способ выделения ихтиовирусов из клинического материала от рыб для диагностических и мониторинговых исследований

Формула изобретения

1. Способ выделения ихтиовирусов из клинического материала от рыб для диагностических и мониторинговых исследований, включающий гомогенизацию тканевого материала, приготовление 10%-ной суспензии гомогената в питательной среде, центрифугирование, деконтаминацию супернатанта, инокулирование чувствительной культуры клеток, отличающийся тем, что тканевой материал перед гомогенизацией подвергают 10-кратной отмывке в среде 199 или Игла MEM с 500 ЕД/мл пенициллина, 500 мкг/мл стрептомицина и 500 мкг/мл нистатина, а затем инкубируют в течение 3-5 суток в свежей порции этих же сред с 2% сыворотки крови плода коровы и 200 ЕД/мл пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина и 25 мкг/мл нистатина при постоянном качании на шейкере с частотой 50 качаний/мин, температуре 15-21°С и соотношении тканевого материала и среды 1:100.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для выделения вирусов в качестве тканевого материала используют кусочки кожи и плавников рыб.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для выделения вирусов-возбудителей весенней виремии карпа и герпесвирусной болезни сибирского осетра при проведении диагностических и мониторинговых исследований.

Известен способ выделения вирусов из клинического материала от рыб [Wolf К. Guidelines for virological examination of fishes. In: A Symposium on Diseases of Fishes and Shellfishes. S.F.Snieszko (ed.). Spec. Publ. N 5, American Fisheries Society, Washington, D.C., 1970, p.327-340; «Методические указания по идентификации вирусов и лабораторной диагностике вирусных болезней рыб», утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 10.10.97 г., № 13-4-2/1054. В кн.: Сб. инструкций по борьбе с болезнями рыб. - М.: Отдел маркетинга АМБ-агро. - 1998. - 4.1. - С.60-113.]. При его использовании исследуемый образец ткани обрабатывают без предварительной подготовки следующим образом: гомогенизация ткани, приготовление 10%-ной суспензии тканевого гомогената в питательной среде, центрифугирование, деконтаминация супернатанта, инокулирование чувствительной культуры клеток.

Известный способ быстр и чувствителен при работе с материалом, отобранным на стадии разгара эпизоотии, однако вероятность выделения им вируса мала при исследовании материала на поздних стадиях эпизоотии, материала от рыб-вирусоносителей в межэпизоотический период и при мониторинге популяций рыб на наличие вирусов-возбудителей заболеваний вследствие того, что уровень содержания в нем вирусов значительно ниже порога чувствительности метода, равного 10 ²-10³ ТЦД₅₀/г ткани.

Целью изобретения является разработка высокочувствительного способа выделения ихтиовирусов из клинического материала от рыб для проведения диагностических и мониторинговых исследований.

Сущность изобретения заключается в предварительной отмывке эксплантатов покровных тканей рыб в среде с повышенным содержанием антибиотиков, переносе их во флаконы с питательной средой (среда Игла MEM или среда 199 с 2% сыворотки крови плода коровы и 200 ЕД/мл пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина и 25 мкг/мл нистатина) и инкубации в течение 3-5 суток при оптимальной для репродукции вируса температуре (15°-21°С) при постоянном качании (50 качаний в минуту на шейкере), приводящей к увеличению содержания вируса в ткани в 100 и более раз, что выявляется при последующем выделении его известным способом с одновременным титрованием материала в культуре клеток. Способ пригоден для выявления вирусов, обладающих покровно-тканевым тропизмом.

Способ реализуют следующим образом.

Пробы покровных тканей (при выделении герпесвируса сибирского осетра рекомендуется отбирать плавники и кожу, при выделении рабдовируса весенней виремии карпа - кожу) измельчают на кусочки размером 3-5 мм и десятикратно отмывают во флаконе с питательной средой (среда 199 или Игла MEM), содержащей 500 ЕД/мл пенициллина, 500 мкг/мл стрептомицина и 500 мкг/мл нистатина при комнатной температуре, но не выше 20-22°С. Соотношение ткани и среды при каждой отмывке должно быть 1:20.

Продолжительность каждой отмывки, за исключением последней, - 5 мин при регулярном энергичном встряхивании. Продолжительность последней отмывки - 60 мин.

После отмывки кусочки ткани переносят в новые стерильные флаконы и добавляют среду 199 (при выделении герпесвируса сибирского осетра) или Игла MEM (при выделении рабдовируса весенней виремии карпа) с 2% сыворотки крови плода коровы и антибиотиками (200 ЕД/мл пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина и 25 мкг/мл нистатина). Соотношение ткани и среды 1:100.

Флаконы помещают на шейкер (50 качаний в минуту) и инкубируют при температуре 15°С в течение 5 суток - для герпесвируса сибирского осетра или при 19-21°С в течение 3 суток - для вируса весенней виремии карпа.

По окончании инкубации ведут выделение вируса известным способом [Wolf, 1970; Метод. указания , 1997]. При выделении герпесвируса сибирского осетра 10%-ную суспензию инкубируемого тканевого материала готовят в свежей питательной среде 199 с 2% сыворотки крови плода коровы и антибиотиками (200 ЕД/мл пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина и 25 мкг/мл нистатина). Для выделения вируса используют клеточные линии осетрового происхождения (наиболее чувствительной является линия SSO-2 - пула печени, почки и селезенки сибирского осетра, Acipenser baeri). Инкубацию инокулированных культур ведут при 15°С.

Для выделения рабдовируса весенней виремии карпа можно отбирать только жидкость, в которой проводилась инкубация материала, и не использовать сам тканевой материал или готовить 10%-ную суспензию инкубируемого материала непосредственно в среде инкубации. Дальнейшую обработку и исследование материала проводят согласно вышеупомянутым «Метод. указаниям » и «Инструкции о мероприятиях по профилактике и борьбе с весенней виремией карпа (ВВК)», утвержденной Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 26.11.97 г., № 13-4-2/1091 (В кн.: Сб. инструкций по борьбе с болезнями рыб. - М.: Отдел маркетинга АМБ-агро. - 1998. - 4.1. - С.76-86).

Пример 1. Выделение герпесвируса сибирского осетра

В качестве клинического материала использовали:

1) объединенные в 4 пробы грудные плавники, ротовой аппарат, жаберные крышки и анус от 17 сеголетков гибрида русского и ленского осетров, отобранные из рыбоводного хозяйства на стадии завершения эпизоотии и повышения температуры воды до 20-23°С;

2) плавники и кожу от экспериментально зараженных герпесвирусом двухгодовиков сибирского осетра на разных стадиях течения заболевания.

Получены следующие результаты.

1) От рыб из хозяйства не удалось выделить герпесвирус известным способом после проведения 3 слепых пассажей материалов в чувствительных линиях клеток сибирского осетра SSO-2 (пул печени, почек и селезенки) и SSF-2 (плавники), а также белого осетра WSSK-1 (кожа). Предлагаемым способом тканевых эксплантатов вирус был выделен из 2 проб этих же материалов в клетках линии SSO-2 и WSSK-1 (табл.1).

2) Во всех вариантах эксперимента выделение герпесвируса предлагаемым способом тканевых эксплантатов оказалось более эффективным. Содержание вируса в исследуемом материале после его предварительной инкубации повышалось более чем в 100 раз. Из кожи рыбы № 3 известным способом вирус не был выделен даже после проведения 3 слепых пассажей, но был выделен после инкубации тканевых эксплантатов в титре 10^4.1ТЦД₅₀/г ткани (табл.2).

Таблица 1
Сравнение двух способов выделения герпесвируса сибирского осетра от выздоравливающих рыб рыбоводного хозяйства на стадии завершения эпизоотии
№ пробы	Известный способ	Предлагаемый способ тканевых эксплантатов
SSO-2	WSSK-1
1	н.о.	+*	н.о.
2	н.о.	+*	+**
3	н.о.	н.о.	н.о.
4	н.о.	н.о.	н.о.
Примечание: н.о. - вирус не обнаружен после 3 «слепых» пассажей; +*-вирус выделен во втором пассаже; +** - вирус выделен в третьем пассаже.

Пример 2. Выделение рабдовируса весенней виремии карпа

В качестве клинического материала использовали:

1) кожу от 60 двухгодовиков карпа без признаков заболевания из рыбоводного хозяйства, неблагополучного по весенней виремии; в одну пробу объединяли материал от 5 рыб;

2) отдельно кожу, плавники, жабры и пул внутренних органов (печень, почка, селезенка) от экспериментально зараженных годовиков карпа на разных стадиях течения эпизоотии; в одну пробу объединяли материал от 5 рыб.

Получены следующие результаты.

1) Из 12 проб от рыб из неблагополучного хозяйства, обработанных известным способом, при инокуляции культуры клеток карпа ЕРС вирус был обнаружен в одной пробе ( № 10), а предлагаемым способом тканевых эксплантатов в 2-х пробах ( № 9 и 10). При этом содержание вируса в этих пробах повысилось более чем в 10³ раз по сравнению с таковым при известном способе выделения (табл.3).

Таблица 3
Сравнение двух способов выделения рабдовируса весенней виремии карпа из проб кожи от клинически здоровых рыб-вирусоносителей из неблагополучного рыбоводного хозяйства
№ пробы	Содержание вируса в пробе при разных способах выделения, lgТЦД 50/г ткани
Известный способ	Предлагаемый способ тканевых эксплантатов
1	н.о.	н.о.
2	н.о.	н.о.
3	н.о.	н.о.
4	н.о.	н.о.
5	н.о.	н.о.
6	н.о.	н.о.
7	н.о.	н.о.
8	н.о.	н.о.
9	н.о.	6,10
10	3,27	6,35
11	н.о.	н.о.
12	н.о.	н.о.
Примечание: н.о. - вирус не обнаружен после 3-х «слепых» пассажей материала в клетках ЕРС.

2) В эксперименте по выделению вируса весенней виремии от карпов на разных стадиях эпизоотии получены следующие результаты. На стадии разгара эпизоотии известный метод не уступал методу тканевых эксплантатов в частоте выделения вируса из всех видов материала кроме кожи. При этом содержание вируса во внутренних органах этих же рыб, определенное известным способом, было даже выше, чем в эксплантатах кожи.

В то же время на стадии угасания эпизоотии, постэпизоотической и межэпизоотической стадиях частота выделения вируса из кожи при использовании предлагаемого способа тканевых эксплантатов возрастала, также как и содержание в ней вируса (в 100 и более раз). Известным способом вирус обнаружили только в одной пробе кожи из 11 исследованных, а предлагаемым способом тканевых эксплантатов в 9 пробах и в большем количестве. К тому же содержание вируса в среде, в которой проводилась инкубация, нередко было выше, чем в самой ткани (табл.4). Инкубация проб плавников и жабр увеличивала эффективность выделения вируса не столь значительно, а инкубация проб внутренних органов не влияла на результаты выделения.

Таким образом, использование предлагаемого метода тканевых эксплантатов позволяет значительно увеличить содержание вируса в инкубируемой ткани и повысить частоту выделения его от рыб на поздних стадиях эпизоотии и в межэпизоотический период.