способ прогнозирования эффективности агониста rar-

Формула изобретения

1. Способ прогнозирования терапевтического эффекта агониста RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405007/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> на злокачественную опухоль, который включает этапы измерения уровня экспрессии класса молекулы семейства р160 и уровня экспрессии класса молекулы семейства SP110 в злокачественной опухоли пациента и оценку соотношения между указанными уровнями экспрессии, при котором в образце, взятом из злокачественной опухоли пациента, измеряют уровни экспрессии AIB1 и SP110b, и если соотношение уровней экспрессии (уровень экспрессии AIB1/уровень экспрессии SP110b) превышает 0,240, то считают, что агонист RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405007/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> эффективен в терапевтическом лечении злокачественной опухоли пациента.

2. Способ прогнозирования терапевтического эффекта агониста RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405007/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> на злокачественную опухоль, который включает этапы измерения уровня экспрессии класса молекулы семейства р160 и уровня экспрессии класса молекулы семейства SP110 в злокачественной опухоли пациента и изучение баланса между указанными уровнями экспрессии, при котором в образце, взятом из злокачественной опухоли пациента, измеряют уровни экспрессии SRC-1 и SP110b, и если соотношение уровней экспрессии (уровень экспрессии SRC-1/уровень экспрессии SP110b) превышает 0,662, то считают, что агонист RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405007/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> эффективен в терапевтическом лечении злокачественной опухоли пациента.

3. Способ прогнозирования терапевтического эффекта агониста RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405007/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> на злокачественную опухоль, который включает этапы измерения уровня экспрессии класса молекулы семейства р160 и уровня экспрессии класса молекулы семейства SP110 в злокачественной опухоли пациента и изучение баланса между указанными уровнями экспрессии, при котором в образце, взятом из злокачественной опухоли пациента, измеряют уровни экспрессии TIF2 и SP110b, и если соотношение уровней экспрессии (уровень экспрессии TIF2/уровень экспрессии SP110b) превышает 0,141, то считают, что агонист RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405007/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> эффективен в терапевтическом лечении злокачественной опухоли пациента.

4. Способ по любому из пп.1-3, при котором злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль, выбранную из группы, состоящей из солидного рака: рака печени, рака легких, рака желудка, колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака матки, рака яичников, рака молочной железы и рака простаты, и рака крови: лейкоза, лимфомы и миеломы.

5. Способ по п.4, при котором злокачественная опухоль представляет собой рак печени.

6. Способ по п.5, при котором злокачественная опухоль представляет собой гепатоцеллюлярную карциному.

7. Способ по любому из пп.1-3, в котором агонист RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405007/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> представляет собой 4[3,5-бис(триметилсилил)бензамидо]бензойную кислоту.

8. Способ терапевтического лечения злокачественной опухоли, который содержит

(а) этап забора образца злокачественной опухоли у онкологического больного,

(б) измерение в образце уровня экспрессии класса молекулы семейства р160 и уровня экспрессии класса молекулы семейства SP110, и

(с) изучение баланса между уровнем экспрессии класса молекулы семейства р160 и уровнем экспрессии класса молекулы семейства SP110 и введение пациенту агониста RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405007/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , если преобладает класс молекул семейства p160,

при котором в образце, взятом из злокачественной опухоли пациента, измеряют уровни экспрессии AIB1 и SP110b, и если соотношение уровней экспрессии (уровень экспрессии AIB1/уровень экспрессии SP110b) превышает 0,240, то считают, что агонист RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405007/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> эффективен в терапевтическом лечении злокачественной опухоли пациента.

9. Способ терапевтического лечения злокачественной опухоли, который содержит

(а) этап забора образца злокачественной опухоли у онкологического больного,

(б) измерение в образце уровня экспрессии класса молекулы семейства р160 и уровня экспрессии класса молекулы семейства SP110, и

(с) изучение баланса между уровнем экспрессии класса молекулы семейства р160 и уровнем экспрессии класса молекулы семейства SP110 и введение пациенту агониста RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405007/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , если преобладает класс молекул семейства р160,

при котором в образце, взятом из злокачественной опухоли пациента, измеряют уровни экспрессии SRC-1 и SP110b, и если соотношение уровней экспрессии (уровень экспрессии SRC-1/уровень экспрессии SP110b) превышает 0,662, то считают, что агонист RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405007/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> эффективен в терапевтическом лечении злокачественной опухоли пациента.

10. Способ терапевтического лечения злокачественной опухоли, который содержит

(а) этап забора образца злокачественной опухоли у онкологического больного,

(б) измерение в образце уровня экспрессии класса молекулы семейства р160 и уровня экспрессии класса молекулы семейства SP110, и

(с) изучение баланса между уровнем экспрессии класса молекулы семейства р160 и уровнем экспрессии класса молекулы семейства SP110 и введение пациенту агониста RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405007/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , если преобладает класс молекул семейства р160,

при котором в образце, взятом из злокачественной опухоли пациента, измеряют уровни экспрессии TIF2 и SP110b, и если соотношение уровней экспрессии (уровень экспрессии Т1Р2/уровень экспрессии SP110b) превышает 0,141, то считают, что агонист RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405007/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> эффективен в терапевтическом лечении злокачественной опухоли пациента.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу прогнозирования эффективности агониста RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> у онкологических больных. В частности, настоящее изобретение относится к способу удобного и точного прогнозирования терапевтического эффекта агониста RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> у пациентов со злокачественной опухолью, такой как рак печени.

Уровень техники

Рак печени представляет собой высокозлокачественную опухоль, от которой ежегодно умирает один миллион пациентов. По числу больных этот рак занимает пятое место в мире (El-Serag H.B. and Mason A.C. Rising incidence of hepatocellular carcinoma in the United States., N. Engl. J. Med., 340, pp.745-750, 1999; Taylor-Robinson S.D., Foster G.R., Arora S., Hargreaves S. and Thomas H.C. Increase in primary liver cancer in the UK, 1979-94, Lancet, 350, pp.1142-1143, 1997).

Считается, что рак печени обусловлен большим числом раковых клеток, которые одновременно или последовательно появляются на отдельных участках вследствие воздействия на печень вирусами гепатита или алкоголем (Slaughter D.P., Southwick H.W., Smejkal W. «Field cancerization» in oral stratified squamous epithelium: Clinical implications of multicentric origin, Cancer, 6, pp.963-968, 1953). Считается, что в Японии рак печени в основном вызывается инфицированием вирусом гепатита С. Поскольку вирус гепатита С не может быть устранен, с большой степенью вероятности рак будет давать рецидивы несмотря на то, что раковые клетки на время можно удалить или уничтожить. За период с 1990 по 1997 сообщалось о частоте рецидивов от 16 до 29% (Liver cancer, I Changes in number of patients, 3. Counting method of number of patients, Trend of cancer patients and current conditions for therapies, Medical Research, pp.20-30, 2001].

К способам лечения рака печени относятся гепатэктомия видимых участков поражения, радиочастотная абляция, лечение введением этанола, микроволновая коагулонекротическая терапия и тому подобное. Однако эти способы лечения не всегда эффективны, и в качестве системного лечения желательна химиотерапия.

В настоящее время для лечения запущенной формы рака, для которого неприемлемы вышеупомянутые способы лечения или чрескатетерная артериальная эмболизация, а злокачественные образования рецидивируют после лечения этими способами, в качестве химиотерапии проводят внутриартериальное введение CDDP, ADM и 5-FU. Однако сообщается, что эффективность внутриартериального введения химиотерапевтических препаратов для печени, использующих сочетание масляной контрастной среды, липиодола и вышеперечисленных лекарственных препаратов, должна составлять 13,0% полного ответа и 30,0% частичного ответа и что эффективность химиотерапевтических препаратов, в которых не используют в сочетании чрескатетерную артериальную эмболизацию или липиодол, должна составлять 2,5% полного ответа и 3,1% частичного ответа, такие результаты лечения полностью не удовлетворяют. Более того, эти комбинированные способы лечения приводят к появлению осложнений, таких как язва и тому подобное (Tanigawa H., Local therapies and intra-arterial injection therapies, Japanese Journal of Cancer Clinics, 40, pp.1490-1497, 1994).

Как описано выше, не известно какого-либо стандартного лечения, которое в известной мере гарантировало бы устойчивые результаты лечения рака печени. В частности, лечение внутриартериальным введением технически трудно осуществимо и затруднительно для пациентов, и поэтому для лечения желательна разработка альтернативной химиотерапии. Кроме того, из-за сильной устойчивости рака печени к химиотерапии считается недостижимым даже такое терапевтическое лечение, которое направленное на временную стабилизацию опухоли, т.е. продление жизни без пролиферации опухолевых клеток. Поэтому также крайне желательна разработка химиотерапии, с помощью которой можно было бы добиться консервации опухоли.

4-[3,5-бис(триметилсилил)бензамидо]бензойная кислота (в дальнейшем в описании также обозначаемая как «ТАС-101») представляет собой синтетический ретиноид, представленный формулой (1), представленной ниже. Известно, что данное соединение можно использовать в качестве лекарственного средства для лечения рака, индуктора дифференцировки раковых клеток, ингибитора метастазирования, лекарственного средства для лечения заболеваний сосудов или лекарственного средства, применяемого при гипертрофии сердца (патент Японии, открытая публикация (Kokai) № 2-247185, международные патентные публикации WO96/32101 и WO03/089005 и тому подобное).

, патент № 2405447" SRC="" height=100 BORDER="0">

ТАС-101 представляет собой агонист RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , который способен связываться с рецептором ретиноевой кислоты подтипа , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> (в дальнейшем также обозначаемым как «RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> »), который является фактором транскрипции, принадлежащим к семейству ядерных рецепторов, для активации транскрипции посредством этого рецептора, и путем активации транскрипции оказывает противоопухолевое действие. Известно, что у пациентов с раком печени увеличивается экспрессия RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> (Clin. Cancer Res., 9, pp.3679-3683, 2003), и в фармакологических исследованиях с использованием модели рака печени на животных наблюдали противоопухолевую активность ТАС-101 (Clin. Exp. Metastasis. 16, pp.633-643, 1998; Clin. Exp. Metastasis. 16, pp.323-331, 1998; J. Cancer Res., 90, pp.1254-1261, 1999). Относительно клинического воздействия ТАС-101 на рак печени человека в 11 фазу исследования в Соединенных Штатах было обнаружено предотвращение прогрессирования опухоли в 43%.

Известно, что для активации RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> требуется связывание молекулы лиганда, такой как ретиноевая кислота. Ядерный рецептор, активированный связыванием лиганда, связывается с последовательностью ДНК-мишени для инициации трансляции ДНК. ДНК связывается с гистоном с образованием структуры хроматина, а для активации транскрипции существенно важно изменение в структуре хроматина путем ацетилирования гистона. Коактиваторами, которые усиливают активацию транскрипции RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , являются гистоновые ацетилазы как таковые, которые необходимы для ацетилирования гистона или класса молекул, отвечающих за привлечение гистоновых ацетилаз к сайту активации транскрипции. В основном их относят к классу молекул семейства р300, которые обычно выполняют роль каркаса (Curr. Biol., 7(9), pp.689-692, 1997), и к классу молекул семейства р160, которые выполняют роль последних (Mol. Endocrinol., 17(9), pp.1681-1692, 2003). Эти классы коактивирующих молекул усиливают активность транскрипции. Известно, что AIB1 (умножающийся в злокачественных опухолях молочной железы 1), один из классов молекул семейства р160, является одним из коактиваторов стероидных рецепторов, сверхэкспрессируемым в клетках рака молочной железы, и его можно использовать в диагностике гормонозависимого стероидного рака (международная патентная публикация WO98/57982). Известно также, что данную молекулу можно использовать для прогнозирования рака простаты и прогнозирования чувствительности рака молочной железы к тамоксифену (международные патентные публикации WO02/10452, WO03/189, WO03/89904 и тому подобные). SRC-1 (коактиватор стероидных рецепторов-1) также является одним из коактиваторов стероидных рецепторов, и известно, что его можно использовать в терапевтическом лечении заболеваний, ассоциированных с активностью стероидных рецепторов (международная патентная публикация WO97/10337). Более того, известно, что TIF2 (фактор инициации трансляции 2) также является фактором, который подобным же образом действует на сайт AF-2 ядерного рецептора, как и коактиватор стероидных рецепторов, усиливая лигандозависимую транскрипционную активацию (EMBO J., Jul 15, pp.3667-3675, 1996).

Также известно о существовании класса молекул-корепрессоров, которые ингибируют активность транскрипции RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> . Многие из этих молекул обладают активностью гистоновой деацетилазы и подавляют трансляцию ДНК, через ядерные рецепторы способствуя хроматинизации гистона (White J.H., et al., Vitam. Horm., 68, pp.123-143, 2004). Недавно сообщалось, что класс молекул семейства SP110, экспрессируемых в гепатоцеллюлярной карциноме, представляет собой RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -избирательные корепрессоры (Watashi K., et al, Mol. Cell Biol., 23(21), pp.7498-7509, 2003). Считается, что механизм транскрипционной активации, модулируемый ядерными рецепторами, регулируется балансом этих коактиваторов и корепрессоров. Кроме того, в Международной патентной публикации WO02/8383 описывается выделение класса молекул семейства SP110, включая SP110b, и известно, что их можно использовать в диагностике первичного билиарного цирроза (РВС).

Описание изобретения

Задачи, решаемые изобретением

Целью настоящего изобретения является предложение способа определения эффективности агониста RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , такого как ТАС-101, у пациентов со злокачественной опухолью, такой как рак печени. В частности, целью настоящего изобретения является предложение способа удобного и точного прогнозирования терапевтического эффекта агониста RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> на злокачественную опухоль, такую как рак печени.

Способы решения проблемы

Для достижения вышеуказанной цели авторы настоящего изобретения провели множество исследований, в результате которых они первыми обнаружили, что агонист RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , такой как ТАС-101, в отсутствие экспрессии RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> оказался неэффективным при раке печени, в то время как интенсивность экспрессии RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> необязательно коррелировала со степенью функционирования транскрипционной регуляции, и что не было четкого соответствия между противоопухолевой активностью агониста RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> на рак печени и экспрессией RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> . Они также обнаружили, что хотя класс молекул семейства р160, таких как AIB1, SRC-1 и TIF2 прямо коррелирует с активностью транскрипции RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , индуцированной агонистом RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , а экспрессия SP110b как избирательного корепрессора RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> обратно коррелирует с активностью транскрипции RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , индуцированной агонистом RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , между классами молекул-коактиваторов уровни экспрессии этих коактиваторов и корепрессора варьировали в индивидуальных раковых клетках, и, таким образом, было затруднительно использовать эти уровни в качестве маркера для определения эффективности агониста RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> при раке печени.

Авторы настоящего изобретения на основе этих обнаружений провели дополнительные исследования. В результате они обнаружили, что соотношение уровней экспрессии класса молекулы семейства р160 в качестве коактиватора и класса молекулы семейства SP110 в качестве корепрессора давало заметно более высокую корреляцию с активацией транскрипции RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , индуцированной агонистом RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> . Настоящее изобретение было построено на основе вышеуказанных находок.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к способу прогнозирования терапевтического эффекта агониста RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> на злокачественную опухоль, который содержит этапы измерения уровня экспрессии класса молекулы семейства р160 и уровня экспрессии класса молекулы семейства SP110 в злокачественной опухоли пациента и изучения баланса между указанными уровнями экспрессии.

Настоящее изобретение также относится к способу прогнозирования терапевтического эффекта агониста RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> на злокачественную опухоль, который содержит этапы измерения уровня экспрессии класса молекулы семейства р160 и уровня экспрессии класса молекулы семейства SP110 в злокачественной опухоли пациента, изучения баланса между указанными уровнем экспрессии класса молекулы семейства р160 и уровнем экспрессии класса молекулы семейства SP110, и, если преобладает класс молекулы семейства р160, определения, что агонист RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> эффективен в терапевтическом лечении злокачественной опухоли пациента.

В качестве предпочтительных вариантов осуществления изобретение относится к вышеуказанному способу, в котором из класса молекул семейства р160 измеряют уровень экспрессии AIB1, SRC-1 или TIF2; вышеуказанному способу, в котором в качестве класса молекул семейства SP110 измеряют уровень экспрессии SP110b; к вышеуказанному способу, в котором злокачественная опухоль представляет собой рак печени; и к вышеуказанному способу, в котором агонистом RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> является 4-[3,5-бис(триметилсилил)бензамидо]бензойная кислота. Настоящее изобретение также относится к вышеуказанному способу, который включает этап измерения маркера крови, уровень которого изменяется в зависимости от баланса между уровнем экспрессии класса молекулы семейства р160 и уровнем экспрессии класса молекулы семейства SP110.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору, содержащему комбинацию реагентов для измерения уровня экспрессии класса молекулы семейства р160 и уровня экспрессии класса молекулы семейства SP110 в образце, взятом из злокачественной опухоли пациента.

В дополнительных аспектах настоящее изобретение относится к способу терапевтического лечения злокачественной опухоли, который включает:

(а) этап сбора материала злокачественной опухоли от онкологического больного,

(б) измерение уровня экспрессии класса молекулы семейства р160 и уровня экспрессии класса молекулы семейства SP110 в образце, и

(в) изучение баланса между уровнем экспрессии класса молекулы семейства р160 и уровнем экспрессии класса молекулы семейства SP110 и, если преобладает класс молекулы семейства р160, введение пациенту агониста RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ; и лекарственный препарат для терапевтического лечения злокачественной опухоли, который в качестве действующего вещества содержит агонист RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> и вводится, если у пациента в балансе между уровнем экспрессии класса молекулы семейства р160 и уровнем экспрессии класса молекулы семейства SP110 преобладает класс молекулы семейства р160.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. На фиг.1 показаны результаты изучения экспрессии AIB1, одного из классов молекул семейства р160, в устойчивых клеточных линиях гепатоцеллюлярной карциномы, полученных от человека.

Фиг.2. На фиг.2 показаны результаты изучения экспрессии SRC-1, одного из классов молекул семейства р160, в устойчивых клеточных линиях гепатоцеллюлярной карциномы, полученных от человека.

Фиг.3. На фиг.3 показаны результаты изучения экспрессии TIF2, одного из классов молекул семейства р160, в устойчивых клеточных линиях гепатоцеллюлярной карциномы, полученных от человека.

Фиг.4. На фиг.4 показаны результаты изучения экспрессии SP110b, одного из классов молекул семейства SP110, в устойчивых клеточных линиях гепатоцеллюлярной карциномы, полученных от человека.

Наилучший вариант осуществления изобретения

Способ по настоящему изобретению представляет собой способ прогнозирования терапевтического эффекта агониста RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> на злокачественную опухоль, отличающийся измерением уровня экспрессии класса молекулы семейства р160 в качестве коактиватора, который усиливает активацию транскрипции RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , и уровня экспрессии класса молекулы семейства SP110 в качестве корепрессора, который ингибирует активацию транскрипции RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> в злокачественной опухоли пациента, и изучением баланса между этими уровнями экспрессии. Кроме того, способ по настоящему изобретению отличается наличием этапов измерения уровня экспрессии класса молекулы семейства р160 и уровня экспрессии класса молекулы семейства SP110 в злокачественной опухоли пациента, изучения баланса между уровнем экспрессии класса молекулы семейства р160 и уровнем экспрессии класса молекулы семейства SP110 и, если преобладает класс молекул семейства р160, определения того, что агонист RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> эффективен в терапевтическом лечении злокачественной опухоли у пациента.

Терапевтический эффект упоминаемого в настоящем изобретении агониста RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> включает эффекты разрушения и устранения опухоли или стабилизации опухоли в первичной опухоли, а также эффекты профилактики рецидива, метастаза и повторения опухоли.

Примерами класса молекул семейства р160 являются AIB1, SRC-1, TIF2 и тому подобные. В способе по настоящему изобретению предпочтительно измеряют уровень экспрессии AIB1. Известно, что AIB1 действует как коактиватор стероидных рецепторов и тому подобного, и его можно использовать для предсказания прогноза гепатоцеллюлярной карциномы (Cancer, 95(11), pp.2346-2352, 2002). Поэтому специалист в данной области может легко измерить уровень экспрессии AIB1. Кроме того, также известно, что SRC-1 и TIF2 действуют как коактиваторы стероидных рецепторов и тому подобного, и специалист в данной области может легко измерить уровни экспрессии SRC-1 и TIF2 (Международная патентная публикация WO97/10337).

Примерами класса молекул семейства SP110 являются SP110b и тому подобные. Известно, что SP110b является RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -избирательным корепрессором (Hijikata W.k. et al., Mol. Endocrinol., 17(9), pp.1681-1692, 2003), и специалист в данной области может легко измерить уровень экспрессии SP110b.

В описании изобретения выражение «изучение баланса между уровнем экспрессии класса молекулы семейства р160 и уровнем экспрессии класса молекулы семейства SP110» относится, например, к измерению в образце уровней экспрессии каждого класса молекулы и изучению соотношения этих уровней экспрессии (коактиватор/корепрессор, т.е. уровень экспрессии класса молекулы семейства р160/ уровень экспрессии класса молекулы семейства SP110). В описании изобретения выражение, что «преобладает класс молекул семейства р160» означает, например, что если сравнивают уровень экспрессии класса молекулы семейства р160 и уровень экспрессии класса молекулы семейства SP110, рассматривают уровень экспрессии класса молекулы семейства р160 для того, чтобы значительно повысить активность транскрипции RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> . Например, если используют сочетание AIB1 и SP110b, то измеряют их уровни экспрессии в образце, взятом из злокачественной опухоли пациента, и затем рассчитывают соотношение уровней экспрессии (уровень экспрессии AIB1/уровень экспрессии SP110b). Если соотношение превышает 0,05, предпочтительно 0,1, считают, что преобладает класс молекулы семейства р160, и агонист RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> эффективен в терапевтическом лечении злокачественной опухоли пациента. Если используют сочетание SRC-1 и SP110b, то измеряют их уровни экспрессии в образце, взятом из злокачественной опухоли пациента, и затем рассчитывают соотношение уровней экспрессии (уровень экспрессии SRC-1/уровень экспрессии SP110b). Если соотношение превышает 0,3, предпочтительно 0,5, считают, что преобладает класс молекулы семейства р160, и агонист RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> эффективен в терапевтическом лечении злокачественной опухоли пациента. Если используют сочетание TIF2 и SP110b, то измеряют их уровни экспрессии в образце, взятом из злокачественной опухоли пациента, и затем рассчитывают соотношение уровней экспрессии (уровень экспрессии TIF2/уровень экспрессии SP110b). Если соотношение превышает 0,1, предпочтительно 0,12, считают, что преобладает класс молекулы семейства р160, и агонист RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> эффективен в терапевтическом лечении злокачественной опухоли пациента.

Тип злокачественной опухоли в качестве объекта определения по способу настоящего изобретения конкретно не ограничен. Примеры включают злокачественные опухоли, выбранные из группы, состоящей из солидного рака, например, рака печени, рака легких, рака желудка, колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака матки, рака яичников, рака молочной железы и рака простаты, и рака крови, например, лейкоза, лимфомы и миеломы. Объектом определения предпочтительно является рак печени или рак легких, более предпочтительно гепатоцеллюлярная карцинома, наиболее предпочтительно запущенная первичная гепатоцеллюлярная карцинома. Способ по настоящему изобретению можно применить пациенту до получения противоракового лечения химиотерапией и/или радиационной терапией или тому подобным. Альтернативно, способ также можно использовать в качестве способа определения результативности химиотерапии, используя агонист RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> в качестве вторичной терапии для пациента с опухолью, которая стала устойчивой к исходной терапии, использовавшей вместо агонистов RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> другие химиотерапевтические средства и/или радиационную терапию и не получившей ожидаемого результата.

При осуществлении способа по настоящему изобретению, как правило, необходимо экстрагировать биологический образец из злокачественной опухоли пациента. В основном ткань злокачественной опухоли получают биопсией, хирургическим вмешательством или тому подобным образом. Если объектом является рак крови, то образец можно получить взятием крови.

Примерами способов, использованных в настоящем изобретении для оценки генов классов молекул семейства р160 и молекул семейства SP110 или белков в качестве их генных продуктов, являются ОТ-ПЦР, описанная в примерах настоящего изобретения, а также гибридизация in-situ (Genome Research, 13, pp.1324-1334, 2003), иммуногистологическое окрашивание (Journal of Pathology, 185, pp.25-31, 1998) диагностического образца ткани и тому подобное. Однако в настоящее время способы не ограничиваются этими примерами, существуют другие способы, которыми можно получить аналогичную оценку.

Тип агониста RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , эффективность которого можно определить способом по изобретению, конкретно не ограничен, и к его примерам относятся ТАС-101 (4-[3,5-бис(триметилсилил)бензамидо]бензойная кислота, Yamakawa T., et al., J. Med. Chem., 33, pp.1430-1437, 1990), Am80 (4-[(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафталенил)карбамоил]бензойная кислота, Hashimoto Y., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 166, pp.1300-1307, 1990), Am580 (4-[(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафталенил)карбоксамидо]бензойная кислота, Kagechika H., et al., J. Med. Chem., 31, pp.2182-2192, 1988), E6060 (4-{5-[7-фтор-4-(трифторметил)бензо[b]фуран-2-ил]-1H-пиррол-2-ил}бензойная кислота, Yamauchi T., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 312, pp.938-944, 2005), ER-38925 (4-(5-бензофуран-2-ил-1Н-пиррол-2-ил)бензойная кислота, Yoshimura H., J. Med. Chem., 43, pp.2929-2937, 2000) и тому подобное. Однако этими примерами агонисты RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> не ограничиваются. Согласно способу по изобретению предпочтительно можно определить эффективность ТАС-101. Сродство связывания тестируемого агента к подтипу рецептора RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> можно легко определить, например, конкурентным анализом сродства тестируемого средства, радиоактивно меченого тритием или тому подобным, к различным подтипам рецептора, содержащим область лигандного связывания (Pijnappel W.W., et al., Nature (London), 366, pp.340-344, 1993; Apfel C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89(15), pp.7129-7133, 1992). Например, в статьях Hashimoto Y., et al., Biol. Pharm. Bull., 19(10), pp.1322-1328, 1996; Sun S.Y., et al., Cancer Res., 57(21), pp.4931-4939, 1997 и тому подобных описывается, что ТАС-101 является RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -селективным агонистом. В вышеуказанных статьях ТАС-101 обозначен как Am555S.

Согласно способу по изобретению, если в балансе между уровнями экспрессии класса молекулы семейства р160 и класса молекулы семейства SP110 преобладает класс молекулы семейства р160 как коактиватор, то можно считать, что агонист RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> эффективен в терапевтическом лечении злокачественной опухоли у пациента. Считается, что агонисты RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> обладают противоопухолевым эффектом. Однако не обнаружено, что противоопухолевый эффект коррелирует с уровнем экспрессии RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , и не известен способ, с помощью которого можно было бы точно предсказать, будет ли агонист RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> как противоопухолевое средство эффективен у конкретного пациента до его введения.

Используя способ по изобретению, становится возможным удобное и точное определение, будет ли агонист RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> как противоопухолевое средство эффективен у конкретного пациента, и, таким образом, становится приемлемым подходящее противоопухолевое лечение. Для вышеуказанной цели в образце измеряют уровни экспрессии класса молекулы семейства р160 и класса молекулы семейства SP110, и можно рассчитать их соотношение (класс молекулы семейства р160/класс молекулы семейства SP110). Альтернативно, например, используя маркер крови, уровень которого меняется в зависимости от соотношения уровней экспрессии класса молекулы семейства р160 и класса молекулы семейства SP110, можно измерить концентрацию маркера в крови, полученной от пациента, и использовать этот параметр как альтернативу вышеуказанного соотношения.

Кроме того, настоящее изобретение также относится к способу терапевтического лечения злокачественной опухоли. В этом способе терапевтического лечения у онкологического больного берут материал злокачественной опухоли, в образце измеряют уровень экспрессии класса молекулы семейства р160 и уровень экспрессии корепрессора, и если в равновесии между уровнями экспрессии класса молекулы семейства р160 и класса молекулы семейства SP110 преобладает класс молекулы семейства р160, то пациенту можно вводить агонист RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> . Даже если преобладает класс молекул семейства SP110, пациенту можно вводить агонист RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , однако полный или частичный ответ зачастую может быть неожиданным.

Например, если, используя способ по изобретению, рак печени лечат ТАС-101, то пациенту с раком печени вводят ТАС-101 предпочтительно в дозе от 10 до 30 мг/день, более предпочтительно от 15 до 25 мг/день, самое предпочтительное 20 мг/день. Кроме того, терапевтическое лечение осуществляют предпочтительно лечебным курсом, состоящим из ежедневного введения в вышеуказанной дозировке в течение 1-4 недель с последующим отдыхом в течение 1-3 недель, или предпочтительно осуществляют лечебным курсом, состоящим из ежедневного введения в течение 2 недель с последующим отдыхом в течение 1 недели. Также предпочитают повторение какого-либо из вышеуказанных курсов лечения по меньшей мере 4 раза. Несмотря не то, что тип рака печени не особенно ограничен, предпочитают первичный рак печени, а более предпочтительна запущенная первичная гепацеллюлярная карцинома. В качестве терапевтического лечения рака печени можно провести комбинированное лечение, выбранное из группы, состоящей из хирургической гепатэктомии, радиочастотной абляции, введения этанола и микроволновой коагуло-некротической терапии.

Настоящее изобретение будет более подробно объяснено со ссылкой на пример. Однако настоящее изобретение не ограничивается рамками следующего примера.

На фиг.1, 2 и 3 показаны результаты изучения экспрессий AIB1, SRC-1 и TIF2, которые являются членами молекул семейства р160, в устойчивых клеточных линиях гепатоцеллюлярной карциномы человека. На фиг.4 показаны результаты изучения экспрессии SP110b, который представляет собой класс молекулы семейства SP110, в устойчивых клеточных линиях гепатоцеллюлярной карциномы человека. Тест на изучение уровней экспрессии данных факторов был выполнен согласно следующему.

Из клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека экстрагировали РНК (RNeasy^® Mini Kit, QIAGEN) для получения кДНК (2.1.5.1 Reverse Transcription System, Promega). Для проведения ПЦР получали праймеры, специфичные к различным членам молекул семейства р160 и молекул семейства SP110 (Applied Biosystems Japan).

Последовательности праймеров AIB1:

, патент № 2405447" SRC="" height=100 BORDER="0">

Используя вышеуказанную кДНК, выполняли ПЦР в режиме реального времени. Для проведения реакции амплификации генов в автоматическую систему детекции/анализа продуктов ПЦР (ABI PRISM7700, Applied Biosystems Japan) вносили в объеме 25 мкл кДНК, в 25 раз разбавленную дистиллированной водой, праймеры для детекции в концентрации 0,4 мкМ и зонд для детекции в концентрации 0,2 мкМ (Universal PCR Master Mix). Значения, относящиеся к внутреннему стандарту, рассчитывали по следующей формуле.

Значение внутреннего стандарта = (Значение, полученное с зондом и праймерами для определения каждого измеряемого фактора)/(Значение, полученное с , патент № 2405447" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -актиновыми контрольными реагентами TaqMan^® ).

Тест на подтверждение активности транскрипции RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> выполняли согласно следующему.

Клетки гепатоцеллюлярной карциномы каждого типа, трансфицированные репортерной плазмидой, содержащей последовательность связывания RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> с геном SEAP, расположенным в направлении 5'-3' (pRARE-SEAP-TA-вектор, Clontech), обрабатывали агонистом RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> и затем в культуральном супернатанте измеряли активность щелочной фосфатазы SEAP. Культивированные клетки гепатоцеллюлярной карциномы трансфицировали репортерной плазмидой RARE, введенной в трансфицирующем реагенте, полученном с использованием культуральной питательной среды и раствора FuGENE6 в соотношении 100:6, и выращивали в течение 24 часов. Культуральную среду заменяли средой, содержащей ТАС-101 в качестве агониста RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , и клетки выращивали в течение дополнительных 24 часов. После чего культуральный супернатант собирали и, используя реагент для измерения активности щелочной фосфатазы (SEAP Detection Kit, Clontech), подтверждали активность транскрипции. Относительно активности транскрипции RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> активность транскрипции обработанных клеток получали в виде относительной величины (Т/С) на основании того, что необработанных клеток взяли 100, а линию клеток рака, имеющую ответ с Т/С 200 или больше, определяли как имеющую гораздо более высокую активность транскрипции RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> .

В таблицах 1, 2 и 3 показано соответствие между соотношениями уровня экспрессии класса молекулы семейства р160 и уровня экспрессии класса молекулы семейства SP110 и активностью транскрипции RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> в различных линиях клеток гепатоцеллюлярной карциномы, полученной от человека. Результаты показывают, что при больших значениях соотношения класс молекулы семейства р160/класс молекулы семейства SP110, т.е. в случае преобладания класса молекулы семейства р160, наблюдается большая активность транскрипции RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> .

Таблица 1
Индекс экспрессии	Баланс кофакторов	Ответ RAR (T/C%)
, патент № 2405447" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle">	AIB1	SP110b	TAC-101 (мкМ)
AIB1/ SP110b	0,3	1	3
НСС-А	0,35	7,74	0,045	142	110	143
НСС-В	0,96	21,31	0,045	180	188	146
НСС-С	1,16	4,82	0,240	342	497	285
НСС-D	0,60	20,25	0,030	161	161	168
НСС-Е	1,14	0,83	1,373	476	482	259

Таблица 2
Индекс экспрессии	Баланс кофакторов	Ответ RAR (T/C%)
, патент № 2405447" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle">	SRC-1	SP110b	TAC-101 (мкМ)
SRC-1/SP110b	0,3	1	3
НСС-А	0,99	7,74	0,128	142	110	143
НСС-В	1,64	21,31	0,077	180	188	146
НСС-С	3,19	4,82	0,662	342	497	285
HCC-D	1,63	20,25	0,080	161	161	168
НСС-Е	2,34	0,83	2,826	476	482	259

Таблица 3
Индекс экспрессии	Баланс кофакторов	Ответ RAR (T/C%)
, патент № 2405447" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle">	TIF2	SP110b	TAC-101 (мкМ)
TIF2/SP110b	0,3	1	3
НСС-А	0,70	7,74	0,090	142	110	143
НСС-В	0,59	21,31	0,027	180	188	146
НСС-С	0,68	4,82	0,141	342	497	285
HCC-D	0,22	20,25	0,011	161	161	168
НСС-Е	0,96	0,83	1,153	476	482	259

Кроме того, в результате исследований этих балансов кофакторов и терапевтических эффектов было обнаружено, что высокую активность транскрипции RAR, индуцированную ТАС-101 как агонистом RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , получали в клетках НСС-С и НСС-Е, в которых преобладал класс молекулы семейства р160, в то время как в клетках НСС-D, в которых преобладал SP110b, активность транскрипции RAR была незначительной.

Было обнаружено, что ортотопическую модель гепатомы можно с успехом получить, трансплантируя эти линии клеток в печень «голой» мыши. Соответственно, для оценки чувствительности к агонистам RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> выполняли эксперимент терапевтического лечения. Культивированные клетки рака печени трансплантировали в количестве 1х10⁶ клеток в наружную левую долю печени голых мышей (BALB/cA Jcl-nu, Clea Japan, Inc.), в качестве агониста RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ежедневно орально вводили ТАС-101 в виде суспензии 0,5% гидроксипропилметилцеллюлозы (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.), и затем через 3 недели измеряли массу сформированных в печени опухолей для получения средних степеней ингибирования. В таблице 4 представлены результаты, полученные на этих моделях рака печени. У моделей НСС-С и НСС-Е обнаружили эффекты ингибирования роста опухоли, составившие 81% и 67% соответственно. Кроме того, с помощью двухстороннего t-критерия Стьюдента также обнаружили, что эти противоопухолевые эффекты имели статистически значимое ингибирующее действие. В то же время у модели НСС-D степень ингибирования составила 3%, и было показано отсутствие терапевтического эффекта.

Дополнительно, используя линии клеток рака с установленной жизнеспособностью, оценивали корреляцию между балансом кофакторов и жизнеспособностью. Если клетки линии клеток колоректального рака САС, имеющие соотношение AIB1/ SP110b 0,08, указывающее на преобладание SP110b, и вышеуказанные клетки НСС-Е инокулируют в селезенку голой мыши, то в печени легко обнаруживается диссеминация, приводя к формированию метастаза в печень. После трансплантации 1×10⁶ клеток САС или НСС-Е и введения ТАС-101 орально ежедневно в течение 4 недель исследовали время жизнеспособности каждого животного модели. Результаты жизнеспособности представлены в таблице 5. В модели САС, где преобладал SP110b, увеличение времени жизнеспособности составило лишь 26%, тогда как в модели НСС-Е, в которой преобладал класс молекулы семейства р160, было подтверждено почти двукратное удлинение времени жизнеспособности, составив 81%. Кроме того, этот эффект у модели НСС-Е оказался также статистически значимым (Р<0,001). Эти результаты ясно показывают, что агонист RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> эффективен для типов рака, у которых преобладает класс молекулы семейства р160 в вышеуказанном соотношении экспрессии класса молекулы семейства р160/ классу молекулы семейства SP110.

Таблица 4
Клеточная линия	AIB1/ SP110b	Ингибирование (%)
НСС-С	0,240	81
НСС-D	0,030	-3
HCC-E	1,373	67

Таблица 5
Клеточная линия	AIB1/ SP110b	Увеличение времени жизни (%)
САС	0,080	26
НСС-Е	1,373	81

Практическое применение

Терапевтическое воздействие агониста RAR- , патент № 2405447" SRC="/images/patents/57/2405447/2405447-2.gif" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> на злокачественную опухоль, такую как рак печени, может быть удобно и точно предсказано с помощью способа по изобретению.

, патент № 2405447" SRC="" height=100 BORDER="0"> , патент № 2405447" SRC="" height=100 BORDER="0"> , патент № 2405447" SRC="" height=100 BORDER="0">