способ создания биологической модели аллергии к стафилококковому аллергену

Формула изобретения

Способ создания биологической модели аллергии к стафилококковому аллергену, включающий сенсибилизацию морских свинок суспензией убитых стафилококков с последующим введением аллергена, отличающийся тем, что сенсибилизацию проводят 5,0-10,0 млрд/мл взвесью инактивированных стафилококков с 0,2%-ным раствором формалина, сорбированных на гидроксиде алюминия 3-5 мг/мл, путем однократного подкожного введения в объеме 0,5-1,0 мл на одно животное с последующим внутрикожным введением 0,1 мл стафилококкового аллергена в разведении 1:10, 1:20 и 1:40 и учетом реакции по гиперемии кожи через 24 ч.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к иммунологии и аллергологии, в частности к моделированию аллергии при стафилококкозе, и может быть использовано для определения аллергенной активности, контроля, стандартизации стафилококкового аллергена, изучения процессов аллергических реакций.

В существующих способах определение активности аллергенов проводят на сенсибилизированных животных по содержанию белка-аллергена и с помощью серологических реакций.

Наиболее стабильно выраженная аллергия проявляется у животных и людей, больных туберкулезом, или после введения вакцины БЦЖ, убитых микобактерий. Это происходит, в основном, из-за повышенного содержания гликолипидов, воска и т.д. в микобактериях, создающих «бронированную» защиту от лекарственных средств, и депонирования в местах введения микроорганизмов или проявления патологического процесса.

Поэтому, из-за отсутствия демонстративно выраженной аллергии при отдельных инфекционных болезнях, в том числе и при стафилококкозе, проводят аллергизацию лабораторных животных с полным или неполным адъювантом Фрейнда, содержащим убитые микобактерий во взвеси с жидким парафином и ланолином (Бырдаров С. В. Экспериментальная микробиология. - М., София. - 1965. С.112-113). В этих случаях это будет сочетанное проявление аллергии на два инфекционных патогена, и кожные реакции на соответствующие аллергены будут недостоверными.

Объективные показатели кожных реакций на моноаллерген могут быть получены на животных, сенсибилизированных видовым микроорганизмом, адекватным инфекционной болезни.

С учетом того, что в патогенезе инфекционных болезней человека и животных аллергия в различной степени выраженности участвует как обязательный компонент, были проведены исследования по обеспечению аллергизации морских свинок суспензией из автоклавированных стафилококков без дополнительных компонентов полного и неполного адъюванта Фрейнда.

За прототип взяли способ сенсибилизации в подушечки лапок морских свинок цельными микробными клетками стафилококков, убитых нагреванием в концентрации 5 млрд клеток в 1 мл, с неполным адъювантом Фрейнда (Фрадкин В.А. Диагностика и лечебные аллергены. - М.: Медицина, 1990. - С.10-11; Беклемишев Н.Д., Шамсудинова Г.С., Суходоева Г.С.Сравнительная оценка диагностической эффективности стафилококковых аллергенов //Аллергология и клиническая иммунология. - Алма-Ата, 1985. - С.26-31).

Недостатком известного способа является дополнительное использование взвеси убитых микобактерий туберкулеза в ланолине, жидком парафине адъюванта Фрейнда вместе с микробными клетками стафилококков для введения суспензии микроорганизмов в подушечки лапок морских свинок с обезболиванием мест введения 0,2% раствором новокаина. Присутствие туберкулезных аллергенов не дает объективной картины аллергизации на стафилококковые аллергены. Кроме того, ланолин и парафин, присутствующие в адъюванте Фрейнда, вызывают в местах введения суспензии образование гнойных абсцессов.

Для устранения указанных недостатков предлагается использование для аллергизации морских свинок взвеси 5,0-10,0 млрд/мл инактивированных нагреванием стафилококков, сорбированных на гидроксиде алюминия 3-5 мг/мл без компонентов адъюванта Фрейнда, вызывающих образование гнойных абсцессов и гибель животных.

Целью предлагаемого изобретения является создание у морских свинок безопасным способом стабильно выраженной аллергии для контроля, стандартизации стафилококкового аллергена и изучения процесса проявления аллергии.

Поставленная цель достигается сенсибилизацией морских свинок взвесью 5,0-10,0 млрд/мл микробных клеток стафилококков, инактивированных автоклавированием с последующей детоксикацией 0,2% раствором формалина при 42°С в течение 5-7 суток, сорбированных на гидроксиде алюминия 3-5 мг/мл, путем подкожного введения в объеме 0,5-1,0 мл.

Подкожное введение морским свинкам обезвреженных описанным способом стафилококков обеспечивает стабильно выраженную чувствительность у животных к стафилококковому аллергену в течение 4-5 месяцев и позволяет получить положительный эффект - снижение токсичности аллергизирующей суспензии, достоверность моделирования аллергии именно на стафилококковый аллерген, исключить образование гнойных абсцессов у животных.

Пример 1. Получение суспензии стафилококков для сенсибилизации морских свинок.

Стафилококки выращивались на жидкой синтетической питательной среде, содержащей в граммах на 1 л дистиллированной воды: лимонной кислоты - 8,0; аспарагина - 1,0; хлористого натрия - 7,0; сернокислого цинка - 0,2; сернокислого магния - 0,4; сернокислого железа - 0,2; фосфорнокислого калия 2-зам. - 3,0; глицерина - 40 мл с последующим установлением реакции среды до 7,2 - 5%-ным раствором аммиака в 200,0 мл флаконах с объемом среды, равной 100,0 мл, в течение 5 суток до концентрации 5 млрд/мл микробных клеток. Их подвергли автоклавированию при 1,0 атм в течение 30 минут с последующим прибавлением формалина до 0,2% концентрации для детоксикации токсинов при 42°С в течение 5 суток, а затем в качестве адъюванта-депонента вносили гидроксид алюминия из расчета 3 мг/мл суспензии.

Пример 2. Испытание сенсибилизирующей суспензии стафилококков на безвредность на белых мышах и здоровых морских свинках.

Подкожное однократное введение 0,1 мл суспензии шести белым мышам и 1,0 мл шести морским свинкам не вызвало беспокойства, гибели животных и образования на месте введения гнойных абсцессов при наблюдении в течение 10-12 суток.

Пример 3. Моделирование аллергии на стафилококковый аллерген.

Морские свинки массой 350-400 г в количестве 14 голов были сенсибилизированы подкожным однократным введением суспензии убитых стафилококков, приготовленных описанным способом, в объеме 1,0 мл. Периодически через 30, 60, 90, 120, 150 суток животным вводили в депилированные боковые поверхности кожи стафилококковый аллерген в разведении 1:10, 1:20, 1:40 по 0,1 мл. Гиперемия кожи через 24 часа составляла в диаметре 11,0±1,0; 9,0±1,0 и 8,0±1,0 мм соответственно разведениям. При введении стафилококкового аллергена через 150 суток после сенсибилизации морских свинок отмечено уменьшение диаметров гиперемии кожи на 1,0-1,5 мм.

Пример 4. Изучение срока хранения аллергизирующей суспензии из стафилококков.

Суспензия стафилококков 5-10 млрд/мл, выдержанная в 0,2% растворе формалина, после сорбции на гидроксиде алюминия при рН 7,0±0,2 расфасовывалась в пенициллиновые флаконы и подвергалась автоклавированию при 1,0 атм в течение 20 минут.

По истечении шести и двенадцати месяцев сенсибилизирующие свойства суспензии для морских свинок не изменились.

Таким образом, созданная безопасным способом модель аллергии позволяет изучать активность стафилококкового аллергена в течение длительного времени по стабильно выраженной кожной реакции морских свинок.