способ определения аминокислоты фенилаланин в водных растворах пьезосенсором, модифицированным полимером с молекулярным отпечатком

Формула изобретения

Способ определения аминокислоты фенилаланин в водных растворах пьезосенсором, модифицированным полимером с молекулярным отпечатком, включающий отбор проб, модификацию поверхности пьезосенсора нанесением хроматографическим микрошприцем молекулярно импринтированных полимеров коллоксилин + фенилаланин, или полиамидокислота + фенилаланин на пьезосенсор в виде резонатора АТ-среза с номинальной резонансной частотой 2,5 МГц в таком количестве, чтобы после удаления растворителя масса пленки составляла 1,0-2,0 мкг, помещение пьезосенсора на 24 ч в дистиллированную воду для удаления молекулы-шаблона фенилаланина с последующим помещением его в ячейку детектирования на 3-7 мин для стабилизации нулевого сигнала, ввод пробы водного раствора аминокислоты фенилаланин в ячейку детектирования с последующим детектированием путем регистрации аналитического сигнала частотомером в виде резонансной частоты пьезосенсора и оценки относительного сдвига частоты пьезосенсора.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к химии и может использоваться в клинической и лабораторной диагностике физиологически активных веществ, материалов, контроле качества продукции химической и пищевой промышленности.

Наиболее близким к заявляемому устройству является пьезосенсор с серебряными электродами на основе молекулярных отпечатков, используемый как иммуносенсор для проточно-инжекционного определения высоко- и низкомолекулярных органических соединений [Калмыкова Е.Н., Ермолаева Т.Н., Еремин С.А. Разработка проточно-инжекционного анализа высоко- и низкомолекулярных соединений. Вестник МГУ Химия.- 2006 № 20]. Установка для проточно-инжекционного анализа состоит из перистальтического насоса "Gilson", дозатора, проточной ячейки детектирования объемом 15-20 мкл, включающей серийно выпускаемые отечественные пьезокварцевые сенсоры AT-среза с серебряными электродами диаметром 8 мм и собственной частотой колебаний 8-10 МГц, на поверхности которых иммобилизуют иммунореагенты. Сенсоры контактируют одной стороной с анализируемой жидкой фазой. Силиконовые трубки диаметром 0,16 мм соединяют микроячейку с перистальтическим насосом и дозатором. Скорость потока жидкости составляет 30 мкл/мин. В качестве раствора-носителя используют 5-50 мМ фосфатный буфер (рН 6,8; 7,0; 7,2). Изменение частоты колебаний сенсора с интервалом в 1 минуту регистрируют частотомером.

Недостатками являются сложность аппаратурного оформления, наличие множества химических реагентов, низкая селективность, низкие показатели кислото- и термостойкости.

Целью изобретения является упрощение аппаратурного оформления, сокращение количества используемых химических реагентов, повышение селективности, увеличение показателей кислото- и термостойкости.

Указанная цель достигается тем, что в устройстве поверхность пьезосенсора модифицируют полимером с молекулярным отпечатком:

коллоксилин + фенилаланин, или полиамидокислота + фенилаланин.

Способ осуществляется следующим образом.

Подготовка пьезосенсора к работе. При выполнении эксперимента применяли резонаторы AT-среза с номинальной резонансной частотой 2,5 МГц.

Модификация сенсоров. В качестве модификаторов поверхности электродов пьезокварцевых сенсоров используют полимер на основе коллоксилина с молекулярным отпечатком аминокислоты фенилаланин, или полиамидокислоты с молекулярным отпечатком аминокислоты фенилаланин.

Пример 1.

Получение коллоксилина с молекулярным отпечатком фенилаланина (молекулярно-импринтированного полимера на основе коллоксилина).

Получают коллоксилин согласно методике, описанной в [Е.В.Кузнецов, И.П.Прохорова, Д.А.Файзуллина. Альбом технологических схем производства полимеров и пластических масс на их основе. Издание второе, переработанное и дополненное. - М: Химия, 1976 г.].

Вводят молекулы шаблона фенилаланина. Для получения 0,5 г полимера с молекулярными отпечатками 0,045 г (точную навеску) фенилаланина растворяют в 3-5 мл дистиллированной воды, получают раствор А. Готовят смесь этанола и диэтилового эфира в соотношении 1:3 - это раствор В. В раствор В добавляют 0,3 мл раствора А, получают раствор С, при этом раствор С остается прозрачным. Коллоксилин добавляют к раствору С, перемешивают стеклянной палочкой. Образуется вязкий раствор - коллодий. Наносят полимер на пьезосенсор. Электроды пьезосенсоров модифицируют нанесением хроматографическим микрошприцем полимера с молекулярными отпечатками фенилаланина в таком количестве, чтобы после удаления растворителей масса пленки составляла 1,0-2,0 мкг. Затем сенсор помещают на 24 часа в дистиллированную воду для удаления молекулы-шаблона фенилаланина из полимера. После чего сенсор помещают в ячейку детектирования на 3-7 мин для стабилизации нулевого сигнала.

Число анализов без повторной модификации электрода пьезосенсора 10-15 измерений; время анализа, включая стадию регенерации сенсора, не более 15 мин. Данные анализа представлены в таблице 1.

Пример 2.

Получение полимера с молекулярным отпечатком фенилаланина на основе полиамидокислоты (молекулярно-импринтированного полимера на основе полиамидокислоты).

В бюкс помещают фенилаланин в количестве 0.045 г (точная навеска) и растворяют в водно-этанольно-бутанольном растворе (12:5:4). Затем в бюкс добавляют полиамидокислоту. Полученную смесь наносят на пьезосенсор с помощью хроматографического микрошприца. Для удаления молекулы-шаблона из полимера пьезосенсор помещают на 24 часа в дистиллированную воду. Затем сенсор помещают в ячейку детектирования на 3-7 мин для стабилизации нулевого сигнала.

Число анализов без повторной модификации электрода пьезосенсора 20-30 измерений; время анализа, включая стадию регенерации сенсора, не более 15 мин. Данные анализа представлены в таблице 1.

Снижение рабочей частоты колебаний пьезокварцевых сенсоров на объемно-акустических волнах рассчитывают по уравнению Зауэрбрея [Sauerbrey G.G. Messung von plattenschwingungen sehr kleiner amplitude durch lichtstrom-modulation // Z.Phys. - 1964. - Bd. 178. - S. 457-471]:

где m - масса модификатора, г; f₀ - резонансная частота пьезосенсора, МГц;

f - изменение частоты резонатора, Гц; А - площадь поверхности модификатора, см².

Для пьезокварцевых резонаторов с номинальной частотой колебаний 2,5 МГц отклик после модификации составил f_c 2-6 кГц.

Детектирование осуществляют после отбора проб автоматической микропипеткой водного раствора аминокислоты фенилаланин концентраций 1·10^-2 M, 1·10 ^-3 M, 1·10^-4 M, 1·10^-5 M, 1·10^-6 M в ячейку детектирования и регистрируют аналитический сигнал частотомером в виде резонансной частоты сенсора. Вычисляют относительный сдвиг частоты f_a по уравнению:

f_a=f₀-f₁,

где f₀ и f₁ - частоты колебаний сенсора до и после анализа, Гц.

Таблица 1
Примеры осуществления способа с помощью пьезосенсора, модифицированного полимером с молекулярным отпечатком или коллоксилин + фенилаланин, или полиамидокислота + фенилаланин
Модификаторы электродов сенсоров	Соотношение растворителя, об. ч.	Концентрация, M	f, МГц
1	2	3	4
Пример 1
Полимер на основе коллоксилина с молекулярными отпечатками аминокислоты, например фенилаланина	1:3	1·10 -2	235897
1·10-3	196800
1·10-4	131049
1·10-5	65616
1·10 -6	35763
Пример 2
Полимер на основе полиамидокислоты с молекулярными отпечатками аминокислоты, например фенилаланина	12:5:4	1·10-2	235760
1·10-3	196640
1·10-4	130957
1·10-5	65425
1·10-6	35528

Использование предложенного способа позволяет упростить аппаратурное оформление, сократить количество используемых химических реагентов, повысить селективность, увеличить показатели кислото- и термостойкости для полиамидокислоты.