способ получения иммуностимулирующего препарата для животных и иммуностимулирующий препарат на его основе

Формула изобретения

1. Способ получения иммуностимулирующего препарата для животных из стевиозида, при этом стевиозид растворяют в 0,9%-ном физиологическом растворе, полученный раствор добавляют в предварительно измельченный лецитин, затем в полученную смесь постепенно вносят нагретое до 35-40°С оливковое масло и перемешивают, далее производят фильтрование полученного раствора и автоклавирование при температуре 115-120°С в течение 15-20 мин, затем полученный стерильный препарат разливают по флаконам и укупоривают.

2. Иммуностимулирующий препарат для животных, включающий в себя стевиозид, отличающийся тем, что он дополнительно содержит 0,9%-ный физиологический раствор, оливковое масло, лецитин при соотношении компонентов, мас.%:

Стевиозид	10-30
Физиологический раствор 0,9%-ный	9-11
Лецитин	1-3
Оливковое масло	остальное

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ:

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к иммуностимулирующим препаратам для животных и способу их получения, может быть использовано для повышения общей и специфической резистентности организма животных.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Известно иммуностимулирующее средство растительного происхождения, масло из семян амаранта. Предложенный иммуностимулятор дает четко выраженный иммуностимулирующий эффект и может быть использован для коррекции иммунодефицитных состояний при лечении заболеваний различной этиологии (см. патент RU № 2170096, кл. A61K 35/78, опуб. 10.07.2001).

Недостатком этого иммуностимулятора является сложность приготовления препарата и большой расход материалов.

Известен способ получения лекарственного средства на основе биологически активного вещества, обладающего гипогликемической и иммуномодулирующей активностью, включающее экстрагирование растительного сырья, травы манжетки водой, очищенной методом ускоренной дробной мацерации, в соотношении сырье:экстрагент - 1:10 при нагревании до 90-95°С (см. патент RU № 2356569, кл. A61K 36/73, А61Р 37/02, А61Р 3/10, опубл. 27.05.2009).

Недостатком данного способа получения иммуностимулятора является сложность получения исходного сырья.

Известен иммуностимулятор растительного происхождения, где предлагается использование (+)-R- ликорицидина (1), компонента корня солодки уральской, а также высушенного в виде порошка и обработанного экстракта корня солодки уральской, содержащего 12-38 мас.% вещества (1) (см. патент RU № 2166325, кл. A61K 35/78, A61K 31/58 опубл. 10.05.2001).

Недостатком данного иммуностимулятора является его непродолжительное действие на организм.

Наиболее близким по технической сущности и принятый авторами за прототип является способ получения стевиозида включающий в себя экстракцию измельченных сухих листьев растения Stevia Rebaudiana В. сжиженным CO₂, находящимся в докритическом или сверхкритическом состоянии. Изобретение обеспечивает высокую степень очистки экстракта, снижает потери стевиозида и повышает выход и чистоту готового продукта (см. патент RU № 2250041, кл. A23L 1/236, A23L 1/22, опубл. 20.04.2005).

Недостатком данного способа является порошкообразная форма получаемого вещества, что делает его непригодным для парентерального введения.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей изобретения является создание иммуностимулирующего препарата на основе стевиозида, направленного на лечение и профилактику иммунодепрессивных состояний, вызванных как патологическими процессами, так и неблагоприятной экологической ситуацией. Способствуя повышению общей и специфической резистентности организма, разработанный препарат является дешевым и высокоэффективным средством для коррекции иммунного статуса животных, тем самым, снижая риск гибели животных от заболеваний различной этиологии.

Технический результат, который может быть достигнут с помощью предлагаемого изобретения, сводится к повышению жизнеспособности и продуктивности животных путем коррекции иммунологической реактивности организма.

Технический результат достигается с помощью способа получения иммуностимулирующего препарата для животных, включающего приготовление стевиозида, при этом стевиозид растворяют в 0,9% физиологическом растворе, полученный раствор добавляют в предварительно измельченный лецитин, затем в полученную смесь постепенно вносят нагретое до 35-40°С оливковое масло и перемешивают, далее производят фильтрование полученного раствора и автоклавирование при температуре 115-120°С в течение 15-20 минут, затем полученный стерильный препарат разливают по флаконам и укупоривают.

Технический результат достигается с помощью иммуностимулирующего препарата для животных, включающий в себя стевиозид, дополнительно содержащий 0,9% физиологический раствор, оливковое масло, лецитин, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Стевиозид	10-30
Физиологический раствор 0,9%	9-11
Лецитин	1-3
Оливковое масло	остальное

Для приготовления иммуностимулирующего препарата для животных в качестве основного действующего вещества был выбран стевиозид. Стевиозид - дитерпеноидный глюкозид, обладающий кардиотоническим, гипогликемическим и иммуностимулирующим действием на организм животных. (Sehar I, and all. «Immune up regulatory response of a non-caloric natural sweetener, stevioside» Chem Biol Interact. 2008 May 28; 173 (2): 115-21. Epub 2008 Jan 31). Физиологический раствор необходим для растворения стевиозида и приготовления эмульсии. Лецитин является доступным и эффективным эмульгатором. Оливковое масло служит средой для приготовления иммуностимулятора и обуславливает пролонгированный эффект препарата на организм животных.

Сущность приготовления иммуностимулирующего препарата для животных заключается в следующем:

10, 20 и 30 (мас.%) стевиозида растворяют в 9-11 (мас.%) 0,9% физиологическом растворе, полученный раствор добавляют в предварительно растертый в ступке лецитин 1-3, затем в полученную смесь постепенно вносят до 100% нагретое до 35-40°С оливковое масло и перемешивают, далее производят фильтрование полученного раствора через бумажный фильтр и автоклавируют при температуре 115-120°С в течение 15-20 минут, полученный стерильный препарат разливают по флаконам и укупоривают, при этом соотношение компонентов в мас.% составляет:

Стевиозид	10-30
Физиологический раствор 0,9%	9-11
Лецитин	1-3
Оливковое масло	остальное

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Примеры конкретного выполнения способа приготовления иммуностимулирующего препарата для животных и иммуностимулирующий препарат на его основе.

Пример 1. 5 (мас.%) стевиозида растворяют в 9 частях 0,9% физиологического раствора, полученный раствор добавляют в предварительно растертый в ступке лецитин, затем в полученную смесь постепенно вносят нагретое до 20°С оливковое масло и перемешивают, далее производят фильтрование полученного раствора и автоклавируют при температуре 80°С в течение 10 минут, полученный препарат разливают по флаконам и укупоривают, при этом соотношение компонентов в мас.% составляет:

Стевиозид	5
Физиологический раствор 0,9%	9
Лецитин	1
Оливковое масло	остальное

При введении препарата животным никаких реакций со стороны иммунной системы не отмечалось, масло, разогретое до 20°С, плохо смешивается с остальными компонентами, автоклавирование при температуре 80°С в течение 10 минут недостаточно, так как в месте введения препарата возникли явные признаки воспаления.

Пример 2. Препарат готовят аналогично примеру № 1, но растворяют 7 (мас.%) стевиозида в 9 миллилитрах 0,9% физиологического раствора, оливковое масло нагревают до 25°С, автоклавируют при температуре 90 в течение 15 минут, при этом соотношение компонентов в мас.% составляет:

Стевиозид	7
Физиологический раствор 0,9%	9
Лецитин	1
Оливковое масло	остальное

При введении препарата животным никакого иммуностимулирующего эффекта не отмечалось, масло разогретое до 25°С, очень медленно смешивается с остальными компонентами, автоклавирование при температуре 90 в течение 15 минут недостаточно, так как в месте введения препарата возникла гиперемия.

Пример 3. Препарат готовят аналогично примеру № 2, но растворяют 10 (мас.%) стевиозида в 10 миллилитрах 0,9% физиологического раствора, оливковое масло нагревают до 35°С, автоклавируют при температуре 115°С в течение 15 минут, при этом соотношение компонентов в мас.% составляет:

Стевиозид	10
Физиологический раствор 0,9%	10
Лецитин	2
Оливковое масло	остальное

Наблюдается выраженное действие препарата на иммунную систему, повышается количество лейкоцитов, не отмечается ни какого отрицательного действия на организм опытных животных. Препарат за счет небольшой концентрации стевиозида удобно применять мелким животным (кошки, собаки, кролики и др.).

Пример 4. Препарат готовят аналогично примеру № 3, но растворяют 20 (мас.%) стевиозида в 10 миллилитрах 0,9% физиологического раствора, оливковое масло нагревают до 35°С, автоклавируют при температуре 120°С в течение 15 минут, при этом соотношение компонентов в мас.% составляет:

Стевиозид	20
Физиологический раствор 0,9%	10
Лецитин	2
Оливковое масло	остальное

Эта концентрация стевиозида и способ приготовления препарата является самой эффективной, так как наблюдается наиболее выраженное действие препарата на иммунную систему, и не отмечается ни какого отрицательного действия на организм опытных животных. Такая концентрация стевиозида в препарате удобна для применения животным среднего размера (овцы, козы, свиньи и др.).

Пример 5. Препарат готовят аналогично примеру № 4, но используют миндальное масло, при этом соотношение компонентов в мас.% составляет:

Стевиозид	20
Физиологический раствор 0,9%	10
Лецитин	2
Миндальное масло	остальное

Отмечена высокая себестоимость препарата за счет дефицитности и дороговизны миндального масла.

Пример 6. Препарат готовят аналогично примеру № 4, но растворяют 30 (мас.%) стевиозида в 11 миллилитрах 0,9% физиологического раствора, оливковое масло нагревают до 40°С, автоклавируют при температуре 120°С в течение 20 минут, при этом соотношение компонентов в мас.% составляет:

Стевиозид	30
Физиологический раствор 0,9%	11
Лецитин	3
Оливковое масло	остальное

Увеличение количества Т- и В-лимфоцитов на фоне безвредности препарата на организм животных, указывает о эффективности и этой концентрации стевиозида. Этот способ приготовления препарата эффективен, но незначительно продолжительный. Такую концентрацию стевиозида целесообразно применять крупным животным (крупный рогатый скот, лошади и др.).

Пример 7. Препарат готовят аналогично примеру № 6, но растворяют 40 (мас.%) стевиозида в 15 миллилитрах 0,9% физиологического раствора, оливковое масло нагревают до 40-50°С, автоклавируют при температуре 120-130°С в течение 25-30 минут, при этом соотношение компонентов в мас.% составляет:

Стевиозид	40
Физиологический раствор 0,9%	15
Лецитин	4
Оливковое масло	остальное

Эта концентрация стевиозида вызвала нарушение биохимических процессов и показала нежелательный эффект на иммунную систему испытуемых животных. Увеличение доли физиологического раствора увеличило размер дисперсионной фазы в эмульсии. Скорость распада эмульсии не уменьшилась за счет увеличения доли эмульгатора. Увеличение температуры, времени автоклавирования и доли эмульгатора увеличили себестоимость продукции.

Пример 8. Препарат готовят аналогично примеру № 7, но растворяют 50 (мас.%) стевиозида в 20 миллилитрах 0,9% физиологического раствора, оливковое масло нагревают до 50-60°С, автоклавируют при температуре 130-140°С в течение 30-40 минут, при этом соотношение компонентов в мас.% составляет:

Стевиозид	50
Физиологический раствор 0,9%	25
Лецитин	5
Оливковое масло	остальное

Гистологические исследования органов опытных животных после применения такой концентрации стевиозида выявили дистрофические изменения печени. Отмечен явный перерасход эмульгатора и физиологического раствора, эмульсия содержит большие капли дисперсионной фазы и быстро распадается на фракции. Время, температура автоклавирования и перерасход эмульгатора повышает себестоимость продукции.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИСПЫТАНИЯ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ

Разработанный препарат был испытан на овцах 9-10 месячного возраста ставропольской породы. Препарат, созданный на основе биологически активного вещества (стевиозид), вводили клинически здоровым овцам внутримышечно в дозе 2 мл на 50 кг живого веса трехкратно через каждые три дня. Кровь для исследований у овец брали из яремной вены на 10 день после последней инъекции препарата. Определяли в крови количество гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов, в сыворотке крови - уровень общего белка, альбумины, - - и -глобулины, а также показатели иммунологической реактивности (содержание Т- и В-лимфоцитов, лизоцимную, фагоцитарную и бактерицидную активность). Результаты испытания препарата на основе стевиозида представлены в таблицах 1, 2, 3 и 4.

Таблица 1
Гематологические показатели крови овец (М±m)
Группа животных	Гемоглобин, г/л	Эритроциты, ×10 12/л	Лейкоциты, ×109/л
Контрольная	107,3±0,6	8,6±0,2	6,4±0,3
Опытная	112,6±1,7	8,7±0,1	8,5±0,3

Исходя из данных, представленных в таблице 1, выявлено увеличение количества лейкоцитов на 33% (8,5±0,3 ×10⁹ /л) у опытных животных, количество гемоглобина и эритроцитов существенно не менялось.

Таблица 2
Биохимические показатели крови овец (М±m)
Группа животных	Общий белок, г/л	Альбумины, г/л	Глобулины, г/л
, г/л	, г/л	, г/л
Контрольная	68,2±1,2	16,9±4,9	13,7±1,8	12,7±2,05	25,1±5,4
Опытная	63,3±1,7	12,3±2,03	13,1±2,9	8,7±1,6	29±4,03

Из данных таблицы 2 видно, что иммуностимулирующий препарат для животных не оказал существенного влияния на такие биохимические показатели, как количество общего белка и -глобулинов. Наблюдалось 13% (29±4,03 г/л) увеличение относительно контрольной группы -глобулинов, на фоне 30% снижения количества -глобулинов (8,7±1,6 г/л) и 27% снижения альбуминов (12,3±2,03 г/л).

Таблица 3
Иммунологические показатели крови овец (М±m)
Группа животных	БАСК, %	ФАСК, %	ЛАСК, %	Т-лим., %	В-лим., %
Контрольная	7,4±0,4	34,6±8,9	17,9±0,5	60,2±2,4	15,8±0,6
Опытная	22,8±1,1	40±5,5	20,3±1,2	79,6±3,6	36,6±3,7

Анализируя иммунологические показатели, представленные в таблице 3, следует отметить рост бактерицидной (БАСК) и лизоцимной (ЛАСК) активности сыворотки крови животных опытной группы на 67% (22,8±1,1%) и 11% (20,3±1,2%), соответственно. Фагоцитарная активность нейтрофилов (ФАСК) по отношению к контрольной группе выросла на 13% (40±5,5%). Относительное количество Т- и В-лимфоцитов в опытной группе возросло на 24% (79,6±3,6%) и 56% (36,6±3,7%), соответственно.

Таблица 4
Продуктивность и сохранность животных (М±m)
Группа животных	Живая масса, кг	Заболеваемость, %	Падеж, %	Получение приплода, гол. в расчете на 10 маток
контрольная	46±2,5	13±0,2	2,8±0,7	11±0,7
опытная	53±1,6	8±0,1	1,3±0,4	13±0,3

Анализируя данные представленные в таблице 4, следует отметить, что в опытной группе животных на 38% снизилась заболеваемость и на 53% гибель животных. После применения препарата на основе стевиозида на 13% возросла живая масса животных и на 15% увеличилась рождаемость.

Исходя из вышеизложенных результатов исследований, можно рекомендовать иммуностимулирующий препарат для животных для применения в ветеринарии, как иммуностимулирующие средство, способное действовать на специфические и не специфические защитные системы организма.

Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:

- повышение жизнеспособности и продуктивности животных за счет коррекции иммунологической реактивности организма;

- низкая себестоимость и экологическая чистота препарата;

- обладает пролонгированным эффектом на организм животных;

- возможность парентерального введения;

- различные концентрации активного вещества.