лекарственное средство пролонгированного действия с дозированным высвобождением в органы-мишени на основе d-циклосерина для лечения резистентных форм туберкулеза

Формула изобретения

Лекарственное средство противомикробного действия с пролонгированным высвобождением в органы-мишени, отличающееся тем, что представляет собой стабильные наночастицы и включает D-циклосерин, ПЛГА 50/50, D-Маннит и поливиниловый спирт, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

D-циклосерин	1÷15
ПЛГА 50/50	20÷40
D-Маннит	5÷40
Поливиниловый спирт	5÷15

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области фармакологии и медицины, конкретно к новому поколению противомикробных средств регулируемого действия на основе D-циклосерина.

D-Циклосерин является аналогом и конкурентным антагонистом -D-аланина и по химической структуре представляет собой D-4-амино-3-изоксазолидинон, обладает широким спектром антибактериальной активности, применяется для лечения хронических форм туберкулеза [1], в том числе туберкулеза легких (активная форма), внелегочного туберкулеза (включая заболевание почек) в составе комбинированной терапии, острых инфекций мочевыводящих путей. D-Циклосерин ингибирует активность двух ферментов, участвующих в синтезе клеточной стенки бактерий на ранних этапах: Z-аланинрацемазы (превращает Z-аланил в -D-аланин) и D-аланил-D-аланинсинтетазы (обеспечивает включение D-аланина в пентапептид, необходимый для формирования пептидогликанов). Эффективен в отношении грамположительных, грамотрицательных бактерий, Mycobacterium tuberculosis и др. Проявляет бактериостатический или бактерицидный эффект в зависимости от концентрации в очаге инфекции и чувствительности микроорганизмов. Устойчивость М. tuberculosis к циклосерину развивается медленно и редко, после 6 месяцев терапии выделяется до 20-30% устойчивых штаммов. Перекрестной резистентности с другими противотуберкулезными средствами не выявлено. Показана эффективность при хронических формах туберкулеза, вызываемых микобактериями, устойчивыми к другим противотуберкулезным средствам, и атипичных микобактериозах, вызываемых комплексом М.avium-intracellulare, М. xenopi и др.

Основной трудностью применения существующих лекарственных форм циклосерина является наличие выраженного отрицательного центрального действия на состояние центральной нервной системы (ЦНС). По механизму действия циклосерин относят к агонистам глутаматных NMDA-рецепторов, по химической структуре он напоминает психоактивное вещество мухомора - мусцимол [2]. Высокие дозы циклосерина вызывают галлюцинаторный психоз с дезориентацией, эйфорией или агрессивностью, кошмарными сновидениями, расстройством памяти. При лечении циклосерином, особенно длительном его применении, регистрируются такие нежелательные эффекты со стороны нервной системы и органов чувств, как головная боль, тремор, дизартрия, головокружение, судороги, сонливость, полубессознательное состояние, спутанность мыслей, нарушение ориентации, сопровождающееся потерей памяти, психоз с суицидальными попытками, изменение характера, повышенная раздражительность, агрессивность, парез, гиперрефлексия, парестезия, приступы клинических судорог, кома. С целью уменьшения осложнений со стороны ЦНС был создан оригинальный препарат в желатиновых капсулах, содержащий одновременно с циклосерином 2-5 мас.% глутаминой кислоты [3].

Сущность настоящего изобретения заключается в создании лекарственного средства на основе D-циклосерина, позволяющего достигать положительного фармакодинамического действия циклосерина при меньших дозах, меньшей концентрации в крови и увеличения концентрации циклосерина непосредственно в органах-клетках-мишенях патологического воздействия (в случае туберкулеза - макрофагах), и тем самым снижать риск возникновения токсических эффектов с одновременным достижением эффекта пролонгации действия, снижения кратности приема при лечении и сохранения стабильности при хранении.

Данная сущность изобретения достигается путем включения в новое лекарственное средство на основе D-циклосерина, обладающее дозированным и пролонгированным высвобождением, биодеградируемых полимеров, разрешенных к медицинскому применению {(полимер молочной кислоты (ПЛА), сополимер гликолевой и молочной кислот (ПЛГА) и сополимер гликолевой и молочной кислот со свободной концевой карбоксильной группой (ПЛГА-СООН)}, поверхностно-активных веществ {полисорбат 80, поливиниловый спирт (ПВС), полоксамер 188} и криопротектора (D-маннит) с целью получения активных наночастиц. Для получения наночастиц использовали полимеры с молекулярной массой от 10 до 300 кДа и молярным соотношением остатков молочной и гликолевой кислот от 25:75% до 50:50%.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1. Получение полимерных наночастиц с включенным в них D-циклосерином методом двойного эмульгирования на основе ПЛГА

Смесь, состоящую из 5-20% раствора полимера в органическом растворителе (хлороформ) и 1-10% водного раствора D-циклосерина (объемное соотношение органической и водной фаз от 3:1 до 3:2), гомогенизируют при 24000 об./мин на гомогенизаторе Ultra-Turrax T-25 3 раза по 1 мин с перерывами по 1 мин для получения первичной эмульсии. Первичную эмульсию смешивают с 0.5-2% водным раствором полимерного стабилизатора эмульсии (ПВС) в объемном соотношении 1:5 и гомогенизируют повторно в тех же условиях. Двойную эмульсию перемешивают 1 ч при 40°С до полного удаления органического растворителя. Полученную суспензию фильтруют, добавляют в фильтрат 1-3% (объемн.) криопротектора (D-маннит), замораживают и лиофилизируют. Средний размер частиц, определенный методом автокорреляционной спектроскопии на субмикронном лазерном спектрометре Coulter N4MD, составляет от 250 до 500 нм, что способствует эффективному всасыванию в желудочно-кишечном тракте [4]. Размер получаемых частиц зависит от вида полимера, стабилизатора эмульсии, их концентрации, а также от условий гомогенизации. Степень включения -D-циклосерина в полимерные частицы составляет от 10 до 35%.

Пример 2. Получение полимерных наночастиц с включенным в них D-циклосерином методом двойного эмульгирования на основе ПЛГА-СООН

Смесь, состоящую из 5-20% раствора ПЛГА-СООН в органическом растворителе (хлороформ) и 1-10% водного раствора D-циклосерина (объемное соотношение органической и водной фаз от 3:1 до 3:2), гомогенизируют при 24000 об./мин на гомогенизаторе Ultra-Turrax T-25 3 раза по 1 мин с перерывами по 1 мин для получения первичной эмульсии. Первичную эмульсию смешивают с 0.5-2% водным раствором полимерного стабилизатора эмульсии (ПВС) в объемном соотношении 1:5 и гомогенизируют повторно в тех же условиях. Двойную эмульсию перемешивают 1 ч при 40°С до полного удаления органического растворителя. Полученную суспензию фильтруют, добавляют в фильтрат 1-3% (объемн.) криопротектора (D-маннит), замораживают и лиофилизируют. Средний размер частиц составляет от 200 до 350 нм. Степень включения -D-циклосерина в полимерные частицы составляет от 10 до 20%.

Пример 3. Получение полимерных наночастиц с включенным в них D-циклосерином методом двойного эмульгирования на основе ПЛА

Смесь, состоящую из 5-20% раствора ПЛА в органическом растворителе (хлороформ) и 1-10% водного раствора D-циклосерина (объемное соотношение органической и водной фаз от 3:1 до 3:2), гомогенизируют при 24000 об./мин на гомогенизаторе Ultra-Turrax T-25 3 раза по 1 мин с перерывами по 1 мин для получения первичной эмульсии. Первичную эмульсию смешивают с 0.5-2% водным раствором полимерного стабилизатора эмульсии (ПВС) в объемном соотношении 1:5 и гомогенизируют повторно в тех же условиях. Двойную эмульсию перемешивают 1 ч при 40°С до полного удаления органического растворителя. Полученную суспензию фильтруют, добавляют в фильтрат 1-3% (объемн.) криопротектора (D-маннит), замораживают и лиофилизируют. Средний размер частиц составляет от 350 до 600 нм. Степень включения D-циклосерина в полимерные частицы составляет от 5 до 15%.

Ниже приведены оптимальные составы предлагаемого средства, полученного по примеру 1 в мас.%:

D-Циклосерин	от 1 до 15%
ПЛГА 50/50	от 20 до 40%
D-Маннит	от 5 до 40%
ПВС	от 5 до 15%

При других составах и соотношениях ингредиентов, как было установлено экспериментально, происходят нежелательные изменения в размерах полимерных частиц, уменьшение степени включения -D-циклосерина и связанные с ними уменьшение антимикробной активности и увеличение токсичности. Оптимальное разбавление средства в воде соответствует соотношению от 1:20 до 1:10, что может быть использовано для регулировки дозирования препарата в зависимости от индивидуальных особенностей больного.

Пример 4. Сравнительная фармакологическая эффективность оригинального лекарственного средства пролонгированного действия с дозированным высвобождением в органы-мишени на основе D-циклосерина, обладающего значительно меньшей нейротоксичностью

Изучение влияния разработанного лекарственного средства на основе D-циклосерина на выживаемость и высеваемость М. tuberculosis в легких проведено на модели острого туберкулеза путем введения летальной дозы (М. tuberculosis штаммом H37Rv в дозе 5·10⁶/мышь). Введение лекарственного средства на основе -D-циклосерина пролонгированного действия с дозированным высвобождением в органы-клетки-мишени (таблица 1) начинали через сутки после воспроизведения туберкулеза одновременно с введением чистой субстанции и в дозе почти в 10 раз меньшей, чем доза вводимой чистой субстанции -D-циклосерина. Лекарственное средство вводили в течение 3-х суток.

Таблица 1
Сравнительная фармакологическая эффективность действия лекарственного средства пролонгированного действия с дозированным высвобождением D-циклосерина
Препарат	Доза	Средний срок жизни по отношению к контролю, %	Высеваемость М. tuberculosis в легких, % (по отношению к содержанию в контрольной группе)
7-е сутки	14-е сутки	21-е сутки
Контроль	1,0 мл	100	100	100	100
D-Циклосерин субстанция	100 мг/кг	101,5	78	85	82
D-циклосерин субстанция	250 мг/кг	100	63	60	70
D-Циклосерин субстанция	25 мг/кг	99,9	99	101	95
Лекарственное средство на основе D-циклосерина	5 мг/кг	107	60	55	49
Лекарственное средство на основе -D-циклосерина	12,5 мг/кг	120	15	17,5	21
Лекарственное средство на основе D-циклосерина	25 мг/кг	115	14	17,0	19
Примечание: в контроле вводили физиологический раствор в объеме, равном объему вводимого препарата.

Пример 5. Фармакокинетика оригинального лекарственного средства пролонгированного действия с дозированным высвобождением в органы-мишени на основе D-циклосерина, обладающего значительно меньшей нейротоксичностью.

Показано, что после перорального приема иммобилизованного D-циклосерина в дозе 250 мг он быстро и почти полностью (70-90%) всасывается из желудочно-кишечного тракта. Максимальная концентрация (С _mах) циклосерина в крови достигается через 3-8 ч. После приема в дозе 250 мг каждые 12 ч С_mах составляет 25-30 мкг/мл. D-Циклосерин не связывается с белками крови, хорошо распределяется по тканям и жидкостям организма, включая спинномозговую жидкость, лимфоидную ткань, легкие, плевральную и асцитическую жидкости, мокроту, желчь. D-Циклосерин проходит ГЭБ, плацентарный барьер, проникает в грудное молоко (концентрация в спинномозговой, плевральной жидкости, крови плода и грудном молоке приближается к плазменному уровню). -D-Циклосерин частично (35%) биотрансформируется в печени до неидентифицированных метаболитов. Период полувыведения составляет 8-12 ч.

Применение разработанной пролонгированной формы дозированного высвобождения D-циклосерина в органы-мишени, в данной случае макрофаги, с содержанием D-циклосерина 125 мг в одной капсуле (флаконе) позволяет достигать высокой концентрации D-циклосерина (происходит захват -D-циклосерина преимущественно макрофагами) в макрофагах, тогда как в крови концентрация не превышает 10 мкг/мл. Максимальная концентрация в крови 10 мкг/мл достигается на 7-8 день после приема пролонгированной формы и поддерживается в течение 6 дней. Это позволяет существенно уменьшить кратность приема, пролонгированную форму D-циклосерина с дозированным высвобождением следует назначать по 1 таблетке 1 раз в семь дней, при этом полностью сохраняется противотуберкулезная активность препарата.

Показано, что разработанная форма D-циклосерина в предполагаемой терапевтической дозе 12,5 мг/кг массы животного не вызывает развития нарушений ориентации и сенсорно-моторных реакций, которые проявлялись при введении субстанции D-циклосерина в той же дозе 12,5 мг/кг массы и становились более выраженными при увеличении дозы до 25 и до 100 мг/кг массы животного.

Уменьшение концентрации D-циклосерина в крови лежит в основе резкого снижения развития нейротоксического действия препарата.

Таким образом, удалось получить эффект направленного дозированного бактерицидного действия и длительного поддержания уровня противотуберкулезного препарата в макрофагах при резистентных формах туберкулеза. В медицинской практике такое лекарственное средство с этой целью ранее не применялось.

Технический результат достигается исключительно путем способности наноносителей на основе биодеградируемых полимеров в сочетании с пластификаторами и криопротекторами осуществлять высокоселективное и дозированное высвобождение активной субстанции в органы-клетки-мишени (макрофаги) и затем полностью выводиться из организма.

Технический результат также достигается за счет того, что разработанное средство обладает высокой фармакологической активностью и низкой нейротоксичностью.

Использование изобретения позволит получить следующий технический результат:

- повысить эффективность лечения резистентных форм туберкулеза;

- разработать оптимальные меры профилактики развития резистентных форм туберкулеза;

- достигать быстрой положительной динамики при лечении резистентных форм туберкулеза;

- разработать рациональную тактику ведения больных резистентными формами туберкулеза, что позволит существенно повысить эффективность лечения и продолжительность жизни больного;

- уменьшить дозировки, повысить эффективность и сократить сроки и развитие нежелательных эффектов при применении химиотерапии туберкулеза.

Полученный терапевтический эффект является стойким, поскольку достигается путем стабильного длительного поддержания терапевтической дозы препарата в макрофагах больного.

Разработанное средство предлагается к выпуску в стеклянных или пластиковых флаконах или ампулах, содержащих прозрачную жидкость или лиофилизированный порошок белого цвета, или в виде кишечно-растворимых таблеток белого цвета или в капсулах.

Однократная доза лекарственного средства содержит действующее начало противотуберкулезный препарат D-циклосерин, при высвобождении которого в кровь поддерживающая доза не превышает в сутки 25 мг.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. В двух частях. Ч.2 / 12-е изд., перераб. и доп. М.: Медицина, 1993. - С.381-382.

2. Беспалов А.Ю., Звартау Э.Э. Нейропсихофармакология антагонистов NMDA-рецепторов. СПб.: Невский Диалект, 2000. - 297 с.

3. Gaie E.F., Cundliffe E., Reynolds P.E. et al. The Molecular Basis of Antibiotic Action. / Wiley. - New York. - 1972. - P.61-71.

4. Вранккс А., Демустье М., Делеер М. Фармацевтический состав, содержащий нанокапсулы, и способ его получения. / Патент РФ № 2145498 C1. - 1994 г.