой эпитоп может быть представлен в следующем виде:

,

где X₁ является Tyr, Tip, His или Met,

X₂ является Asp,

X₃ является Ser, Phe, Pro, Glu или His,

X₄ является любой аминокислотой животного происхождения, а

X₅ является Pro, Tyr, His или Trp,

,

где X₆ является Asp,

X₇ является Tyr, Met, Asn, Trp или Phe,

X₈ является Phe или Leu,

X₉ является Pro, a

X₁₀ является Glu, или

,

где X₁₁ является Pro,

X₁₂ является Met,

X ₁₃ является Glu или Ser, a

X₁₄ является Ilе.

Любой из этих описанных выше эпитопов может быть, например, полипептидом, взаимодействующей областью двух полипептидов, остатком углевода, гликопротеином или любым их структурным, функциональным эквивалентом.

С другой стороны, изобретение раскрывает выделенный пептид, содержащий X₁-X₂-X₃-X₄-X ₅, X₆-X₇-X₈-X₉ -X₁₀ или X₁₁-X₁₂-X₁₃ -X₁₄. Связывание лиганда с полипептидом на активированных Т-клетках приводит к гибели клеток. В одном варианте полипептид содержит от 4 до 400 аминокислот (например, любое целое число от 4 до 400, включительно). Например, полипептид может представлять собой X₁-X₂-X₃-X₄ -X₅ (SEQ ID NO: 1), X₆-X₇-X ₈-X₉-X₁₀ (SEQ ID NO: 2), X₁₁ -X₁₂-X₁₃-X₁₄ (SEQ ID NO: 3) или любую из последовательностей SEQ ID Nos: 4, 6-18 и 20-22.

Термин «выделенный эпитоп» или «выделенный полипептид» относится к эпитопу или полипептиду, практически (существенно) очищенному от естественным путем связанных с ним природных веществ, т.е., по меньшей мере, 75% степени чистоты (например, любой степени от 75% до 100% чистоты) в расчете на сухой вес. Чистота может быть определена любым подходящим стандартным методом, например, колоночной хроматографией, электрофорезом в полиакриламидном геле или ВЭЖX-анализом. «Выделенный эпитоп» или «полипептид» может быть выделен из природного источника, произведенного методами рекомбинантных ДНК или химическими методами.

Еще один аспект изобретения касается нового соединения, которое связывается с одним из выше охарактеризованных эпитопов. Это соединение может быть веществом любого вида, включая антитела, такие как моноклональные антитела. Соединение данного изобретения может использоваться для определения эпитопа изобретения и для индуцирования гибели активированных Т-клеток.

Также в объем данного изобретения входит и способ получения антител. Способ включает введение субъекту эффективного количества одного из охарактеризованных выше эпитопов (например, полипептидов). Антитела используются для определения эпитопа изобретения или индуцирования гибели активированных Т-клеток.

В изобретении также раскрывается способ идентификации соединения-кандидата (например, моноклонального антитела) для индуцирования гибели активированных Т-клеток. Способ включает контактирование испытуемого соединения с эпитопом по изобретению и определение, связывается ли испытуемое соединение с эпитопом. Если испытуемое соединение связывается с эпитопом, оно считается кандидатом для индуцирования гибели активированных Т-клеток.

Изобретение включает также способ индуцирования гибели активированных Т-клеток контактированием активированных Т-клеток с соединением по изобретению.

Еще один аспект изобретения касается фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и (1) эпитоп данного изобретения, такой как полипептид или (2) соединение, которое связывается с пептидом.

Изобретение предусматривает также композиции и методы лечения заболеваний, в которые вовлечены чрезмерно агрессивные Т-клетки, такие как аутоиммунные заболевания, отторжение трансплантатов, аллергические заболевания или раковые заболевания, возникающие из-за Т-клеток. Детали одного или нескольких вариантов изобретения приводятся ниже вместе с описанием. Другие признаки, цели и преимущества изобретения будут понятны из приведенного ниже подробного описания.

Подробное описание изобретения

В основе данного изобретения лежит неожиданное открытие того факта, что активированные Т-клетки можно довести до состояния апоптоза путем истощения их в результате возобновляемого взаимодействия с новыми эпитопами, индуцирующими гибель Т-клеток. Истощение активированных Т-клеток особенно полезно при лечении состояний, связанных с избыточным или нежелательным опосредованным Т-клетками иммунным ответом или пролиферацией Т-клеток. Например, истощение активированных Т-клеток может приводить к уменьшению или устранению нежелательной активности Т-клеток или их пролиферации, связанным с аутоиммунными заболеваниями, отторжением трансплантатов, аллергическими заболеваниями и раковыми заболеваниями, вызванными Т-клетками.

Соответственно изобретение включает трехмерную структуру выделенного эпитопа. Связывание лиганда с эпитопом на активированных Т-клетках вызывает гибель клеток. Эпитоп представляет собой: X₁-X₂-X₃-X₄-X ₅, X₆-X₇-X₈-X₉ -X₁₀ или X₁₁-X₁₂-X₁₃ -X₁₄. Трехмерная структура X₁-X₂ -X₃-X₄-X₅, X₆-X ₇-X₈-X₉-X₁₀ или X ₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄ может быть определена, например, с помощью компьютерных моделирующих программ, описанных Duggan et al., (1995) J Med Chem. 38:3332-41 и Toogood (2002) J Med Chem. 45:1543-57. Эпитопы структурной, функциональной эквивалентности могут быть созданы в соответствии с трехмерной структурой X₁-X₂-X₃-X₄ -X₅, X₆-X₇-X₈-X ₉-X₁₀ или X₁₁-X₁₂-X ₁₃-X₁₄ и получены способами, известными в данной области, проверены на способность участвовать в индукции гибели активированных Т-клеток способами, которые описаны ниже в примерах. См. Barbas et al. (2001) Phage display. A laboratory manual. CSHL Press; Parmley et al. (1998) Gene 73, 305-318; Scott et al. (1990) Science 249, 386-390; U.S. Patent Application No. 20030049252 A1; WO 03/013603 Al; Osbome (1996) Curr Opin hnmunol 8:245-248; Lin et al. (1997) J. Immunol. 158, 598-603; Zhang et al. (1995) Nature 377, 348-350; Lai et al. (1995) Eur J hnmunol 25, 3243-3248; Mollereau et al. (1996) J Immunol 156; 3184-3190 и Gribben et al. (1995) Proc Nati Acad Sci USA 92, 811-815.

В соответствии с указанным здесь «активированная Т-клетка» представляет собой Т-клетку, обладающую большей частотой, скоростью или степенью пролиферации, чем неактивированная Т-клетка. «Гибель» клетки включает запрограммированную смерть клетки, т.е. апоптоз. «Индуцирование гибели клеток» происходит, когда популяция клеток, обработанная неким средством, показывает более высокую скорость гибели, чем необработанная популяция клеток. Например, доля in vitro активированных Т-клеток, претерпевших апоптоз, почти удваивается при обработке моноклональными антителами m128-9F9, m152-15A7 или m166-43B6, по сравнению с необработанными клетками, что определяется окрашиванием аннексином V и FACS-анализом (см. пример ниже).

Изобретение также относится к выделенному полипептиду, содержащему X ₁-X₂-X₃-X₄-X₅ , X₆-X₇-X₈-X₉-X ₁₀ или X₁₁-X₁₂-X₁₃-X ₁₄. Полипептид может использоваться для идентификации соединений, которые индуцируют гибель активированных Т-клеток. Связывание такого соединения с полипептидом, экспрессированным на поверхности активированных Т-клеток, индуцирует гибель клеток. Кроме того, свободные полипептиды (т.е. те, что не экспрессируются на клеточной поверхности) могут ингибировать гибель нежелательных клеток, конкурируя за эндогенные гибель-индуцирующие лиганды с полипептидами клеточной поверхности. Длина и последовательность полипептида могут быть разными для разных видов применения. Полипептид данного изобретения может быть получен, например, как выделенный с поверхности Т-клетки белок, синтетический полипептид или как рекомбинантный полипептид. Для того, чтобы получить рекомбинантный полипептид, нуклеиновая кислота, кодирующая его, может быть соединена с другой нуклеиновой кислотой, кодирующей партнера слияния, например, глутатион-S-трансферазу (GST), 6х-His якорь эпитопа или М13 Gene 3 белок. Получающаяся в результате слитая нуклеиновая кислота экспрессирует в подходящих хозяйских клетках слитый белок, который можно выделить известными методами. Выделенный слитый белок может быть даже обработан, например, ферментом для удаления партнера слияния с получением рекомбинантного полипептида данного изобретения.

Заявляемые эпитоп или полипептид могут быть использованы для создания антител животных (для получения антител) или человека (для лечения заболеваний). Методы получения моноклональных и поликлональных антител и их фрагментов в животных хорошо известны специалистам в данной области. См. например, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Термин «антитело» включает как интактные вещества, так и их фрагменты, такие как Fab, F(ab')₂ , Fv, scFv (одноцепочечное антитело) и dAb (доменное антитело. Ward, et al. (1989) Nature, 341, 544). Эти тела могут использоваться для детектирования эпитопа, например, при идентификации соединения, которое связывается с эпитопом (см. ниже). Антитела, которые способны индуцировать гибель активированных Т-клеток, также являются полезными в плане лечения заболеваний, таких как аутоиммунные заболевания, отторжение трансплантатов, аллергические заболевания или вызванные Т-клетками раковые заболевания. В принципе заявляемый эпитоп, например полипептид, может быть присоединен к носителю-белку, такому как KLH, смешан с адъювантом и инъецирован животному-хозяину. У животного вырабатываются антитела, которые затем подвергают выделению и очистке аффинной хроматографией. Как животные-хозяева обычно используются кролики, мыши, морские свинки и крысы. Различные адъюванты могут использоваться для усиления иммунного ответа в зависимости от вида животного-хозяина, включая адъювант Фрейнда (полный и неполный), минеральные гели, например гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плуроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин и динитрофенол. Пригодные для человека адъюванты включают BCG (бациллы Calmette-Guerin) и Corynebacterium parvum.

Поликлональные антитела, гетерогенные популяции молекул антител, содержатся в сыворотке иммунизированных субъектов. Моноклональные антитела, номогенные популяции антител к конкурентному антигену, могут быть получены с использованием стандартной гибридомной технологии (см. например, Kohler et al. (1975) Nature 256, 495; Kohler et al. (1976) Eur. J. Immunol. 6,511; Kohler et al. (1976) Eur. J. Immunol. 6, 292; Hammerling et al. (1981) Monoclonal Antibodies and Т Cell Hybridomas, Elsevier, New York). В частости, моноклональные антитела могут быть получены любым способом, который предусматривает производство антител с помощью непрерывно культивируемых культур клеток, как это описано у Kohler et al. (1975) Nature 256, 495 и в патенте США № 4376110; например, с помощью гибридомной технологии с использованием В-клеток человека (Kosbor et al. (1983) Immunol. Today 4, 72; Cole et al. (1983) Proc. Natl. Acad. See. USA 80,2026), и EBV-гибридомной технологии (Cole et al. (1983) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, me., p.77-96). Такие антитела могут относиться к любому классу иммуноглобулинов, включая IgG, IgM, IgE, IgA, IgD и любые их подклассы. Гибридома, продуцирующая моноклональные антитела данного изобретения, может культивироваться in vitro или in vivo. Способность продуцировать высокие титры моноклональных антител in vivo делает эту технологию особенно удобным способом производства антител.

Помимо этого, могут использоваться способы, разработанные для производства «химерных антител». См. например, Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,6851; Neuberger et al. (1984) Nature 312, 604; Takeda et al. (1984) Nature 314:452. Xимерное антитело представляет собой молекулу, в которой различные ее части получены от различных видов животных, например, имея в таком случае вариабельную область от мышиного моноклонального антитела и константную область иммуноглобулина человека. Альтернативно, описанные методы получения одноцепочечных антител (патенты США № 4946778 и 4704692) могут быть адаптированы для создания фаговой библиотеки одноцепочечных Fv антител. Одноцепочечные антитела образованы соединением фрагментов Fv региона тяжелой и легкой цепей посредством аминокислотного мостика. Фрагменты антител могут быть получены известными способами. Например, такие фрагменты включают (но не исключительно) F(ab')₂ фрагменты, которые могут быть получены перевариванием пепсином молекулы антитела, a Fab фрагменты могут быть получены восстановлением дисульфидных мостиков F(ab')₂ фрагментов. Антитела могут быть также гуманизированы известными в данной области способами. Например, моноклональные антитела с желаемой специфичностью связывания могут быть гуманизированы для коммерческих целей (Scotgene, Scotland; Oxford Molecular, Palo Alto, Calif). Антитела, полностью соответствующие человеческим, например те, что получают с помощью трансгенных животных, также относятся к данному изобретению (см. например. Green et al. (1994) Nature Genetics 7, 13; патенты США № 5545806 и 5569825).

Изобретение включает также и новое соединение, которое связывается с эпитопом по изобретению и индуцирует гибель Т-клеток. Такое соединение может быть создано, например, с помощью компьютерных моделирующих программ соответственно трехмерной структуре эпитопа и синтезировано известными в данной области способами. Оно может быть также идентифицировано скринированием библиотеки, что описано выше.

Испытуемые соединения могут быть получены с использованием самых различных подходов в методах комбинаторных библиотек, известных в этой области. Такие библиотеки включают: пептидные библиотеки, пептоидные библиотеки (библиотеки соединений, обладающих функциональными свойствами пептидов, но с новой основной цепочкой молекулы непептидной природы, которая устойчива к ферментативному расщеплению), имеющие доступные в пространстве адреса параллельные твердофазные или жидкофазные библиотеки, синтетические библиотеки, полученные деконволюцией или отбором аффинной хроматографией, библиотеки «одно-зерно-одно-соединение» и библиотеки антител. См., например Zuckermann et al. (1994) J Med Chem 37, 2678-85; Lam (1997) Anticancer Drug Des 12, 145; Lam et al. (1991) Nature 354, 82; Houghten et al. (1991) Nature 354, 84 и Songyang et al. (1993) Cell 72,767.

Примеры способов для синтеза молекулярных библиотек могут быть подобраны в уровне техники, например, в: DeWitt et al. (1993) PNAS USA 90, 6909; Erb et al. (1994) PNAS USA 91, 11422; Zuckermann et al. (1994) J Med Chem 37, 2678; Cho et al. (1993) Science 261, 1303; Carell et al. (1994) Angew Chem bit Ed Engl 33, 2059; Carell et al. (1994) Angew Chem Iit Ed Engl 33,2061 и Gallop et al. (1994) J Med Chem 37,1233.

Библиотеки соединений могут быть представлены в растворах (например, Houghten (1992) Biotechniques 13, 412-421), или зернах (Lam (1991) Nature 354, 82-84), чипах (Fodor (1993) Nature 364, 555-556), бактериях (патент США No. 5223409), спорах (патент США No. 5223490), плазмидах (Cull et al. (1992) PNAS USA 89, 1865-1869) или фагах (Scott and Smith (1990) Science 249, 386-390; Devlin (1990) Science 249, 404-406; Cwirla et al. (1990) PNAS USA 87, 6378-6382; Felici (1991) J Mol Biol 222, 301-310 и патент США № 5223409)

Для того чтобы идентифицировать соединение-кандидат для индуцирования гибели активированных Т-клеток, эпитоп данного изобретения вводят в контакт с испытуемым соединением и оценивают связывание этого соединения с эпитопом. Если соединение связывается с эпитопом, оно считается кандидатом для индуцирования гибели активированных Т-клеток.

Анализ по скринированию может выполняться различными путями. Например, один способ включает «заякоривание», фиксацию эпитопа (или эпитопсодержащего вещества, например, полипептида или слитого белка) или испытуемого соединения на твердой фазе и определение комплекса эпитопа с испытуемым соединением, образовавшегося на твердой фазе в процессе реакции. На практике в качестве твердой фазы обычно используют микротитровальные планшеты. Фиксируемый компонент может быть иммобилизован нековалентным или ковалентным связыванием. Нековалентное связывание может осуществляться простым нанесением на твердую фазу раствора фиксируемого вещества и высушиванием планшетов. Альтернативно иммобилизованное антитело (например, моноклональное антитело), специфичное к фиксируемому веществу, может использоваться для иммобилизации фиксируемого вещества на твердой фазе. Нефексируемый компонент добавляют к твердой фазе с нанесенным на ее поверхность фиксируемым компонентом. После того как реакция завершена, несвязавшаяся часть нефиксируемых компонентов удаляется (например, промыванием) в условиях, при которых любые полученные комплексы остаются иммобилизованными на твердой подложке. Определение этих комплексов можно осуществлять разными методами. Если нефиксируемый компонент предварительно мечен, обнаружение метки, иммобилизованной на твердой поверхности, показывает, что комплексы образовались. Если нефиксируемый компонент не метили предварительно, может использоваться непрямое мечение для обнаружения комплексов, образовавшихся на поверхности, например, можно использовать антитело, специфичное к нефиксируемому компоненту (антитело, в свою очередь, может быть непосредственно меченным или косвенно меченным с помощью меченого антииммуноглобулинового антитела).

Альтернативно реакцию можно проводить в жидкой фазе. Комплексы отделяют от несвязанных компонентов, используя, например, иммобилизованное антитело, специфичное к эпитопу (или эпитопсодержащему веществу), или испытуемое соединение. Комплексы затем детектируют, например, используя меченое антитело, специфичное к другому компоненту.

Соединение-кандидат может быть признано утвержденным, если убедились в его способности индуцировать гибель активированных Т-клеток с помощью метода, описанного ниже в примере, или любого другого метода, известного в данной области. Вещество, в отношении которого сделан этот вывод, может использоваться для индуцирования гибели активированных Т-клеток и для лечения заболеваний, таких как аутоиммунные заболевания, отторжение трансплантата, аллергические заболевания и вызванный Т-клетками рак.

Изобретение обеспечивает способ индуцирования гибели активизированных Т-клеток, например, контактированием активированных Т-клеток с соединением данного изобретения in vitro или введением субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения изобретения. Субъекты, которых этому подвергают, могут быть идентифицированы как имеющие или находящиеся в группе риска по приобретению состояния, характеризующегося избыточным опосредованным Т-клетками иммунным ответом, например, пациенты, страдающие от аутоиммунных заболеваний, отторжения трансплантатов, аллергических заболеваний или рака, возникновение которого обусловлено Т-клетками. Этот способ может осуществляться как сам по себе, так и в сочетании с другими лекарствами или терапией.

Термин «лечение» определяется как введение композиции субъекту с целью лечения, облегчения, обеспечения успокаивающего или целительного действия, профилактики или уменьшения интенсивности симптомов заболевания, последствий заболевания или предрасположенности к заболеванию. «Эффективное количество» - это такое количество композиции, которое способно обеспечить желаемый в смысле медицины эффект, например, как описано выше, у субъекта, которого лечат.

Примеры заболеваний, которые лечат, включают (без ограничения): сахарный диабет, артрит (включая ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, остеоартрит и псориазный артрит), рассеянный склероз, энцефаломиелит, миастению гравис, системную красную волчанку, аутоимунный тироидит, дерматит (в том числе атопический дерматит и экзематозный дерматит), псориаз, Sjögren's синдром, болезнь Крона, афтозные язвы, ожоговый дерматит, конъюктивит, кератоконъюктивит, диабет I типа, воспалительные заболевания кишечника, язвенный колит, астму, аллергическую астму, красную волчанку, склеродермит, вагинит, проктит, сыпь от лекарств, лепрозные обратные реакции, эритемную узелковую лепру, аутоиммунный увеит, аллергический энцефаломиелит, острую некротизирующую геморрагическую энцефалопатию, идиопатическую билатеральную прогрессирующую сенсоневральную потерю слуха, апластическую анемию, истинную эритропитную анемию, идиопатическую тромбоцитопению, полихондрит, Wegener's грануломатоз, хронический активный гепатит, Stevens-Johnson синдром, идиопатический синдром мальабсорбции, красный плоский лишай, болезнь Graves, саркоидоз, первичный биллиарный цирроз, ягодичный увеит, интерстициальный фиброз легкого, синдром «трансплантат-против-хозяина»; заболевания, связанные с трансплантацией (включая трансплантацию с использованием аллогенных или ксеногенных тканей), например, трансплантацию костного мозга, трансплантацию печени или трансплантацию любого органа или ткани, разные виды аллергии, например, атопическую аллергию, СПИД и новообразования из-за Т-клеток, такие как лейкемии или лимфомы.

В одном in vivo варианте терапевтическую композицию (например, композицию, содержащую эпитоп изобретения, полипептид изобретения или соединение данного изобретения) вводят субъекту. Как правило, эпитоп, полипептид или указанное соединение суспендируют в фармацевтически приемлемом носителе (например, физрастворе) и вводят орально или внутривенной инфузией, или инъецируют, или имплантируют подкожно, внутримышечно, интратекально, внутрибрюшинно, интраректально, интравагинально, интраназально, внутрь желудка, внутрь трахеи, внутрь легкого.

Доза, которая нужна, зависит от выбора типа введения, природы состава, природы заболевания пациента, его габаритов и веса субъекта, площади его поверхности, возраста и пола; других вводимых лекарств и решения лечащего врача. Подходящие дозировки варьируют в диапазоне 0,01-100,0 мг/кг. Большие колебания требующихся дозировок обусловлены большим числом пригодных композиций и различной их эффективностью при разных типах введения в организм. Например, считается, что при оральном введении требуются более высокие дозы, чем при внутривенном введении. Колебания в уровнях дозировок могут быть отрегулированы с использованием стандартных эмпирических правил по оптимизации, хорошо известных в данной области. Инкапсулирование композиции в подходящее средство для доставки (например, полимерные микрочастицы или имплантируемые средства) может повышать эффективность доставки, в частности, оральной доставки.

В объем изобретения входит также и фармацевтическая композиция, которая содержит фармацевтически приемлемый носитель и эффективное количество соединения данного изобретения. Фармацевтическая композиция может использоваться для лечения вышеуказанных заболеваний. Фармацевтически приемлемый носитель включает растворитель, дисперсионную среду, покрытие, антибактериальное и противогрибковое средство и изотонический и задерживающий абсорбцию агент.

Фармацевтическая композиция данного изобретения может быть составлена в дозировочных формах для различных типов введения с использованием общеизвестных способов. Например, она может быть изготовлена в виде капсул, заключена в гель или быть в виде таблетки для орального применения. Капсулы могут содержать любые стандартные фармацевтически приемлемые материалы, такие как желатин или целлюлоза. Таблетки могут быть составлены в соответствии с известными способами компрессированием (уплотнением) смесей этой композиции с твердым носителем и любрикантом. Примеры твердых носителей - крахмал и сахаросодержащий бентонит. Композиция может также вводиться в виде таблетки в твердой оболочке или капсулы, содержащей связующее, например, лактозу или маннитол, стандартный наполнитель и таблетирующий агент. Фармацевтическая композиция может вводиться парентерально. Примеры вводимых парентеральных дозировочных форм включают водные растворы, изотонический физраствор или 5% глюкозный раствор активного агента или другой хорошо известной фармацевтически приемлемый наполнитель. Циклодекстрины или другие солюбилизирующие агенты, хорошо известные специалистам в данной области, могут использоваться как наполнители для средств доставки терапевтического агента.

Эффективность композиции данного изобретения может быть оценена как in vitro, так и in vivo. См. например, приводимые ниже примеры. Кратко говоря, композиция может быть испытана на способность индуцировать гибель активированных Т-клеток in vitro. При испытании in vivo композицию можно инъецировать животному (например, когда животной моделью является мышь) и затем оценить терапевтический эффект. Основываясь на этих результатах, можно определить соответствующие дозировочные параметры и тип введения.

Конкретный пример, приведенный ниже, предназначен только для иллюстрации и ни в коей мере не является ограничивающим для изобретения. Основываясь на данном описании, специалисту в данной области будет несложно воспроизвести данное изобретение во всем его объеме без дополнительной детальной доработки. Все опубликованные в данном тексте источники, упомянутые здесь, включены в качестве ссылок.

Получение суспензии клеток селезенки мыши

Селезенку мыши погрузили в 8 мл Hank's уравновешенного солевого раствора (HBSS), осторожно измельчили стерильным покровным стеклышком, перенесли в 15 мл центрифужную пробирку (Costar) и вращали при 200×g в течение 5 минут. Супернатант отбросили, а осадок клеток ресуспендировали в оставшемся буфере мягким постукиванием по стенке. Загрязняющие эритроциты крови (RBC) лизировали добавлением 1 мл RBC буфера для лизиса (0,6 М NH₄Cl, 0,17 М Трис-основания, рН 7,65) с последующим 2-минутным инкубированием при комнатной температуре и быстрым вливанием 9 м HBSS. Клетки осаждали при 200×g в течение 5 минут, дважды промывали и ресуспендировали в RPMI среде. Концентрацию и жизнеспособность клеток в смеси определяли гемоцитометром (Cambridge Scientific Inc.) и в результате экслюзии с применением Трипана голубого.

Получение моноклональных антител, специфичных к Т-клеткам и индуцирущих их апоптоз

Моноклональные антитела, индуцирующие апоптоз Т-клеток, получали иммунизацией мыши Конковалин А-активированными Т-клетками человека и проверяли на их способность связываться с активированными Т-клетками человека и впоследствии индуцировать апоптоз Т-клеток. Моноклональные антитела получали согласно хорошо известным способам слияния клеток, разработанным Kohler и Milstein ((1976) Euro J Immunol 6, 511-519) для получения гибридомы, секретирующей желаемые антитела. Три гибридомы, полученные согласно этому способу, секретирующие Моноклональные антитела, обозначенные как m 128-9F9, m 152-15A7 и m 166-43B6 соответственно, оказались способными индуцировать апоптоз Т-клеток in vitro.

Концентрированный культуральный супернатант каждой гибридомы центрифугировали при 20000 ×g в течение 10 минут, а затем супернатант разбавили в соотношении 1:1 буфером для связывания (0,1 М ацетат натрия, рН 5,0). Колонку с белком G (примерно 1 мл объем слоя) промыли трижды 3-5 мл буфера для связывания. Очищенный культуральный супернатант наносили на колонку с белком G, выходящие фракции собирали и вновь наносили на колонку. Затем колонку промывали 6-10 мл буфера связывания и связанные антитела элюировали с колонки 5 мл элюирующего буфера (0,1 М глицин-HCl, рН 2,8).

Каждая фракция содержала 1 мл элюированного антитела, в элюированной фракции доводили рН до нейтрального значения смешиванием каждой 1 мл фракции с 50 микролитрами 1М Трис-HCl, рН 7,5. Фракции, содержащие антитела, были собраны, подвергнуты диализу против 2 литров PBS, рН 7,4, три раза по три часа на каждый диализ. Концентрации белка в пробах антител определяли по методике, описанной Bradford, с использованием Bio-Rad Protein Assay (BIO-RAD, Hercules, CA).

Индукция гибели активированных Т-клеток человека моноклональными антителами

Активированные Т-клетки (см. выше) ресуспендировали до конечной концентрации 5×10 ⁵ клеток/мл в RPMI среде, содержащей 5 нг/мл IL-2, и обрабатывали контрольным Ig, m 128-9F9, m 152-15A7 или m 166-43-B6.

Xорошо известно, что индуцирующие гибель Т-клеток антитела могут использоваться как терапевтические средства для лечения связанных с Т-клетками заболеваний, таких как отторжение трансплантата, аутоиммунные заболевания и аллергия. Было создано три типа моноклональных антител, специфичных к Т-клеткам человека, и способность этих моноклональных антител индуцировать апоптоз активированных Т-клеток человека была исследована. Культуральные супернатанты, содержащие моноклональные антитела, секретированные линией клеток гибридомы m128-9F9, m152-15A7 или m166-43B6, инкубировали либо с неактивированными Т-клетками человека (День 0), либо с in vitro активированными Т-клетками человека (День 7) в течение 6 часов. Клетки окрашивали аннексином V после инкубации и подвергали FACS-анализу. СD3-позитивные клетки были отброшены, чтобы обеспечить подсчет либо in vitro активированных Т-клеток человека, либо находящихся в покое Т-клеток человека. Апоптозные клетки были позитивными в плане окрашивания аннексином V. В Таблице 1 показана доля апоптозных клеток среди всех сканированных Т-клеток. Неожиданно оказалось, что моноклональные антитела, секретируемые клеточными линиями гибридом m128-9F9, m152-15A7 и m166-43B6, индуцировали гибель in vitro активированных Т-клеток человека, но не действовали на неактивированные Т-клетки человека Эта способность индуцировать апоптоз активированных Т-клеток, не затрагивая при этом покоящиеся Т-клетки, уникальное свойство протекания процесса апоптоза, и это - главная характеристика терапевтических средств, нацеленных на заболевания, в которых задействованы Т-клетки.

Таблица 1
Процентные доли апоптозных Т-клеток
	Без обработки	Anti-myc	m128-9F9	Без обработки	Anti-myc	m152-15A7	m166-43
День 0	4,17	6,67	5,82	18,18	15,52	5,23	6,57
День 7	12,63	13,36	28,71	24,18	23,08	51,66	49,44

Идентификация эпитопов. индуцирующих гибель Т-клеток

Для того, чтобы идентифицировать эпитопы, распознаваемые моноклональными антителами m128-9F9, m152-15A7 и m166-43B6, эти моноклональные антитела использовали, чтобы, скринируя последовательности в полипептидной библиотеке, отыскать консенсусные по связыванию (Ph. D.-12 Phage Display Peptide Library Kit, New England Biolabs, Inc.). Библиотека содержала различные 12-мерные пептиды, связанные с 406-аа М13 Gene 3 белком. В 96-луночные микротитровальные планшеты были нанесены антитела по 50 µл/ячейку в концентрации 10 µг/мл в 0,1М NаНСО₃ (рН 8,6) буфера в течение ночи при 4°С. После отмывки содержимое планшеты блокировали инкубацией с блокирующим буфером, содержащим 0,1М NaHCO₃ (рН 8,6), 5 мг/мл BSA, 0,02% NaN₃ (150 µл/ячейку) в течение, по меньшей мере, одного часа при 4°С. Планшеты затем инкубировали со слитыми белками из полипептидной библиотеки, описанной выше, при различных концентрациях в течение одного часа при комнатной температуре. После отмывки 0,5% Твином, содержащим TBS, связавшиеся слитые белки элюировали 1 мг/мл BSA, содержащим 0,2М Глицин-НСl (рН 2,2), буфером и нейтрализовали 1М Трис-НСl (рН 9,1). Затем определяли последовательности элюированных слитых белков.

Последовательности полипептидов, связанных моноклональным антителом m128-9F9, показаны ниже:

WPEDSSYDS WPRG	SEQ ID NO: 4
LD YDFLPETEP	SEQ ID NO: 5
TATWDPDYFSDS	SEQ ID NO: 6
AETDYDPDHFTPG	SEQ ID NO: 7
DARYSHDPAWPYG	SEQ ID NO: 8
AGQKWDPEWPHSG	SEQ ID NO: 9
EPNMDPNWASPSG	SEQ ID NO: 10
KSHYDESWWYNGG	SEQ ID NO: 11
YDHHWTNPPTOK	SEQ ID NO: 12
YDHHWPRDDIAP	SEQ ID NO: 13

Была получена консенсусная полипептидная последовательность X ₁- X₂-X₃-X₄-X₅ , где X₁=Y/W/H/M, X₂=D, X₃=S/F/P/E/H, X₄=любая аминокислота, X₅=P/Y/H/W.

Последовательности полипептидов, связанных моноклональным антителом m166-43 В6, показаны ниже:

ODTWYPDYFPE S	SEQ ID NO: 14
SHTLLNDMFPE S	SEQ ID NO: 15

SPLRDNFPE TLW	SEQ ID NO: 16
ASPYMDNFPE EN	SEQ ID NO: 17
OLVODWLPE ESH	SEQ ID NO: 18
YLDYDFLPE TEPP	SEQ ID NO: 19

Была получена консенсусная полипептидная последовательность X₆- X₇ -X₈-X₉-X₁₀, где X₆ =D, X₇=Y/M/N/W/F, X₈=F или L, X₉ =Р, а X₁₀=Е.

Последовательности полипептидов, связанных моноклональным антителом m152-15А7, показаны ниже:

YTPMPMEISHSA	SEQ ID NO: 20
MNDKYIPMSI SA	SEQ ID NO: 21
KIPHKTLV PMEI	SEQ ID NO: 22
TDSA AMEIOTTQ	SEQ ID NO: 23

Была получен консенсусная полипептидная последовательность X₁₁ -X₁₂-X₁₃-X₁₄, где X₁₁ =Р/А, X₁₂=М, X₁₃=E/S, X₁₄=I.

ELISA-анализ эпитопов, индуцирующих гибель Т-клеток, распознаваемых моноклональными антителами

Для того чтобы идентифицировать специфичности эпитопов, индуцирующих гибель Т-клеток, распознаваемых вышеохарактеризованными моноклональными антителами, осуществляли «сэндвич»-ELISA-анализ. Серию разведении (от 0,0017 фмоль до 17 фмоль) эпитопсодержащих полипептидов инкубировали с моноклональными антителами m128-9F9, m152-15А7 или m1666-43В6, предварительно нанесенными на ELISA-планшеты, для определения аффинности их связывания.

В 96-луночные микротитровальные планшеты наносили антитела по 50 µл/ячейку при концентрации 1 µл/мл в течение ночи при 4°С. Содержимое планшетов блокировали инкубацией с 0,25% BSA в PBS (150 µл/ячейку) в течение 1 часа при 37°С. Планшеты затем инкубировали со слитыми белками, содержащими различные полипептиды, в течение 2 часов при комнатной температуре. После того как планшеты промыли 4 раза PBS, содержащим 0,05% Твин 20 (PBST), их инкубировали с антителами, специфичными к партнеру слияния, при концентрации 2 µл/мл в течение 1,5 часов при комнатной температуре. После инкубации планшеты промывали 4 раза PBST. 50 мл разбавленного от 1 до 3000 раз антитела козы, специфичного к партнеру слияния, конъюгированного с щелочной фосфатазой (АР), добавили в каждую ячейку и планшеты инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Ферментативную реакцию проводили, добавив 50 мкл раствора АР субстрата (1 таблетку АР субстрата растворяли в 5 мл субстратного буфера). Результаты подтвердили, что все отобранные полипептиды специфично связываются с соответствующими им антителами, использованными для отбора.

Другие варианты

Все признаки, раскрытые в описании, могут быть скомбинированы в любом сочетании. Каждый признак, раскрытый в описании, может быть заменен альтернативным признаком, обеспечивающим тот же самый, эквивалентный или аналогичный результат. Таким образом, если иное специально не оговорено, каждый признак, который раскрыт, следует рассматривать только как пример из множества аналогичных эквивалентных или схожих признаков.

Исходя из вышеприведенного описания, специалист в данной области может легко установить существенные признаки настоящего изобретения и без искажения его идеи и объема может произвести некоторые изменения и модификации изобретения, чтобы приспособить его для различных нужд и условий. Так что иные воплощения и варианты изобретения подпадают под объем данного изобретения.