способ получения r-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (рнга)

Формула изобретения

Способ получения R-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), включающий изготовление R-антигена из бруцелл штамма В.abortus 16/4, определение его активности путем титрации, изготовление формалинизированных и танизированных эритроцитов барана, последующую сенсибилизацию формалинизированных и танизированных эритроцитов барана оттитрованным R-антигеном, отличающийся тем, что для изготовления R-антигена трехсуточную культуру бруцелл штамма В.abortus 16/4 смывают с поверхности питательной среды стерильным физиологическим раствором, центрифугируют, после чего выпавшие в осадок микробные клетки подвергают механическому разрушению путем тщательного растирания, а сенсибилизацию формалинизированных и танизированных эритроцитов барана оттитрованным R-антигеном осуществляют путем выдерживания их смеси при температуре 45-50°С в течение одного часа.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к получению биологических препаратов.

Известен «Способ получения R-брупеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации», суть которого заключается в следующем. Девитализованную бакмассу штамма В. abortus 16/4 центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20-30 минут, надосадочную жидкость сливают, а на сырую бакмассу, выпавщую в осадок, воздействуют расплавленным концентрированным фенолом (ХЧ) в соотношении 1:1. Бакмассу с фенолом выдерживают 30-40 минут при 80-85°С в водяной бане, после чего к ней добавляют дистиллированную воду, нагретую до 70°С, в таком количестве, чтобы остаточная концентрация фенола в растворе составила 5%. Смесь фильтруют и проводят ее диализ при комнатной температуре в целлофановых мешочках против 10 объемов дистиллированной воды в течение 48 часов. Диализат используют в качестве R-антигена для нагрузки формалинизированных и танизированных эритроцитов барана (Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных и Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока, авторы: Л.В.Дегтяренко, автореф., диссерт., д.в.н., 2005, А.П.Красиков, автореф., диссерт., д.в.н., 1996 и др.).

Недостатком данного способа является слабая активность диагностикума, изготовленного этим способом, в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, зараженного R-формами бруцелл. Кроме того, данный диагностикум в отдельных случаях спонтанно агглютинируется в РНГА с нормальной кроличьей сывороткой, используемой в качестве стабилизатора для разведения исследуемых сывороток крови животных. Учитывая изложенное, мы решили разработать способ получения высокоактивного и специфического R-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для РНГА, лишенного указанных недостатков.

Целью изобретения является повышение активности и специфичности бруцеллезного R-диагностикума для РНГА. Эта цель достигается механическим разрушением целостности микробных клеток B.abortus штамма 16/4 (без химического воздействия), используемых для получения антигена для РНГА путем тщательного растирания бакмассы бруцелл в ступке.

Изготовление R-антигена (сенситина)

Культуру бруцелл штамма B.abortus 16/4, 3-суточного роста, выращиваемую на мясопептоннопеченочном глюкозоглицериновом агаре, смывают с поверхности питательной среды стерильным физиологическим раствором. Полученную бакмассу центрифугируют при 6000 об/мин в течение 1-го часа. Надосадочную жидкость удаляют, а микробные клетки, выпавшие в осадок, помещают в ступку и подвергают механическому разрушению путем тщательного растирания. Затем к бакмассе добавляют небольшое количество физиологического раствора и ее нагревают в водяной бане при температуре 80-90°С в течение 35-40 минут, после чего концентрацию бруцелл бакмассы доводят до 100 млрд микробных клеток в 1 мл физиологическим раствором и подвергают центрифугированию при 6000 об/мин в течение 1-го часа. Полученный экстракт (сенситин) после определения его активности путем титрации используют для сенсибилизации формалинизированных и танизированных эритроцитов.

Титрация R-бруцеллезного антигена (сенситина)

Для каждой серии формалинизированных и танизированных эритроцитов определяют минимальную дозу R-бруцеллезного антигена (сенситина), необходимую для получения R-диагностикума с оптимальной активностью.

Предварительно к осадку танизированных эритроцитов добавляют 5%-ный раствор хлорида натрия до получения 5-процентной взвеси и туда же вносят 0,25% - детергента вторичного алкилсульфата натрия. После чего проводят их сенсибилизацию возрастающими дозами R-антигена при температуре 45-50°С в течение одного часа. Для этого в пробирки с 1 мл 5%-ной взвеси эритоцитов добавляют 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5... до 4,0 мл R-антигена, изготовленного указанным выше способом. Смесь перемешивают и выдерживают в водяной бане в течение одного часа при 45-50°С. После этого сенсибилизированные эритроциты трижды отмывают от избытка R-антигена физиологическим раствором с добавлением к нему 1% нормальной инактивированной кроличьей или 2,5% лошадиной сыворотки крови. Затем в каждую пробирку с осадком отмытых сенсибилизированных эритроцитов вносят по 2 мл физиологического раствора со стабилизатором (свежая кроличья или лошадиная сыворотка крови). Полученные 2,5%-ные взвеси эритроцитов, сенсибилизированных разными дозами R-антигена (R-сенситина), гомогенизируют встряхиванием пробирок и проверяют в РНГА на активность и специфичность.

Для контроля активности и специфичности R-диагностикума применяют R-позитивную и негативную сыворотки. Из позитивной сыворотки готовят разведения (физраствором с добавлением в качестве стабилизатора сыворотки крови кролика (1%) или лошади (2,5%) 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200, 1:6400, 1:12800 и 1:25600, а негативную сыворотку разводят 1:50, 1:100, 1:200. Все разведения сыворотки крови инактивируют путем прогревания в водяной бане при 60-62°С в течение 30 минут, после чего их переносят в лунки полистироловой пластины в объеме 0,5 мл и к ним добавляют по 0,05 мл взвеси сенсибилизированных эритроцитов (R-диагностикума). Содержимое пластинок тщательно перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 3-4 часа, после чего проводят учет реакции (табл.1).

Таблица 1

Результаты проверки активности и специфичности R-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума в РНГА

Количество антигена (сенситина) на 1 мл 5% взвеси эритроцитов

Титры РИГА

Кроличья сыворотка

с позитивной R-сывороткой

с негативной сывороткой

1:50

1:100

1:200

1:400

1:800

1:1600

1:3200

1:6400

1:12800

1:25600

1:50

1:100

1:200

1:100

0,5

++++

++++

++++

++++

+++

++

+

-

-

-

-

-

-

-

1,0

++++

++++

++++

++++

++++

+++

++

+

-

-

-

-

-

-

1,5

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

+++

+

-

-

-

-

-

2,0

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

+++

+++

+

-

-

-

-

2,5

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

-

-

-

-

3,0

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

-

-

-

-

3,5

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

+++

++

+

-

-

4,0

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

+++

++

+

-

-

Из приведенных данных в таблице 1 видно, что использование для нагрузки эритроцитов сенситина (антигена), извлеченного путем механического разрушения целостности микробных клеток В.abortus 16/4, позволяет готовить высокоактивный и специфичный R-бруцеллезный эритроцитарный диагностикум. Наименьшей дозой сенситина (антигена), необходимой для получения эритроцитарного диагностикума с высокой активностью и специфичностью, является 2,5 мл его на 1 мл 5%-ной взвеси стабилизированных и танизированных эритроцитов барана. Такую дозу берут для изготовления диагностикума.

Изготовление R-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для РНГА

R-бруцеллезный эритроцитарный диагностикум готовят путем сенсибилизации формалинизированных и танизированных эритроцитов барана антигеном (сенситином), извлеченным из бруцелл инагглютинабельного штамма В.abortus 16/4 механическим разрушением микробных клеток по описанному выше способу.

Предварительно определяют минимальную сенсибилизирующую дозу R-антигена (сенситина) путем его титрации на эритроцитах при оптимальном режиме (см. титрация R-антигена), для чего к 1 мл 5%-ных формалинизированных и танизированных эритроцитов добавляют 5% хлорида натрия, 0,25% вторичного алкилсульфата натрия и антигена (сенситина) в минимальной оттитрованной дозе. Сенсибилизацию эритроцитов проводят путем выдерживания смеси в водяной бане при температуре 45-50°С в течение одного часа при периодическом встряхивании через 5-8 минут. Затем сенсибилизированные эритроциты отмывают от избытка сенситина в течение 30 минут три раза кроличьей сывороткой, разведенной физиологическим раствором в соотношении 1:100 и прогретой при 60°С. Физраствор с кроличьей сывороткой для отмывания берут в десятикратном объеме. После отмывания к осадоку эритроцитов добавляют физиологический раствор со стабилизатором (кроличья или лошадиная сыворотка) в количестве, необходимом для получения 5%-ной взвеси эритроцитов. Затем их консервируют путем добавления 0,3% формальдегида и проверяют в РНГА на активность и специфичность. Готовый препарат хранят в холодильнике при 4-6°С.

Испытание R-диагностикума в сравнении с аналогичным препаратом, изготовленным по методике ВНИИБТЖ и ИЭВС и ДВ

Активность и специфичность R-диагностикума, изготовленного по разработанному нами способу (R-диагностикум Прикаспийского зонального НИВИ), проверяли в сравнении с аналогичным препаратом ВНИНБТЖ, ИЭВС и ДВ (прототип).

Для испытания R-диагностикумов в РНГА исследовали бруцеллезные R и S-сыворотки, а также сыворотки крови, взятой от 2-х заведомо здоровых и 2-х привитых вакциной из штамма 82 коров, спустя 15 дней после иммунизации (табл.2).

Таблица 2
Результаты проверки активности и специфичности R-диагностикумов в РНГА
Сыворотки крови	Результаты исследования сыворотки крови в РНГА
с R-диагностикумом Прикасп. ЗНИВИ	с R-диагностикумом ВНИИБТЖ и ИЭВС и ДВ	S-дигностикумом
R-положительная	1:25600++++	1:6400++++	1:200+++
S-положительная	1:200+++	1:200+++	1:51200++++
От коровы, вакцинирован. шт. 82	1:1600+++	1:800+++	1:400++++
От коровы, вакцинирован. шт. 82	1:1600++++	1:400+++	1:200+++
Негативная	отр.	1:50+++	отр.
Негативная	отр.	1:25++++	отр.

Как видно из таблицы 2, при исследовании в РНГА с R-бруцеллезным эритроцитарным диагностикумом, изготовленным по разработанному нами способу (R-диагностикум Прикасп. ЗНИВИ), титр РНГА с R-положительной сывороткой составлял 1:25600 и с сыворотками крови коров, привитых вакциной из штамма 82-1:1600, тогда как с этими же сыворотками с R-диагностикумом ВНИИБТЖ и ИЭВС и ДВ получена РНГА в титрах 1:6400 и 1:400-1:800.

Диагностикум, изготовленный по новой методике, обладал более высокой специфичностью, о чем свидетельствуют результаты исследования негативных сывороток в РНГА с обоими R-диагностикумами.

При исследовании высокоактивной S-сыворотки, содержащей специфические антитела в титре 1:51200, получена РНГА с R-диагностикумами в разведении 1:200. Примерно такие же результаты получены при исследовании сывороток крови коров, привитых вакциной из штамма 82. Средний титр R-антител у вакцинированных против бруцеллеза коров в 2-4 раза превышал уровень S-антител. В то же время у реиммунизированных вакциной из штамма 82 и зараженных бруцеллезом животных спустя 12 месяцев после ревакцинации в сыворотке крови содержались S-антитела в высоких титрах, а титры R-антител, выявленных РНГА с R-диагностикумами, не превышали 1:100 (табл.3).

Таблица 3
Результаты исследования сывороток крови коров неблагополучного по бруцеллезу хозяйства в РНГА с S- и R-диагностикумами спустя 12 месяцев после реиммунизации вакциной из штамма 82
№ п/п	№ животных	Титр РНГА с	PCK c
R-диагностикумом Прикасп.ЗНИВИ	S-диагностикумом	S-антигеном
1	5138	1:50	1:400	1:10
2	5117	1:50	1:800	1:40
3	5388	1:100	1:1600	1:80
4	7625	1:100	1:400	1:10
5	5316	1:100	1:800	1:40
6	7524	1:50	1:800	1:40
7	5372	1:100	1:400	1:20
8	7505	1:100	1:3200	1:640
9	368	1:100	1:3200	1:320
10	1793	1:100	1:3200	1:320
11	5104	1:100	1:800	1:40
12	5113	1:100	1:200	1:10
13	5173	1:50	1:400	1:10
14	5394	1:100	1:800	1:40
15	1088	1:100	1:1600	1:80
16	5144	1:100	1:400	1:20
17	6258	1:100	1:3200	1:80
Контроль отриц.	отр.	отр.	отр.
Позит. S-сывор.	1:100	1:3200	1:320
Позит. R-сывор.	1:25600	1:100	отр.

У животных благополучных по бруцеллезу хозяйств (25 гол.) с отрицательными PA, PCK и РБП в отдаленные сроки после реиммунизации вакциной из штамма 82, показания РНГА как с S-, так и R-диагностикумами были также отрицательными, что свидетельствует о специфичности R-диагностикума, изготовленного по разработанному способу (табл.4)

Таблица 4
Результаты исследования сывороток крови коров благополучного по бруцеллезу хозяйства в РА, РСК, РБП и РНГА с S- и R-диагностикумами через 12 месяцев после реиммунизации вакциной из штамма 82
Исследовано голов	РА	РСК	РБП	РНГА с S-диагностикумом	РНГА с R-диагностикумом Прикасп. ЗНИВИ
25	отр.	отр.	отр.	отр.	отр.

Таким образом, в результате проведенных исследовании установлено, что путем механического разрушения целостности (без химического воздействия) микробных клеток штамма 16/4 B.abortus и сенсибилизации формалинизированных и танизированных эритроцитов барана извлеченным из них экстрактом, из расчета 2,5 мл его на 1 мл 5%-ной взвеси эритроцитов, удается получить высокоактивный и специфичный (по сравнению с аналогом) R-бруцеллезный эритроцитарный диагностикум для РНГА.