штамм вируса гриппа птиц a/common gull/chany/2006 h5n1 субтипа для приготовления антигенсодержащего диагностического или вакцинного препарата

Формула изобретения

Штамм вируса гриппа птиц A/common gull/Chany/2006 H5N1 субтипа для приготовления антигенсодержащего диагностического или вакцинного препарата, депонированный в Коллекции культур микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером № V-368.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской вирусологии и микробиологии, а именно для приготовления антигенсодержащего субстрата для серодиагностики высокопатогенного гриппа H5N1 субтипа в РТГА, в частности наличия антител в сыворотках крови диких животных для оценки эпизоотической ситуации, а также для приготовления вакцинных препаратов.

Начиная с 1959 года, когда высокопатогенный вирус гриппа Н5N1-субтипа впервые был зарегистрирован у кур, выделено большое количество вирусов этого субтипа от диких, домашних птиц и млекопитающих, в том числе человека. С середины 1990-х новый HPAI H5N1 вариант стал эндемичным в Юго-Восточной Азии. Впервые выделенный в 1996 от домашних птиц в Гонконге, он вызывал смертность у кур более 90% и стал причиной летальных случаев у людей. По состоянию на 10 сентября 2008 г. всего зафиксировано 387 случаев инфицирования человека гриппом птиц (H5N1), в 245 случаях заболевание закончилось летальным исходом [http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/ru/index.html]. С 2005 года на всей территории Евразии и Северной Африки было зарегистрировано несколько крупных вспышек среди диких птиц. Крупнейшая эпизоотия среди диких птиц летом 2006 года была зарегистрирована на оз.Убсу-Нур (Республика Тыва) [Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Дерябин П.Г. и др. Изоляция высокопатогенных (HPAI) штаммов вируса гриппа А/ H5N1 от диких птиц в очаге эпизоотии на озере Убсу-Нур (июнь 2006 г.) и их депонирование в Государственную коллекцию вирусов РФ (3 июля 2006 г.). Журн. Вопросы вирусологии. 2006, 6: 14-18]. В это время авторами настоящего изобретения был выделен вирус H5N1 от клинически здоровой особи сизой чайки {Larus canus). Выделенный штамм назван А/ common gull/Chany/2006.

Известен штамм A/duck/Novosibirsk/56/05 субтип H5N1 вируса гриппа птиц (аналог), выделенный на территории Западной Сибири, который используется для моделирования вирусной инфекции в научных экспериментах при изучении эффективности противовирусных препаратов на культурах клеток (Патент RU 2309983, МПК С12N 7/00, опубл. 27.05.2007 г.).

Однако указанный штамм имеет следующие недостатки: штамм имеет пониженную продуктивность при культивировании на клетках МДСК - максимальная концентрация вируса 6,5 lg ТСID ₅₀/мл. Штамм предназначен для производства профилактических и диагностических препаратов и, исходя из представленных данных о патогенности для культур клеток и отсутствия данных о патогенности для животных, в т.ч. мышей, может быть использован для оценки противовирусной активности различных соединений только на культуре клеток.

Наиболее близким штаммом (прототипом) является штамм А/БАК/РОССИЯ/05 (субтип H5N1) вируса гриппа птиц (Патент RU 2300564, МПК С12N 7/00, опубл. 10.06.2007 г.). Указанный штамм может быть использован для получения антигена и создания вакцинных и диагностических препаратов. Данных о патогенных свойствах штамма для лабораторных животных, в т.ч. мышей, не имеется. Однако он вызывает гибель РКЭ на первые сутки после инфицирования, причем титр антигена в РГА после проведенного пассажа на РКЭ более низкий по сравнению с предлагаемым штаммом.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение такого штамма-продуцента вируса гриппа птиц, который обладал бы более высокой продуктивностью по сравнению с известными штаммами H5N1.

Указанный технический результат достигается получением штамма вируса гриппа птиц A/common gull/Chany/2006 H5N1 субтипа для приготовления антигенсодержащего диагностического или вакцинного препарата.

Характеристика заявляемого штамма. Штамм A/common gull/Chany/2006 является типичным представителем вирусов гриппа птиц род Influenzavirus А семейство Orthomyxoviridae. Заявляемый штамм выделен из клоакального смыва от клинически здоровой особи сизой чайки (Larus canus) на озере Чаны (Здвинский район Новосибирской области) в результате вирусологических исследований в июле 2006 г.

Штамм депонирован в коллекцию культур микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор») Роспотребнадзора под регистрационным номером № V-368.

Культуральные свойства. Штамм A/common gull/Chany/2006 при культивировании на монослое клеток МДСК вызывает цитопатическое действие (ЦПД) на 2-4 сутки (температура культивирования 37°С, в атмосфере 5% СO₂), при этом титр составляет 7,2±0,1 lg ТСID₅₀/мл. При заражении в клеточную суспензию титр составил 7,8±0,2 lg ТСID₅₀/мл.

Штамм A/common gull/Chany/2006 при культивировании в клеточной суспензии почки кошки ПК-91 титр составляет 8,4±0,15 lg ТСID₅₀/мл.

Для культивирования штамма на культурах клеток МДСК и ПК-91 используют питательную среду ДМЭМ, с добавлением 2,5% эмбриональной сыворотки коров, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.

Патогенность для кур.

Для подтверждения патогенного потенциала вируса нами был поставлен тест на цыплятах. В эксперименте на цыплятах индекс патогенности (IVPI) - 1,7. Ранее изученные высокопатогенные вирусы гриппа H5N1-субтипа, выделенные в Западной Сибири в 2005-2006 годах, имеют индекс патогенности >2,5 [Онищенко Г.Г., Шестопалов A.M., Терновой В.А и др. Выявление в Западной Сибири высокопатогенных H5N1 вирусов гриппа, генетически родственных вирусам, циркулирующим в Юго-восточной Азии в 2003-2005 гг. Журн. Доклады Академии наук. 2006, 2 (406): 1-3.].

Патогенность для млекопитающих. Штамм A/common gull/Chany/2006 относится к вариантам вируса гриппа, патогенным для мышей, хорьков: вызывает гибель беспородных белых мышей и мышей линии BALBc, а также тяжелое заболевание у беспородных хорьков при интраназальном инфицировании. При этом хорьки способны длительно выделять вирус во внешнюю среду при кашле и чихании в титрах, соответствующих инфицирующей дозе.

Для длительного хранения штамм необходимо лиофилизировать с использованием в качестве защитной среды раствора желатина и сахарозы (САЖ). Лиофилизация с добавлением САЖ в соотношении 1:4 позволяет сохранить стабильную инфекционную активность вируса в течение не менее 2 лет при хранении на -70°С.

Идентификация вируса. Изоляцию вируса на развивающихся куриных эмбрионах и его серологическую идентификацию проводили согласно описанным ранее методикам [The National Training Course on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance. - Harbin, 2001. - 79 р.]. Заявляемый штамм нарабатывается на РКЭ в титрах 9,8±0,2 lg ЭИД ₅₀/мл. Результаты сравнительного антигенного анализа представлены в таблице 1.

Таблица 1.
Антигенный анализ штамма A/common gull/Chany/2006
	Сыворотки
	Ck/Hidag/95	Gs/HK/99	HK/156/97	HK/213/03	VN/1203/04	Prachirnbrr/04	Tk/Suzdalka/05	Reference antiserum (H5) CDC (USA)
A/common gull/Chany/2006	1280	1280	1280	640	640	320	160	2560
Примечание. В таблице 1 указаны обратные значения разведения сывороток, тормозящие гемагглютинацию 4 ГАЕ вируса.

Антиген вируса проявил высокое сродство к поликлональным сывороткам, полученным на высокопатогенные вирусы H5N1, циркулирующие в странах Юго-Восточной Азии. Это позволяет использовать антиген для исследования сывороток на наличие антител к целому спектру высокопатогенных вирусов гриппа H5N1 субтипа.

Определен сиквенс полного генома штамма. Нуклеотидные последовательности генов задепонированы в Genbank под номерами: EU 871936, EU 871937, EU 871938, EU 871939, EU 871940, EU 871941, EU871942, EU 871943.

Анализ полногеномного сиквенса выделенного штамма выявил принадлежность его к Цинхай-Сибирскому генотипу, циркулирующему в мире с весны 2005 г [Normil D. Avian influenza. Potentially more lethal variant hits migratory birds in China. Science. 2005, 309(5732):231.]. Нуклеотидная последовательность сайта протеолитического нарезания гемаггютинина определяет аминокислотную последовательность PQGERRRKKRGLF, характерную для высокопатогенных вирусов гриппа типа A [Ellis Т.М., Bousfield R.B., Bissett L.A. et al. Investigation of outbreaks of highly pathogenic H5N1 avian influenza in waterfowl and wild birds in Hong Kong in late 2002. Avian Pathol. 2004 Oct; 33(5):492-505].

Филогенетический анализ выполнен по методу Maximum Parsinomy, с бутстреп анализом (500 повторов) на основании нуклеотидной последовательности гена гемагглютинина. Приведен фрагмент филогенетического дерева, содержащий филогенетически близкие вирусы. Изучаемый нами штамм филогенетически близок с высокопатогенными вирусами H5N1, выделенными при вспышке среди диких птиц на озере Убсу-Нур (Республика Тыва) [Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Дерябин П.Г. и др. Изоляция высокопатогенных (HPAI) штаммов вируса гриппа А/H5N1 от диких птиц в очаге эпизоотии на озере Убсу-Нур (июнь 2006 г.) и их депонирование в Государственную коллекцию вирусов РФ (3 июля 2006 г.). Журн. Вопросы вирусологии. 2006, 6:14-18.], летом 2006 г., которые несколько отличаются от всех остальных H5N1, запатентованных в 2005 (A/duck/Novosibirsk/56/05, A/Chicken/Kurgan/05/2005, А/БАК/РОССИЯ/05). На чертеже приведен фрагмент филогенетического дерева генов НА гемагглютинина H5N1 субтипа.

Штамм A/common gull/Chany/2006 обладает уникальными биологическими характеристиками, позволяющими использовать его для приготовления антигенсодержащего субстрата для серодиагностики высокопатогенного гриппа H5N1 субтипа в РТГА, в частности исследование наличия антител в сыворотках крови диких птиц для оценки эпизоотической ситуации (см. пример 2). При этом он обладает рядом приемуществ. (см. пример 1).

Благодаря молекулярно-биологическим характеристикам и эффективному культивированию штамма A/common gull/Chany/2006 может быть использован как контрольный при тестировании систем выделения РНК вируса гриппа H5N1 субтипа и систем ПЦР диагностики.

Очень важно, что при длительном хранении A/common gull/Chany/2006 в виде антигена, инактивированного -пропиолактоном, при температуре +4 - +7С, сохраняет без снижения гемагглютинирующий титр в пределах 1/256-1/1024 с эритроцитами различных видов млекопитающих и птиц (гусь, курица, макака-резус, морская свинка, лошадь, баран, хорек, человек) в течение 14 месяцев, (продолжающийся срок наблюдения).

Пример 1. Изучение антигенных свойств штамма A/common gull/Chany/2006 вируса гриппа для создания панели антигенов.

Предлагаемый штамм обладает преимуществом в РТГА, например, по сравнению с коммерческим референс антигеном Н5 CDC (США).

Таблица 2.
Результаты РТГА исследованных антигенов с коммерческими референс сыворотками и сыворотками, полученными на штаммы H5N1, выделенные в России.
Антиген	Сыворотки
Референс-сыворотка Н5 CDC	Референс-сыворотка H5N1 (St. Jude)	Моноклон Н5 СР62&364/I	H5N31	Краснодар2	Тыва3
Референс-антиген H5 CDC	5120	5120	16384	160	80	<80
A/common gull/Chany/2006	10240	10240	2048	160	640	640
- 1 - антисыворотка к вирусу гриппа A/Anas platyrhynchs/Chany/9/03 (H5N3)
- 2 - антисыворотка к вирусу гриппа A/Chicken/Krasnodar/06 (H5N1)
- 3 - антисыворотка к вирусу гриппа A/duck/Tuva/01/06 (H5N1)

Из представленных в таблице 2 данных видно, что в высокотитражных сыворотках (референс сыворотки из CDC и St. Jude) антитела к Н5 выявляются в РТГА со всеми использованными антигенами. Однако титры с антигеном предлагаемого штамма выше. В сыворотках хорьков, переболевших гриппом, вызванным высокопатогенными штаммами A/H5N1, выделенными в России, в РТГА с референс антигеном антитела к Н5 гемагглютинину не выявляются (анти-A/duck/Tuva/01/06) или выявляются в предельном титре, равном 80 (анти-A/Chicken/Krasnodar/06).

В низкотитражной сыворотке, полученной после иммунизации непатогенным штаммом A/Anas platyrhynchs/Chany/9/03 (H5N3), антитела к Н5 гемагглютинину определялись в равной степени использованными антигенами.

Пример 2. Ретроспективная серодиагностика сывороток диких перелетных птиц.

Проведено скрининговое исследование сывороток крови от диких птиц с использованием различных антигенов (таблица 3):

1. Антиген предлагаемого штамма A/common gull/Chany/2006.

2. Антиген штамма A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 (патент 2008 № 118903 от 13.05.2008).

3. Антиген для диагностики гриппа птиц H5N3 (ОАО «Покровский завод биопрепаратов»).

Было исследовано 43 образца сывороток.

Таблица 3.
Значения обратных титров положительных сывороток крови диких птиц на наличие антител к вирусу гриппа Н5 субтипа в РТГА.
Сыворотка	Антиген для диагностики гриппа птиц H5N3(ОАО «Покровский завод биопрепаратов»)	Антиген A/common gull/Chany/2006	Антиген A/Goose/Krasnoozerskoye/627/ 05
1	512	2048	128
2	64	1024	<16
3	64	512	<16
4	128	128	<16
5	64	256	<16
6	128	256	<16
7	128	512	64
8	128	256	32
9	128	256	<16
10	64	512	16
11	64	128	32
12	128	1024	16
13	128	512	<16
14	64	256	<16
15	64	512	<16

При использовании антигена для диагностики гриппа птиц H5N3 (ОАО «Покровский завод биопрепаратов») положительными оказались 89% сывороток, антигена предлагаемого штамма A/common gull/Chany/2006 - 100%, антигена штамма A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 (заявка на изобретение № 2008118903 от 13.05.2008) - 33%.

Поликлональные сыворотки от диких птиц проявляют большее сродство к антигену предлагаемого штамма, что позволяет с большей достоверностью детектировать наличие антител. В соответствии с рекомендациями ВОЗ положительными считают сыворотки с титром в РТГА 1/40 [Ellis Т.М., Bousfield R.B., Bissett L.A. et al. Investigation of outbreaks of highly pathogenic H5N1 avian influenza in waterfowl and wild birds in Hong Kong in late 2002. Avian Pathol. 2004 Oct; 33(5):492-505.]. Таким образом антиген A/common gull/Chany/2006 выявляет 100%.

Благодаря сниженной патогенности для кур по сравнению с другими штаммами (см описание штамма), характеристикой штамма A/common gull/Chany/2006 является высокая репродуктивная способность в развивающихся куриных эмбрионах. Титр вируса в эксперименте достигал 9,8±0,2 lg ЭИД₅₀ /мл, титр антигена в РГА 1:1024 в 50 мкл (20240ГАЕ/мл).

Уникальные биологические свойства предлагаемого штамма обеспечивают технологическое преимущество, по сравнению с другими, поскольку позволяют нарабатывать антиген высокого качества в большом количестве. Предлагаемый штамм A/common gull/Chany/2006 может быть использован совместно с другими известными для более детального исследования антигенных характеристик вновь выделяемых штаммов H5N1 и серодиагностики сывороток крови животных.

Пример 3. Изучение возможности использования заявляемого штамма A/common gull/Chany/2006 в качестве вакцинного препарата. Штамм обладает хорошими иммуногенными свойствами как для млекопитающих, так и для птиц.

В экспериментах по интраназальному заражению беспородных хорьков дозой 10 ⁶ EID/мл по истечение 21 суток после инфицирования была отобрана сыворотка крови. Методом РТГА с антигеном штамма A/common gull/Chany/2006 показано присутствие антигемагглютинирующих антител в титрах 1/1280-1/2560.

При интраназальном заражении мышей различными дозами, у выживших мышей была отобрана сыворотка крови на 21 сутки после инфицирования. Методом РТГА с антигеном штамма A/common gull/Chany/2006 показано присутствие антигемагглютинирующих антител в титрах 1/160-1/2560.

В соответствии с рекомендациями ВОЗ, положительными считают сыворотки с титром в РТГА 1/40 (WHO, 2002). Таким образом, заявляемый штамм обладает хорошими иммуногенными свойствами в отношении млекопитающих. Поэтому существует возможность дальнейшей разработки вакцинного препарата для млекопитающих при использовании инактивированного антигена на основе предложенного штамма, как одного из компонентов вакцины против вируса гриппа H5N1.

При пероральном/интраназальном заражении домашних уток (Anas platyrhynchos domesticus) дозой 10⁶ EID/мл была собрана сыворотка крови на 23 сутки после инфицирования. Методом РТГА с антигеном штамма A/common gull/Chany/2006 показано присутствие антигемагглютинирующих антител в титрах 1/800-1/1600. В соответствии с рекомендациями ВОЗ, положительными считают сыворотки с титром в РТГА 1/40 (WHO, 2002). Таким образом, они обладают хорошими иммуногенными свойствами в отношении птиц. Поэтому существует возможность дальнейшей разработки вакцинного препарата для птиц при использовании инактивированного антигена на основе предложенного штамма, как одного из компонентов вакцины против вируса гриппа H5N1.

Как указывалось выше, характеристикой штамма A/common gull/Chany/2006 является высокая репродуктивная способность в развивающихся куриных эмбрионах (титр антигена в РГА 1:1024 в 50 мкл (20240ГАЕ/мл), что обеспечивает технологическое преимущество данного штамма, по сравнению с другими, поскольку позволяет нарабатывать антиген высокого качества в большом количестве. В комплексе с данными о сниженной патогенности предложенного штамма A/common gull/Chany/P/2006 для развивающихся куриных эмбрионов и возможности суперпродукции НА-антигена, очевидна перспектива дальнейших исследований по разработке вакцинного препарата при использовании антигена на основе предложенного штамма, как одного из компонентов вакцины против вируса гриппа H5N1.

Таким образом, биологические свойства данного штамма, детерминированные уникальной первичной структурой, определяют его высокую иммуногенную активность. Это позволяет рассматривать предложенный штамм, как потенциальный при использовании его в создании вакцинного препарата.