способ лечения заболеваний печени различного генеза

Формула изобретения

Способ лечения заболеваний печени различного генеза путем введения гепатопротекторного средства, отличающийся тем, что в качестве гепатопротекторного средства используют производные бис (2-тио-4,6-диоксо-1,2,3,4,5,6-гексагидропиримидин-5-ил)арилметанов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения заболеваний печени различного генеза.

Известны способы лечения заболеваний печени путем введения в организм органических гепатопротекторных средств природного или синтетического происхождения, например «Essentiale», действующее вещество - фосфолипиды эссенциальные (http://essenciale.lek-va.ru/) проникают в клетки печени, внедряются в мембраны гепатоцитов, нормализуют в определенной степени функции печени, метаболизм липидов и белков, улучшают регенерацию и тормозят формирование в печени соединительной ткани.

Более эффективен способ лечения заболеваний печени путем введения простенона, RU 1821209 А1.

По сравнению с вышеописанным способом обеспечивается сокращение сроков наступления ремиссии, способ более эффективен в отношении редуцирования таких проявлений заболевания, как слабость, повышенная утомляемость, тяжесть в правом подреберье; гипераланинемия, гипербилирубенемия, повышенные показатели щелочной фосфатазы и тимоловой пробы, содержания в крови альбуминов, гамма-глобулинов, иммуноглобулинов А и G, кортизола; происходит нормализация нарушенного соотношения между Т-хелперами и Т-супрессорами, снижение содержания в крови белковосвязанного оксипролина.

Основным недостатком этого способа является то обстоятельство, что он не может быть реализован при наличии достаточно широкого круга сопутствующих заболеваний, являющихся противопоказанием для назначения простагландинов Е: патология женской половой сферы, гипотония, диарея различной этиологии, заболевания век, аллергические реакции и др.

Известен также способ лечения заболеваний печени различного генеза путем введения гепатопротекторного средства, в котором с целью повышения эффективности лечения используют средство (в дальнейшем ТДАА), содержащее трис-[N-(2,3-диметилфенил) антранилато] алюминий, сахар молочный, крахмал, поливинилпирролидон низкомолекулярный, твин 80, аэросил А-380, кальций стеариновокислый при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Трис-[N-(2,3-диметилфенил) антранилато] алюминий	45,24-50,00
Сахар молочный	4,52-5,0
Крахмал	39,21-43,36
Поливинилпирролидон	3,39-3,75
Твин-80	0,72-0,80
Аэросил А-380	0,95-1,05
Кальций стеариновокислый	0,95-1,05,

RU 2035906 C1.

Данный способ принят в качестве прототипа настоящего изобретения.

Эффективность и безвредность способа-прототипа проверялась на лабораторных животных. При этом установлено, что хотя прототип обладает определенным гепатопротекторным действием, уровень защитного действия при реализации способа-прототипа сравнительно невысокий; кроме того, способ-прототип не оказывает направленного влияния на уровень эндогенного интерферона альфа и не инактивирует таким образом вирусы гепатита различного типа, в том числе широко распространяющегося вируса гепатита С.

Задачей настоящего изобретения является создание способа лечения гепатитов различного генеза, обеспечивающего повышение эффективности защиты клеток печени, а также обеспечение специфической противовирусной активности, реализуемой за счет индукции синтеза в организме собственного эндогенного интерферона альфа.

Согласно изобретению в способе лечения заболеваний печени различного генеза путем введения гепатопротекторного средства в качестве гепатопротекторного средства используют производные бис(2-тио-4,6-диоксо-1,2,3,4,5,6-гексагидропиримидин-5-ил)арилметанов.

Производные бис (2-тио-4,6-диоксо-1,2,3,4,5,6-гексагидропиримидин-5-ил)арилметанов имеют общую формулу:

,

где Х выбран из группы кислород, сера,

R¹ выбран из группы водород, алкоксигруппа,

R² выбран из группы нитрогруппа, гидроксигруппа, алкоксигруппа,

Cat⁺ выбран из группы протон, пиридиний- или 2-гидроксиэтил-аммоний-катион

В заявляемом способе использованы следующие производные:

Применяемые в способе вещества являются новыми и приведены ниже в таблице 1.

Таблица 1.
№	X	Cat	R1	R2	Название
I	O	H3N +CH2CH2OH	H	NO2	2-гидроксиэтиламмониевая соль бис(2-тио-4,6-диоксо-1,2,3,4,5,6-гексагидропиримидин-5-ил)(4-нитробензил)метана
II	S	C5H 5NH+	H	ОН	пиридиниевая соль бис(2-тио-4,6-диоксо-1,2,3,4,5,6-гексагидропиримидин-5-ил)(4-гидроксибензил)метана
III	S	C5H 5NH+	H	NO2	пиридиниевая соль бис(2-тио-4,6-диоксо-1,2,3,4,5,6-гексагидропиримидин-5-ил)(4-нитробензил)метана
IV	S	C5H 5NH+	MeO	MeO	пиридиниевая соль бис(2-тио-4,6-диоксо-1,2,3,4,5,6-гексагидропиримидин-5-ил)(2,4-диметоксибензил)метана
V	O	H+	H	NO2	бис(2-тио-4,6-диоксо-1,2,3,4,5,6-гексагидропиримидин-5-ил)(4-нитробензил)метан

Вещества I-IV получены следующим образом:

Смесь 3 ммоль барбитуровой кислоты и 1,5 ммоль соответствующего альдегида в 10-15 мл пиридина кипятят с обратным холодильником в течение 1-2 ч. После охлаждения реакционной массы осадок отфильтровывают, промывают ацетоном и сушат при 55-60°С при остаточном давлении 30 мм рт.ст. Для выделения тиопроизводных из реакционной массы к ней добавляют 10-20 мл диоксана или воды, выпавший осадок отфильтровывают, промывают этанолом и сушат. Для проведения реакций используют 3 ммоля барбитуровой кислоты и 1,5 ммоля соответствующего альдегида. Для выделения продуктов из реакционной массы к ней добавляют 10-20 мл диоксана или воды, выпавший осадок отфильтровывают, промывают этанолом и сушат.

Для получения вещества V к смеси 1 г 2-тиобарбитуровой кислоты и 10 мл этанола добавляют раствор 0.5 г бензальдегида в 10 мл этанола. После перемешивания реакционной массы при 20°С в течение 20-30 мин осадок отфильтровывают и сушат.

Ниже в таблице 2 приведены спектры протономагнитного резонанса растворов веществ I-V в диметилсульфоксиде.

Таблица 2
№	С	Ar	Ру	NH
I	5.91 с	6.82 д (2Н, Н2,6), 7.47 д (2Н, Н3,5), J 8 Гц	2.69 т (4Н, CH2N), 3.44 т (4Н, CH2O), J 5.4 Гц	-
II	5.87 с	6.55 д (2Н, Н2,6), 6.77 д (2Н, Н3,5), J 8.3 Гц	7.65 м (4Н. Н3,5), 8.10 м (2Н, Н4), 8.71 м (4Н, Н 2,6)	11.57 с
III	6.06 с	7.25 д (2Н, Н2,6), 8.06 д (2Н, Н3,5), J 8.5 Гц	7.69 м (4Н. Н3,5), 8.15 м (2Н, Н4), 8.72 м (4Н, Н 2,6)	11.72 с
IV	5.85 с	6,31 д (1Н, Н5), 6,35 с (1Н, Н3), 6.91 д (1H, Н6), J 8.4 Гц	7.61 м (4Н. Н3,5), 8.06 м (2Н, Н4), 8.70 м (4Н, Н2,6)	11.47 с
V	6.06 с	7.26 д (2Н, Н2,6), 8.07 д (2Н, Н3,5), J 8.3 Гц	-	11.69 с

Заявленный способ поясняется приводимыми далее примерами.

Известно, что механизмы гепатотоксичности - воспаление, цитолиз и холестаз - универсальны и неспецифичны вне зависимости от агента, индуцирующего повреждение печени [Frezza E.E. et al. Sex hormones and trace elements in rat CCl₄-induced cirrhosis and hepatocellular carcinoma. - European Journal of Cancer Prevention. 2(4), 357-359, 1993; Lin S.C. et al. Hepatoprotective effects of Taiwan folk medicine: Ixeris chinensis (Thunb.) Nak on experimental liver injuris. - American Journal of Chinese Medicine. 22(3-4), 243-54, 1994.]. Таким образом, повреждения клеток печени сходны как при гепатите, вызванном различными бактериями, в том числе рода Leptospira, химическими воздействиями на производствах или в результате попадания отравляющих веществ в воду или продукты питания, а также являющимися результатом воздействия алкоголя, ряда лекарственных препаратов, например цитостатиков, радиационным воздействием, а также различными вирусами (вирусы гепатита А, Е, В, D, С и некоторыми пока окончательно неидентифицированные).

В отношении противовирусной защиты следует отметить, что реализация заявляемого способа вызывает в организме человека повышение уровня эндогенного интерферона альфа. Интерферон альфа способствует защите клеток от различных вирусов, в том числе и поражающих клетки печени (Hoofnagle, J.H., Di Bisceglie, A.M. (1997). The Treatment of Chronic Viral Hepatitis. NEJM 336: 347-356; Malaguarnera M., Di Fazio I., Ferlito L., Pistone G., Restuccia N., Trovato B.-A., Romano M. A comparison of four types of interferon alpha in the treatment of chronic hepatitis C. Curr Ther Res Clin Exp. 1998; 59 (1): 48-59).

Заявленный способ проверен на 100 нелинейных крысах-самцах массой 250-270 г на доступной и воспроизводимой модели токсического гепатита. Животные поступили из питомника «Рапполово», Санкт-Петербург.

Экспериментальным животным, за исключением интактных, вводили токсикант - CCl₄ в дозе 1,0 мл/кг в 50% растворе оливкового масла внутрижелудочно (в/ж) ежедневно в течение 5 дней через атравматический зонд. Через 5 дней наличие токсического гепатита подтверждалось по морфологической картине печени, биохимическим и функциональным показателям. Через 24 ч после последнего введения гепатотоксиканта оставшиеся в живых крысы были рандомизированы по массе и разделены на опытные группы. Животным групп 3, 4 и 5 вводили известные гепатопротекторы, животным групп 6-10 вводили приведенные в таблице 1 вещества:

группа 1 - интактная (n=10);

группа 2-CCl₄ (n=10);

группа 3 - CCl₄ + Эссенциале в/ж 100 мг/кг (n=10);

группа 4 - CCl₄ + Карсил в/ж 100 мг/кг (n=10);

группа 5 - CCl₄ + ТДАА;

Гепатопротекторы вводили с лечебной целью в течение 10 дней в следующих дозах: эссенциале - 100 мг/кг; карсил - 100 мг/кг; способ-прототип - ТДАА - 100 мг/кг, заявленный способ - вещества I-V - 50 мг/кг. Животные 2 группы вместо лечения получали эквиобъемное количество CCl₄. Введение осуществлялось внутрижелудочно с помощью атравматичного металлического зонда. В качестве растворителя использовали легкую крахмальную взвесь.

Декапитацию крыс проводили под легким эфирным наркозом через 5 и 10 дней после начала эксперимента.

Для дифференциальной диагностики основных патологических синдромов определяли активность ферментов печеночного происхождения в сыворотке крови. Оценку степени выраженности цитолитического, холестатического и мезенхимально-воспалительного синдромов проводили с помощью стандартных биохимических методик с использованием реактивов Био-Ла-Тест фирмы "Lachema". При исследовании уровня индикаторных ферментов цитолитического синдрома определяли активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), -глутамилтрансферазы ( -ГТФ) и кислой фосфатазы (КФ). Экскреторную функцию печени оценивали также по содержанию билирубина и активности экскреционного фермента-маркера холестаза щелочной фосфатазы (ЩФ). Содержание в крови липидов определяли по уровню холестерина и общих липидов, диспротеинемию - по уровню общего белка и тимоловой пробе [1. Методические указания по изучению гепатозащитной активности фармакологических веществ. В кн.: Руководство по экспериментальному (доклиническорму) изучению новых фармакологических веществ. М., Ремедиум. 2000, с.228-231; 2. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник под ред. В.В.Меньшикова. М., Медицина, 1987, 365 с].

Перекисное окисление липидов и активность антиоксидантной системы печени оценивали по содержанию восстановленного глутатиона в печени [Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник под ред. В.В.Меньшикова. М., Медицина, 1987, 365 с], резерву сульфгидрильных групп в крови [Клиническая оценка лабораторных тестов. Под ред. Н.У.Тица, М., Медицина, 1986, 480 с. Kindsay R.H., Kitchm K.T., Sedlak J., Lindsay R.H. Estimation of total protein bound and nonprotein sulfhudryl group in tissues with Ellman plangent. // Anal/biochem., 1968. - 25(1-3). - p.192-205].

Динамику массы тела крыс определяли на весах ВЛР-500.

Печень животных для определения ее относительной массы (отношение массы печени в 1 мг к массе тела в 1 г), характеризующей степень выраженности воспалительного процесса в органе, взвешивали на электронных весах 1602 МР фирмы "Sartorius" [Венгеровский А.И., Маркова И.В., Соратиков А.С. Доклиническое изучение гепатозащитных средств. Методические рекомендации. Ведомости Фарм. Комитета, 1999. - № 2. - с.9-12].

При проведении гексеналовой пробы крысам вводили внутрибрюшинно гексенал в дозе 80 мг/кг. Продолжительность наркоза животных позволяет оценить скорость метаболизма гексенала, осуществляемого цитохром Р-450-зависимой монооксигеназной системой гепатоцитов, и характеризует состояние антитоксической функции печени [Венгеровский А.И., Маркова И.В., Соратиков А.С. Доклиническое изучение гепатозащитных средств. Методические рекомендации. Ведомости Фарм. Комитета, 1999. - № 2. - с.9-12, Клиническая оценка лабораторных тестов. Под ред. Н.У.Тица, М., Медицина, 1986, 480 с. Kindsay R.H., Kitchm K.T., Sedlak J., Lindsay R.H. Estimation of total protein bound and nonprotein sulfhudryl group in tissues with Ellman plangent. // Anal/biochem., 1968. - 25(1-3). - p.192-205. Кигель Г.Б. Харабаджахьян А.В. Показатели биологической нормы для лабораторных животных. Ростов-на-Дону, 1978, 95 с.].

Пробы крови и печени брали у животных после эвтаназии нембуталом в дозе 70 мг/кг.

Кроме вышеперечисленных параметров об эффективности лечения судили по клинической картине и выживаемости животных.

Применение гепатопротекторов снижало смертность животных в группах и значительно улучшало общее состояние крыс, в то время как отсутствие лечения негативно сказывалось на выживаемости крыс. Перед гибелью у крыс наблюдали геморрагические высыпания вокруг носа, диарею и резкую потерю в весе.

Все выжившие животные были малоактивными, окраска шерсти приобретала желтушный оттенок.

По результатам исследования (выживаемости, клинической картине, биохимическим и функциональным показателям), а также по результатам гистологического исследования можно сделать вывод, что после введения CCl₄ была сформирована модель тяжелой и среднетяжелой степени отравления.

Выживаемость в группах 2-10 к окончанию введения CCl₄ и гепатопротекторов (15 дней) приведена в таблице 3.

Поскольку показатели, в том числе выживаемость в группах 6-10 практически не отличается друг от друга, то в графе 6 таблицы 3 и далее приведены общие, усредненные и округленные показатели для групп 6-10 животных.

В таблице 4 приведены морфометрические, биохимические и функциональные показатели состояния печени экспериментальных животных при интоксикации CCl₄ и лечении согласно заявленному способу в сравнении со способами лечения препаратами эссенциале и карсилом, а также способом-прототипом.

Таблица 4.
Показатели	Группа 1	Интоксикация CCl4
Группа 2	Группа 3	Группа 4	Группа 5	Группы 6-10
1	2	3	4	5	6	7
Вес тела, г	261.4	201.4	224.0	217.2	206.3	227.2
Относит. масса печени, мг/100 г	36.3	55.33	49.03	48.78	43.7	48.96
Общий белок, сыворотка, г/л	7.44	5.36	7.1	6.9	6.5	6.8
Общие липиды, сыворотка, г/л	3.5	2.5	3.4	3.2	2.9	3.3
АЛТ, Е/л	124.2	726	378	398	450	410
ACT, Е/л	314	747	478	530	495	474
ЛДГ, ммоль/ч/л	4.7	9.4	6.3	6.72	6.9	6.3
-ГТФ, Е/л	4.0	20.0	15.0	14.8	15.5	14.6
КФ, мккат/л	0.76	1.34	0.94	1.03	0.99	0.92
ЩФ, мккат/л	0.68	1.21	0.93	0.99	1.03	0.90
Тимоловая проба, ед. помутнен.	1.46	5.72	3.10	3.50	3.10	3.72
Холестерин, сыворотка, ммоль/л	1.74	1.30	1.56	1.44	1.42	1.56
Билирубин, сыворотка, мкмоль/л	3.14	7.22	3.84	3.92	4.2	3.76
SH-группы, сыворотка, мг %	1508	410	1062	1074	998	1084
Восстановленный глутатион, мг%	171	72	130	121	116	130
Гексеналовый сон, мин	25.9	89.40	31.40	41.50	40.0	30.6

Из таблицы 4 видно, что заявленный способ лечения токсического поражения печени путем введения производных бис(2-тио-4,6-диоксо-1,2,3,4,5,6-гексагидропиримидин-5-ил) арилметанов существенно эффективнее известных способов.

У крыс после проведенной согласно заявленному способу терапии значительно уменьшались проявления цитолиза. Об этом свидетельствовало снижение степени активности индикаторных ферментов (АЛТ, ACT, ЛДГ, -ГТФ, КФ) в сыворотке крови по отношению к активности этих ферментов в группе без лечения. Одновременно происходила коррекция синтетической и пигментообразующей функции печени, о чем говорило увеличение сывороточного содержания общего белка, общих липидов и снижение содержания общего билирубина. Результаты тимоловой пробы указывали на достоверное снижение диспротеинемии.

Существенным звеном в патогенезе поражений печени является холестаз. О степени его выраженности судили по показателям холестерина, ЩФ и уровню билирубина. Все препараты ослабляли холестаз, снижая активность ЩФ, гипербилирубинемию и гиперхолестеринемию.

Отмеченные позитивные изменения биохимических процессов сопровождались восстановлением детоксикационной функции печени, что выражалось в достоверном сокращении длительности гексеналового сна во всех исследуемых группах с применением гепатопротекторов. Параллельно с этим снижался отек печени и восстанавливалась первоначальная масса животных. Судя по полученным данным, лечение устраняло прооксидантное действие CCl₄, что выражалось в достоверном увеличении содержания сульфгидрильных групп и восстановленного глутатиона.

В результате проведенного лечения улучшалось общее состояние животных: крысы были подвижны, шерсть вернула первоначальный блеск и окраску, животные стали потреблять больше корма.

Эффективность заявленного способа подтверждается также данными гистологических исследований. При воздействии CCl₄ в печени крыс без лечения сохранялись дистрофические изменения гепатоцитов в виде диффузной жировой дистрофии. При окраске гематоксилин-эозином наблюдалась неразличимость клеточных границ и вакуолизация цитоплазмы. После реализации способа по настоящей заявке изменения стромы печени были минимальными, проявляясь в наличии небольших очагов пролиферации клеточных элементов.

Кроме того, было проведено изучение интерферониндуцирующей активности заявляемого способа. Главное внимание было уделено оценке индукции появления в сыворотке крови интерферона альфа, защищающего организм от различных вирусных инфекций (Hoofnagle, J.H., Di Bisceglie, A.M. (1997). The Treatment of Chronic Viral Hepatitis. NEJM 336: 347-356).

В работе использовали белых беспородных мышей весом 18-22 г. Препараты гомогенизировали в физиологическом растворе с добавлением Твина-80 и вводили животным через зонд в объеме 0,2 мл. У животных брали кровь через 2, 4, 6, 8, 12 и 24 ч после введения препарата использовали для определения его противовирусной активности.

Использованы 4 группы животных, по 10 животных в каждой группе:

1 - контрольная группа - получали только растворители,

2 - введение эссенциалле, в/ж,

3 - введение карсила, в/ж,

4 - циклоферон - внутрибрюшинно,

5 - способ-прототип,

6 - заявленный способ.

Препараты вводили в следующем количестве: эссенциале - 100 мг/кг; карсил - 100 мг/кг; циклоферон 100 мг/кг, прототип - ТДАА - 100 мг/кг, заявленный способ - 50 мк/кг. Циклоферон вводили внутрибрюшинно, введение остальных препаратов осуществлялось внутрижелудочно с помощью атравматичного металлического зонда. В качестве растворителя использовали легкую крахмальную взвесь.

Клетки линии L 929 выращивали в 96-луночных планшетах, инкубировали при 37°С в течение суток с различными количествами сыворотки животных. Вирус везикулярного стоматита (штамм Indiana) в дозе 100 CTD50 вносили в лунки планшета и инкубировали при 37°С в течение 30-40 ч. По окончании инкубации клетки промывали фосфатным буфером, окрашивали 30 мин 0,1% раствором кристалл-виолета в 30% этаноле, промывали физиологическим раствором, высушивали на воздухе и экстрагировали краситель 30 мин 30% раствором этанола. Полученный раствор переносили в другой планшет и измеряли оптическую плотность в ячейках при длине волны 580 нм.

О защитном действии сыворотки крови судили по уменьшению проявления цитопатогенного действия вируса везикулярного стоматита, выражающемуся в возрастании оптической плотности в соответствующих ячейках по сравнению с лунками негативного контроля. За титр интерферона принимали величину, обратную наибольшему разведению сыворотки, обеспечивающему достоверное повышение оптической плотности в ячейках, возможному только при большем количестве сохранившихся клеток.

Данные по противовирусной защите сыворотки крови животных на разных сроках после введения препарата приведены в таблице 5.

Таблица 5.
Препарат	Титр интерферона на срок после введения препарата, ч
2 часа	4 часа	6 часов	8 часов	12 часов	24 часов
Контрольная группа	5	5	5	5	5	5
Эссенциале	5	5	5	5	5	5
Карсил	5	5	5	5	5	5
Циклоферон	90	18	110	125	35	22
Прототип (ТДАА)	5	5	5	5	5	5
Заявленный способ	35	13	25	73	70	66

Как видно из приведенных результатов, заявленный способ обеспечивал достоверное повышение противовирусной защиты клеток на всех сроках после введения препарата. Более раннее начало действия циклоферона объясняется тем, что он вводится внутрибрюшинно и быстрее проникает в кровь в сравнении с препаратом, вводимым согласно заявленному способу внутрижелудочно. Однако через 12 и 24 ч цитопротективное действие заявляемого способа превосходило по уровню защитный эффект способа, основанного на введении циклоферона, в 2-3 раза. Введение эессенциале и карсила и способ-прототип, основывающийся на введении ТДАА, не обеспечивали появление интерферона и защиту клеток от вируса.

Уровень противовирусной защиты зависит от времени, прошедшего после введения препарата. Первый пик защитного действия приходится на 2 ч после введения и обусловлен, по всей видимости, формированием в сыворотке комплекса (препарата или его метаболита самостоятельно или с сывороточными белками), обеспечивающего прямую противовирусную защиту клеток. После снижения протективного действия на сроке 4 ч отмечается подъем уровня противовирусной активности, обусловленный индукцией эндогенного интерферона и достигающий максимума через 8 ч после введения препарата, после чего следует медленный спад уровня индуцированного интерферона, который, тем не менее, остается существенно выше контрольных значений, вплоть до 24 ч после введения.

Таким образом, заявленный способ обеспечивает повышение эффективности защиты клеток печени при гепатитах различного генеза.