способ выявления специфических антител к вирусу гриппа типа а у птиц

Формула изобретения

1. Способ выявления специфических антител (AT) к вирусу гриппа типа А у птиц, включающий исследование биоматериала от птицы в реакции задержки гемагглютинации (РЗГА), отличающийся тем, что в качестве биоматериала используют желток яйца птицы.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученный в РЗГА титр AT в желтке яйца пересчитывают в эквивалент титра AT в сыворотке крови с использованием коэффициента пересчета: 1,66 - для кур, 1,55 - для уток, при условии, что для исследования птицы использовали желток яйца 1-2-дневной кладки.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, эпизоотологии, а именно к способам выявления специфических антител [AT] к вирусу гриппа [ВГ] типа A у птиц.

Известны способы выявления специфических AT к ВГ в сыворотке крови птицы с использованием тестов реакции задержки гемагглютинации [РЗГА] (Kilbourne, E.D. 1987. Influenza. Plenum Press, New York) и иммуноферментного анализа [ИФА] (Snyder, D.B., W.W.Marquardt, F.S.Yancey, P.K.Savage. 1985. An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibody against avian influenza virus. Avian Dis. 29:136-44).

Однако данные тесты не позволяют проводить обнаружение AT к ВГ в желтке яйца.

Наиболее близким в техническом отношении и принятым за прототип является способ обнаружения AT к вирусу Ньюкаслской болезни птиц в желтке яйца с использованием тестов РЗГА и ИФА (Czifra G, М Nilsson, D.J.Alexander, R.Manvell, S.Kecskemeti, B.E.Engstrom. Detection of PMV-1 specific antibodies with a monoclonal antibody blocking enzyme-linked immunosorbent assay. Avian Pathol. 1996 Dec; 25(4): 691-703). Авторами показана устойчивая корреляция титра AT к вирусу Ньюкаслской болезни в желтке яйца с титром AT в сыворотке крови птицы.

Однако данные тесты не позволяют выявлять AT к ВГ птиц.

Задачей заявляемого решения является расширение арсенала диагностических методов для выявления специфических антител к вирусу гриппа у птиц.

Поставленная задача решается тем, что в способе выявления специфических антител к вирусу гриппа типа A у птиц, включающем исследование биоматериала от птицы в РЗГА, в качестве биоматериала используют желток яйца птицы.

Сущность изобретения заключается также в том, что полученный в РЗГА титр AT в желтке яйца пересчитывают в эквивалент титра AT в сыворотке крови с использованием коэффициента пересчета: 1,66 - для кур, 1,55 - для уток, при условии, что для исследования птицы использовали желток яйца 1-2-дневной кладки.

Способ осуществляют следующим образом.

Материал: 1-2-суточные яйца диких уток и гусей, кур. Для исследования использовали желток яиц.

Отбор материала: из гнезда/кладки отбирают 1-2 суточные яйца (с чистой скорлупой).

Подготовка проб желтка: желток яйца смешивают с фосфатно-солевым буфером [ФСБ] 0,01M pH 7,2 в соотношении 1:10.

Для постановки РЗГА реакцию проводят по следующему протоколу:

- в первую колонку лунок на планшете вносят по 0,5 мл смеси испытуемых проб 1:10 с ФСБ;

- в остальные лунки планшета вносят по 0,25 мл ФСБ;

- готовят последовательные двукратные разведения желтка яиц 1:20, 1:40 до 1:2660, путем перенесения 0,25 мл суспензии желтка из предыдущей лунки в последующую с предварительным ресуспендированием, 0,25 мл из последней лунки утилизируют;

- добавляют во все лунки 0,25 мл смеси, содержащей по 4 ГАЕ антигена ВГ. Дозу антигена 4 ГАЕ рассчитывают и контролируют по методике, описанной в «Методических указаниях по лабораторной диагностике болезни Ньюкасла и классической чумы птиц (гриппа птиц) - г.Покров, 1972». По данной же методике проводят контроль спонтанной агглютинации эритроцитов и контроль желтка на агглютинацию;

- встряхивают;

- экспозиция 30 минут при 18-22°C;

- добавляют во все лунки по 0,5 мл 1%-ной взвеси куриных/утиных эритроцитов;

- встряхивают;

- экспозиция при 18-22°C;

- учет реакции через 30,40 и 45 минут;

- за титр AT принимают максимальное разведение желтка яиц, которое обеспечило отсутствие агглютинации.

Для иллюстрации способа и обоснования расчета коэффициента пересчета титра AT в желтке яйца в титр AT в сыворотке крови приведены примеры:

Пример 1

Для оценки уровня корреляции титров антител в сыворотке крови и желтке яйца был проведен опыт. Для этого коммерческой вакциной против гриппа птиц типа A было однократно привито 20 домашних уток 2-3-летнего возраста и 20 кур-несушек. Через 25 дней после вакцинации от птиц, содержащихся изолированно, отобрали по одному 1-2-дневному яйцу (известно, что с возрастом яйца титр AT в его желтке снижается). Полученные пробы исследовали в РЗГА. Результаты исследований приведены в таблице 1.

Расчеты статистических величин проводили с использованием программы Microsoft Excel 2002.

Из данных, представленных в таблице 1, можно заключить, что AT к ВГ в желтке яйца обнаруживали во всех случаях их обнаружения в сыворотке крови, кроме тех случаев, когда титр AT в сыворотке крови был 2log₂ и ниже. Данная закономерность подтверждена расчетом показателей коэффициентов корреляции содержания AT к ВГ в сыворотке крови и желтке яйца для кур и уток, равных 0,92 и 0,94 соответственно. Для определения коэффициентов пересчета содержания AT в желтке яйца в титр AT в сыворотке крови рассчитаны средние арифметические величины и определена достоверность их разницы на основании критерия Стьюдента. Коэффициентом пересчета принято частное титра AT в сыворотке крови и титра AT в желтке яйца: 1,66 - для кур и 1,55 - для уток.

Приведенные результаты исследований показывают, что использование желтка яйца в качестве биоматериала для выявления содержания у домашних кур и уток AT, специфических к ВГ, воспроизводит результаты серологического исследования птиц с использованием в качестве материала сыворотки крови.

Пример 2

Для проведения исследований в Чановской озерной системе НСО было отловлено 100 особей птиц рода (Anas) речные утки: 35 - вида Кряква, 25 - Шилохвость, 20 - Чирок-свистунок, 15 - Серый гусь, 5 - Свиязь. Отлов проводили при взлете с гнездовья, с последующим отбором у птиц проб крови и 1-2-дневного яйца из кладки. Сыворотку крови и желток яиц исследовали в РЗГА на наличие антител к ВГ типа А. Из 100 исследованных в РЗГА птиц антитела к гриппу в сыворотке крови выделили у 9 особей, желтки 8 яиц, добытых из кладки, этих птиц содержали антигемагглютинины [аГА]. Результаты исследований приведены в таблице 2.

Данные, представленные в таблице 2, подтверждают полученный ранее коэффициент корреляции титров AT к ВГ в сыворотке крови и желтке яйца - 0,94, а также коэффициент пересчета титра AT к ВГ типа A в желтке яйца в титр AT в сыворотке крови - 1,54; следовательно, и то, что использование желтка яйца в качестве биоматериала для выявления содержания у птиц AT, специфических к ВГ, воспроизводит результаты серологического исследования диких уток с использованием в качестве материала сыворотки крови.

Таблица 2
Корреляция титра специфических AT к вирусу гриппа типа A в желтке яиц и сыворотке крови птиц рода (Anas) речные утки
вид материала	номер птицы	среднее арифметическое, M±m*	коэффициент корреляции титра AT в сыворотке крови и желтке яйца, r	коэффициент пересчета титра AT в желтке в титр AT в сыворотке крови
1	2	3	4	5	6	7	8	9
титр антител log2
сыворотка крови	5	2	3	5	7	6	5	4	3	4,44±0,53	0,94	1,54
желток яиц	4	-	2	3	5	4	3	3	2	2,89±0,48
Примечание: (-) - антигемагглютинины в исследованном материале не выявлены;
* - разница средних величин достоверна (Р<0,05).