способ прогнозирования возникновения хронической обструктивной болезни легких

Формула изобретения

Способ прогнозирования возникновения хронической обструктивной болезни легких, отличающийся тем, что в крови определяют содержание CD3-CD16+, CD4+CD25+, CD95+, CD45RA+CD4+/CD45RO+CD4+ методом проточной цитофлюориметрии, Интерлейкина-6 (ИЛ-6) в сыворотке крови на анализаторе и при значениях содержания CD3-CD16+ выше 0,18·10³, CD4+CD25+ выше 0,12·10³ , CD95+ выше 0,03·10³, CD45RA+CD4+/CD45RO+CD4+ ниже 1,3, ИЛ-6 выше 2,4 Пкг/мл прогнозируют возникновение заболевания.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, и может быть использовано для прогнозирования возникновения хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).

ХОБЛ - одна из важнейших причин нарушения здоровья и смертности во всем мире. Годами многие люди болеют ХОБЛ, преждевременно умирая от нее или от ее осложнений. ХОБЛ является четвертой причиной смертности в мире, и, как предсказывается, в ближайшие десятилетия будет наблюдаться увеличение распространенности и смертности от нее.

ХОБЛ - заболевание, характеризующееся необратимой обструкцией дыхательных путей. Ограничение скорости воздушного потока является прогрессирующим и связано с патологическим воспалительным ответом легких на патогенные частицы или газы. (Глобальная стратегия диагностики, лечения и профилактики хронической обструктивной болезни легких. Пересмотр 2007 г.)

Известен способ прогнозирования развития хронической обструктивной болезни легких у лиц, не имеющих функциональных признаков бронхиальной обструкции (патент РФ № 2303956, 2007), включающий определение у обследуемого функциональных спирометрических показателей. А также выявление из анамнеза жизни определенных клинических симптомов и факторов риска: признаков одышки, пассивного курения, продуктивного кашля, свистящих хрипов, наличия эпизодов кашля на протяжении более 3-х недель, пола, наличия храпа. Установленным признакам присваивают градации и числовые значения, на основании чего определяют прогностические коэффициенты. Затем числовые характеристики между собой сравнивают и оценивают риск развития ХОБЛ.

Прототипом изобретения является способ прогнозирования развития хронической обструктивной болезни легких среди курящих лиц (патент РФ № 2303957, 2007). У обследуемого определяют функциональные спирометрические показатели, при отсутствии признаков бронхиальной обструкции, определяют клинические симптомы и факторы риска из анамнеза жизни: стаж курения, количество выкуриваемых сигарет в день, наличие одышки или хрипов, степень интенсивности курения и другие показатели. Установленным признакам присваивают градации и числовые значения, на основании чего определяют прогностические коэффициенты. Затем числовые характеристики между собой сравнивают и оценивают риск развития ХОБЛ.

Известно, что табакокурение приводит к изменению как структуры, так и функционирования центральных и периферических дыхательных путей, альвеол и капилляров, а также иммунной системы легких. Вызванные курением изменения в эпителии дыхательных путей включают потерю ресничек, гипертрофию слизистых желез, увеличение количества бокаловидных клеток и увеличение проницаемости, лежащей в основе развития респираторных симптомов.

Механизмом возникновения обструктивного заболевания легких вследствие курения является то, что курение вызывает дисбаланс протеолитической и антипротеолитической функций легких, что, возможно, проявляется деструкцией паренхимы и обструкцией дыхательных путей (Чучалин А.Г. Хронические обструктивные болезни легких, Москва, 2000. - С.338-365).

Задачей изобретения является разработка способа прогнозирования развития хронической обструктивной болезни легких по иммунологическим параметрам.

Технический результат - получение патогенетических маркеров-критериев развития хронической обструктивной болезни легких, повышение точности способа.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом: в крови, взятой натощак из вены, определяют содержание CD3-CD16+, CD4+CD25+, CD95+, CD45RA+CD4+/CD45RO+CD4+, Интерлейкина-6 (ИЛ-6). Исследование популяций и субпопуляций лимфоцитов проводилось методом проточной цитофлюориметрии с использованием моноклональных антител, меченных различными флюорохромами (Карпищенко А.И. Медицинские лабораторные технологии. - Санкт-Петербург: Интермедика, 2002).

Окрашивание клеток проводят по общепринятой методике (Луговская С.А., Почтарь М.Е., Тупицын Н.Н. Иммунофенотипирование в диагностике гемобластозов. - Тверь: Триада, 2005; Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Вопросы современной проточной цитометрии. Клиническое применение. - Челябинск, ЧГМА, 2008).

Процедуру проводят в стандартных одноразовых полипропиленовых пробирках для проточной цитофлуориметрии. На дно каждой пробирки вносят 5 мкл моноклональных антител, добавляют по 100 мкл хорошо перемешанного образца (цельной крови), перемешивают. Инкубируют 20 мин в темноте при комнатной температуре (20-25°С). После инкубации для лизиса эритроцитов в пробирки вносят по 1 мл рабочего лизирующего реагента Cal-lyse (Caltag, Austria), перемешивают и инкубируют 10 мин при комнатной температуре в темноте. Пробирки центрифугируют 5 мин в режиме 1500 об/мин. Удаляют надосадочную жидкость, добавляют 2 мл раствора Cell-WASH для отмывания образца от разрушенных клеток. Осторожно ресуспендируют осадок и центрифугируют 5 мин в режиме 1500 об/мин. Удаляют надосадочную жидкость, осадок клеток ресуспендируют в 0,5 мл раствора Cell-WASH. Полученные образцы анализируют путем сбора не менее 10 ООО событий в проточном цитофлюориметре с использованием программы исследования CellQuest. Результат выражают в процентах клеток, несущих данный антиген. Учитывая показания количества лейкоцитов и состав лейкоцитарной формулы, предварительно полученные на гематологическом анализаторе, рассчитывают абсолютное количество клеток, несущих тот или иной антиген. Уровень ИЛ-6 в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа в анализаторе ACCESS 2 (Beckman Coulter).

При значениях содержания CD3-CD16+выше 0,18·10³ , CD4+CD25+ выше 0,12·10³, CD95+ выше 0,03·10 ³, CD45RA+CD4+/CD45RO+CD4+ ниже 1,3, ИЛ-6 выше 2,4 Пкг/мл прогнозируют развитие ХОБЛ.

Было произведено исследование, в котором в крови здоровых людей (контрольная группа - 30 чел) и больных хронической обструктивной болезнью легких (30 чел), взятой натощак из вены, определяли содержание лейкоцитов, абсолютного числа лимфоцитов (АЧЛ), нейтрофилов (юных, палочкоядерных, сегментоядерных), лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов, базофилов, циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), интерлейкина-6 (ИЛ-6), субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови (CD3+CD16-, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD4+/CD8+, CD19+, CD3-CD16+, CD3+CD16+, CD3-CD8+, CD4+CD25+, CD25+, CD4+95+, CD95+, CD4+HLADR+, HLADR+, CD45RO+CD4+, CD45RA+CD4+, CD45RA+CD4+/CD45RO+CD4+, CD19+CD23+), исследовалась функциональная активность лимфоцитов (спонтанная пролиферация, ответ на PWM, ответ на Конвалин А (СопА), ответ на фитогемагглютинин (ФГА)), апоптоз лимфоцитов, фагоцитоз, метаболическая активность в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тесте), уровень сывороточных иммуноглобулинов.

Выявлены достоверные (р<0,05) различия между контрольной группой и больными хронической обструктивной болезнью легких по следующим показателям: CD3-CD16+, CD4+CD25+, CD95+, CD45RA+CD4+/CD45RO+CD4+, ИЛ-6.

Полученные результаты стали основанием к рекомендации измерения уровня CD3-CD16+, CD4+CD25+, CD95+, CD45RA+CD4+/CD45RO+CD4+, ИЛ-6 у здоровых лиц при наличии риска возникновения ХОБЛ и при значениях: CD3-CD16+ выше 0,18·10³, CD4+CD25+ выше 0,12·10 ³, CD95+ выше 0,03·10³, CD45RA+CD4+/CD45RO+CD4+ ниже 1,3, ИЛ-6 выше 2,4 Пкг/мл прогнозировать возникновение ХОБЛ.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

25.02.2004 к участковому терапевту обратился больной А., 35 лет с жалобами на постоянный кашель с небольшим количеством мокроты.

Объективно: кожные покровы и видимые слизистые физиологической окраски.

Грудная клетка правильной формы.

При пальпации межреберья расширены, экскурсия грудной клетки ограничена, голосовое дрожание ослаблено. При перкуссии грудной клетки - легочный звук, границы легких не расширены.

При аускультации: ослабление дыхательных шумов, рассеянные, единичные сухие хрипы. Частота дыхания - 20 в минуту.

Сердечно-сосудистая система: тоны сердца приглушены. Пульс и частота сердечных сокращений - 80 в минуту.

Печень у края реберной дуги, мягкоэластичная, чувствительная при пальпации, гладкая.

Лабораторные данные: CD3-CD16+1.5·10³, CD4+CD25+-0,32·10 ³, CD95+-0,2·10³, CD45RA+CD4+/CD45RO+CD4+0,14, ИЛ-6 - 2.43 Пкг/мл. Флюорография ОГК: Хронический бронхит.

Выставлен диагноз: Хронический необструктивный бронхит. Исходя из изменений иммунологических показателей, мы прогнозируем возникновение хронической обструктивной болезни легких в будущем.

Через 5 лет данный больной поступает в пульмонологическое отделение с жалобами на постоянный кашель с мокротой желтого цвета, усилившуюся одышку при незначительной физической нагрузке, повышение температуры тела.

Объективно: кожные покровы и видимые слизистые цианотичные.

Набухание шейных вен. Грудная клетка бочкообразной формы.

При пальпации межреберья расширены, экскурсия грудной клетки ограничена, голосовое дрожание ослаблено. При перкуссии грудной клетки - коробочный звук, границы легких расширены.

При аускультации: ослабление дыхательных шумов, разнокалиберные сухие хрипы. Частота дыхания - 26 в минуту.

Сердечно-сосудистая система: тоны сердца приглушены, акцент 2 тона над легочным стволом. Пульс и частота сердечных сокращений - 84 в минуту.

Печень у края реберной дуги, мягкоэластичная, чувствительная при пальпации, гладкая.

Лабораторные данные: CD3-CD16+2.85·10 ³, CD4+CD25+-0,42·10³, CD95+-0,4·10 ³, CD45RA+CD4+/CD45RO+CD4+-1,14, ИЛ-6 - 2.46 Пкг/мл.

Рентгенография ОГК: Хронический обструктивный процесс. Эмфизема легких.

Спирография: Значительное снижение ЖЕЛ. Умеренная обструкция дистальных бронхов. ОФВ1 - 55,44%, ЖЕЛ - 45%, ФЖЕЛ - 61%. Значительное нарушение в состоянии аппарата вентиляции.

ФБС: Субатрофический эндобронхит.

Выставлен диагноз: Хроническая обструктивная болезнь легких, средней степени тяжести, стадия обострения.

Наш прогноз подтвердился

Пример 2. 12.10.2002 в поликлинику обратился Больной П., 45 лет с жалобами на постоянный кашель, больше с утра, с незначительным количеством мокроты.

Объективно: кожные покровы бледно-розового цвета.

Относительно горизонтальное направление ребер, бочкообразная грудная клетка.

Число дыхательных движений в покое 20 в минуту.

При пальпации грудной клетки - резистентность, расширение межреберных промежутков. При перкуссии легких - коробочный звук, голосовое дрожание ослаблено.

Аускультация: ослабление дыхательных шумов, сухие хрипы во время форсированного выдоха.

Сердечные тоны ритмичные, приглушены.

При пальпации органов брюшной полости: печень выступает из-под края реберной дуги на 1,5 см, чувствительная, с гладкой поверхностью.

Лабораторные данные: CD3-CD16+-1,4·10³, CD4+CD25+-0,27·10 ³, CD95+-0,29·10³, CD45RA+CD4+/CD45RO+CD4+0,2, ИЛ-6 - 2.51 Пкг/мл).

Рентгенография: Хронический бронхит.

Спирография ОФВ1 87%, ЖЕЛ 90%.

Стаж курения - 20 лет.

Выставлен диагноз: Хронический необструктивный бронхит.

Мы прогнозируем возникновение у пациента через несколько лет ХОБЛ.

В 2009 году тот же пациент поступает в терапевтическое отделение с жалобами на кашель с мокротой белого цвета, одышку при незначительной физической нагрузке, чувство заложенности в груди.

1 месяц назад усилился кашель, увеличилось количество мокроты, усилилась одышка (при незначительной физической нагрузке), общая слабость, чувство стеснения в грудной клетке, возникающее при физической нагрузке.

Объективно: цианотическое окрашивание слизистых оболочек.

Относительно горизонтальное направление ребер, бочкообразная грудная клетка.

Число дыхательных движений в покое 22 в минуту.

Отек до верхней трети голеней (признак правожелудочковой недостаточности).

При пальпации грудной клетки - резистентность, расширение межреберных промежутков, равномерное, но ограниченное участие в акте дыхания. При перкуссии легких - коробочный звук, голосовое дрожание ослаблено.

Аускультация: ослабление дыхательных шумов, сухие хрипы во время спокойного дыхания (дистанционные хрипы).

Сердечные тоны ослаблены.

При пальпации органов брюшной полости: печень выступает из-под края реберной дуги на 1,5 см, чувствительная, с гладкой поверхностью.

Лабораторные данные: CD3-CD16+-2.36·10³ , CD4+CD25+-0,57·10³, CD95+-0,79·10 ³, CD45RA+CD4+/CD45RO+CD4+-1,2, ИЛ-6 - 2.51 Пкг/мл).

Рентгенография: легочный рисунок усилен, деформирован. Корни легких фиброзно изменены, тяжистые. Диафрагма ограничена в подвижности. Заключение: Хронический бронхит. Пневмосклероз.

Спирография - крайне резкое снижение ЖЕЛ, крайне резкие нарушения проходимости дыхательных путей. ЖЕЛ - 50%, ФЖЕЛ - 55%, ОФВ1 - 50%.

Выставлен диагноз: Хроническая обструктивная болезнь легких тяжелой степени тяжести, стадия обострения.

Наш прогноз подтвердился.