фармацевтическая комбинация для лечения и/или хемосенсибилизации опухолей, устойчивых к противораковым средствам

Формула изобретения

1. Фармацевтическая комбинация для одновременного, раздельного или последовательного введения, которая содержит ингибитор сайта фосфорилирования на субстратах СК2, который включает пептид Р15 (CWMSPRHLGTC) вместе с цитостатическим веществом, фармацевтически приемлемо смешанным с соответствующими переносчиками.

2. Фармацевтическая комбинация по п.1, в которой цитостатическое вещество является химическим соединением, которое принадлежит к платинам (карбоплатин и цисплатин), таксолам (пакситаксел и досетаксел) и алкалоидам Vinca (винкристин и винблатин).

3. Фармацевтическая комбинация по п.1, в которой цитостатическое вещество является 5-фторурацилом.

4. Фармацевтическая комбинация по п.1, в которой цитостатическое вещество является доксорубицином.

5. Фармацевтическая комбинация по п.1, в которой цитостатическое вещество является циклофосфамидом.

6. Фармацевтическая комбинация по п.1, в которой цитостатическое вещество является Митомицином С.

7. Фармацевтическая комбинация по п.1, в которой цитостатическое вещество является Велкадом (вортезомибом).

8. Фармацевтическая комбинация по п.1, в которой цитостатическое вещество является Ирессой.

9. Фармацевтическая комбинация по п.1, в которой цитостатическое вещество является Иматинибом.

10. Применение фармацевтических комбинаций по пп.1-9 для обхода химической устойчивости солидных и гематопоэтических опухолей к фармацевтически приемлемым цитостатическим веществам и где ингредиенты фармацевтической комбинации вводятся одновременно, раздельно или последовательно.

11. Применение ингибитора сайта фосфорилирования на субстратах СК2, который включает Р15 (CWMSPRHLGTC) вместе с фармацевтически приемлемым цитостатическим веществом для получения лекарственного средства для лечения рака.

12. Применение ингибитора сайта фосфорилирования на субстратах СК2, который включает Р15 (CWMSPRHLGTC) вместе с фармацевтически приемлемым цитостатическим веществом для получения лекарственного средства для лечения химически устойчивых опухолей к цитостатическим веществам.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Данное изобретение относится к области молекулярной и экспериментальной онкологии, в частности к описанию фармацевтической комбинации, направленной на лечение и/или хемосенсебилизацию опухолей, устойчивых к традиционным цитостатикам.

Известный уровень техники

За последние тридцать лет использование химических препаратов в качестве цитостатиков для раковой терапии представляет собой одну из альтернатив как терапия первого ряда для некоторых солидных и гематопоетических опухолей. Наиболее часто используемыми химическими препаратами для раковой терапии являются: цисплатин, таксолы, алкалоиды от Vinca, доксорубицин, 5-флуороурацил, среди прочих циклофосфамид (Jackman A.L., Kaye S., Workman P. (2004) The combination of cytotoxic and molecularly targeted therapies-can it be done? Drug Discovery Today 1:445:454). Однако результаты клинических испытаний показывают низкий терапевтический индекс для этого класса препаратов в раковой терапии, о чем свидетельствует несущественная терапевтическая полезность наряду с высокой токсичностью, наблюдаемой у пациентов (Schrader C., et al. M. (2005) Symptoms and signs of an acute myocardial ischemia caused by chemotherapy with paclitaxel (taxol) in a patient with metastatic ovarian carcinoma. Eur J Med Res 10:498-501). Например, многие авторы соглашаются с тем, что цисплатин представляет собой терапию первого ряда для рака легкого, однако обычно наблюдается невысокая эффективность с небольшим улучшением в клинических симптомах и 6-недельное увеличение выживаемости (Grillo R., Oxman A., Julian J. (1993) Chemotherapy for advanced non-smal cell lung cancer. J Clin Oncol 11:1866-1871; Bouquet P.J., Chauvin F., et al. (1993) Polychemotherapy in advanced non-small cell lung cancer: a meta-analysis. Lancet 342:19-21). Следовательно, текущие методики получения оптимальной терапевтической полезности сфокусированы на фармацевтических комбинациях, основанных на традиционных цитостатических средствах наряду с молекулярно-нацеленной терапией. Некоторые из текущих противоопухолевых препаратов относят к нацеленной на рак терапии, например Gleevec (Иматиниб), который связывается с Abl киназой, которая в свою очередь играет существенную роль в развитии хронической миелоидной лейкемии (Giles J.F., Cortes J.E., Kantarjian H.M. (2005) Targeting the Kinase Activity of the BCR-ALB Fusion Protein in Patients with Chronic Myeloid Leukemia. Current Mol Med 5:615-623), Иресса также связывает тирозиновую киназу, соединенную с рецептором эпидермального фактора роста (ЭФР) (Onn A., Herbst R.S. (2005) Molecular targeted therapy for lung cancer. Lancet 366:1507-1508), и Велкад (Вортезомиб), который наряду с прочими блокирует разрушение белка за счет нацеливания на протеасомный механизм (Spano J.P., et al. (2005) Proteasome inhibition: a new approach for the treatment of malignancies. Bull Cancer 92:Е61-66). Учитывая, что неспецифические механизмы традиционной химиотерапии сводятся к отмене клеточного митоза, использование новой нацеленной на рак терапии обеспечивает огромные перспективы получения фармацевтических комбинаций, которые вызывают синергизм противоопухолевого эффекта.

С другой стороны, феномен лекарственной устойчивости рассматривается в качестве первичной причины неудачи терапии рака, когда применяются хемотерапевтические агенты. Несмотря на то, что недостаточная концентрация препарата в окружении опухоли может влиять на лекарственную устойчивость, другие факторы, такие как происхождение клеток, играют существенную роль в лекарственной устойчивости для многих опухолей. Лекарственная устойчивость является полифакторным феноменом, зависящим от множества независимых механизмов, которые включают внутриклеточную детоксикацию, изменения клеточных ответов, устойчивость к стрессу и дефекты сигнальных путей апоптоза (Luqmani A. (2005) Mechanisms of drug resistance in cancer chemotherapy. Med Princ. Pract 14:35-48). Гликопротеин-Р и Глютатион S-трансфераза являются основными белками, которые опосредуют процесс внутриклеточной детоксикации, связываемый с феноменом лекарственной устойчивости при раке (Saeki T., Tsuruo T., Sato W., Nishikawsa K. (2005) Drug resistance in chemotherapy for breast cancer. Cancer Chemother Pharmacol 56:84-89) (Hara T., et al. (2004) Glutation S-transferase P1 has protective effects on cell viability against camptothecin. Cancer Letters 203:199-207). Сообщалось, что другие белки, такие как бета-тубулины, вовлечены в феномен лекарственной устойчивости, и их уровни напрямую коррелируют с устойчивостью опухоли к Пакситакселу (Orr G.A., et al (2003) Mechanisms of Taxol resistance related to microtubules. Oncogene 22:7280-7295). В другом случае сообщалось, что устойчивость к цисплатину подвержена влиянию оверэкспрессии различных белков, таких как Т-пластин (Hisano T., et al (1996) Increased expression of T-plastin gene in cisplatin-resistant human cancer cells: identification by mRNA differential display. FEBS Letters 397:101-107), белок теплового шока (HSP70) и (HSP90) (Jaattela M. (1999) Escaping cell death: survival proteins in cancer. Exp Cell Res 248:30-43) и транскрипционный фактор YB1 (Fujita T., et al (2005) Increased nuclear localization of transcription factor Y-box binding protein accompanied by up-regulation of P-glycoprotein in breast cancer pretreated with paclitaxel. Clin Cancer Res 11:8837-8844). Кроме того, сообщалось, что усиление гликолизного и пируватного путей играет существенную роль в феномене химической устойчивости, наблюдаемом в клетках опухоли (Boros L.G., et al. (2004) Use of metabolic pathway flux information in targeted cancer drug design. Drug Disc. Today 1:435-443).

Доклады различных групп показали существование группы белков, которые либо ингибируют апоптоз, либо увеличивают выживаемость опухолевых клеток, способствуя таким образом феномену химической устойчивости опухолей. Одним из примеров является белок нуклеофосмин, который играет ведущую роль в продвижении клеточного цикла, ингибировании апоптоза и рассматривался в качестве прогностического маркера при раке (Ye K. (2005) Nucleophosmin/В23, multifunctional protein that can regulate apoptosis. Cancer Biol Ther 4:918-923). Аналогичным образом фермент СК2 играет важную роль в выживаемости клеток и устойчивости опухолевых клеток к апоптозу (Tawfic S., Yu S., Wang H., Faust R., Davis A., Ahmed K. (2001) Protein kinase CK2 signal in neoplasia. Histol. Histopathol. 16:573-582). Предыдущие открытия показали от 3- до 7-кратное повышение активности СК2 в эпителиальных солидных опухолях относительно нормальных тканей (Tawfic S., Yu S., et al (2001) Protein kinase CK2 signal in neoplasia. Histol. Histopathol. 16:573-582; Faust R.A., Gapany M., et al (1996) Elevated protein kinase CK2 activity in chromatin of head and neck tumors: association with malignant transformation. Cancer Letters 101:31-35). Кроме того, активность СК2 является важным клеточным подтверждением наличия злокачественной трансформации и представляет собой маркер опухолевого развития (Seldin D.C., Leder P. (1995) Casein Kinase II transgene-induced murine lymphoma: relation to theileriosis in cattle. Science 267:894-897). Факт того, что фосфорилирование СК2 представляет собой сильный сигнал для защиты опухолевых клеток от апоптоза, ведет к тому, что фермент считают антиапоптотическим медиатором клеточной физиологии (Ahmed K., Gerber D.A., Cochet C. (2002) Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase СК2. Trend Cell Biol, 12:226-229; Torres J., Rodriguez J., et al (2003) Phosphorylation-regulated cleavage of the tumor suppressor PTEN by caspase-3: implications for the control of protein stability and PTEN-protein interactions. J Biol Chem, 278:30652-60).

В общей сложности фосфорилирование СК2 является биохимическим явлением, которое представляет собой потенциальную мишень для терапии рака, и специфические ингибиторы этого явления могут привести к появлению лекарственных кандидатов с перспективой воздействия на рак.

Разные группы развивали разные стратегии для того, чтобы ингибировать фосфорилирование СК2, используя два независимых подхода: а) Прямое ингибирование альфа-каталитической субъединицы СК2, б) Прямое связывание кислотного домена на субстратах СК2 (патент WO 03/054002 и Perea S.E., et al. (2004) Antitumor effect of a novel proapoptotic peptide impairing the phosphorylation by the protein kinase СК2. Cancer Res. 64:7127-7129). Используя оба подхода, авторы продемонстрировали контрольную проверку того, что ингибирование СК2 ведет к апоптозу в клетках опухоли. Эти открытия подкрепляют экспериментальное утверждение СК2 в качестве подходящей мишени для развития противоопухолевых препаратов.

Сравнительные протеомные исследования наряду с развитием молекулярной биологии от части допустили понимание молекулярных механизмов, вовлеченных как в злокачественную клеточную трансформацию, так и в химическую устойчивость опухолей. Следовательно, режиму терапии рака следует фокусировать свое внимание на получении эффективных лекарственных комбинаций, которые сильно уменьшают токсичность и также уменьшают вероятность возникновения химической устойчивости.

Таким образом, одной из основных задач в терапии рака сегодня является повышение терапевтического индекса текущих цитостатических веществ при помощи уменьшения эффективной дозы и естественной токсичности, проявляемой этим видом лекарственных средств. Другой текущей стратегией является обойти химическую устойчивость опухоли по отношению к традиционным цитостатическим веществам.

Подробное описание изобретения

Это изобретение решает проблему, упомянутую выше так, как оно обеспечивает фармацевтическую комбинацию, которая включает два ингредиента: ингибитор фосфорилирования СК2 (пептид Р15) и фармацевтически приемлемое цитостатическое вещество.

В этом изобретении «фармацевтически приемлемое цитостатическое вещество» относится ко всем цитостатическим химическим соединениям, используемым в химиотерапии рака, как для солидных опухолей, так и для опухолей гематопоэтического происхождения. Предпочтительными цитостатиками являются цисплатин и карбоплатин, паклитаксел и досетаксел, винкристин и винбластин, 5-флуоурацил, доксорубицин, циклофосфамид, этопозид, митомицин С, иматиниб, иресса и велкад (вортезомиб), смешанные с соответствующими переносчиками.

В этом изобретении принцип «ингибирования фосфорилирования СК2» также включает любое химическое или пептидное соединение, которое блокирует либо субстрат, либо сам фермент. В зависимости от ситуации активные ингредиенты фармацевтической комбинации могут вводиться одновременно, отдельно или последовательно. Введение фармацевтической комбинации может осуществляться системным, местным или оральным путями. Это изобретение также относится к лечению и/или обходу химической устойчивости в резистентных опухолях, имеющей место у людей, использовавших фармацевтические комбинации, упомянутые выше.

Аналогичным образом, это изобретение относится к применению ингредиентов фармацевтической комбинации для получения лекарственного средства для лечения хеморезистентных опухолей и для увеличения противоопухолевого эффекта цитостатических веществ, приводимых в этом изобретении.

Пример 1 (Таблица 1) показывает, что фармацевтическая комбинация, описанная в этом изобретении, оказывает синергический противоопухолевый эффект in vitro. Таким образом, одновременное сочетание недостаточных доз пептида Р15 наряду с цисплатином, паклитакселом, доксорубицином, винкристином, этопозидом, митомицином С, 5-флуоурацилом, иматинибом или иресса обеспечивает 10- или 100-кратное уменьшение эффективной дозы для каждого цитостатического вещества, упомянутого в этом изобретении. Эффективной дозой является та, которая обеспечивает 50% противоопухолевого эффекта, которую также называют Ингибирующей Концентрацией 50% (IC50) в анализе пролиферации in vitro. В данном изобретении «субоптимальные дозы» относятся к дозам ниже чем IC50.

Пример 2 иллюстрирует потенцирование противоопухолевого эффекта in vivo при применении этой фармацевтической комбинации, содержащей пептид Р15 наряду с цисплатином (Фигура 1А), циклофосфамидом (Фигура 1В) и митомицином С (Фигура 1С). Фармацевтическая комбинация приводит к полной регрессии опухоли в соответственной модели на животных, такой как состоящая из опухоли человека, ксенотрансплантированной голым мышам. Однако такое применение ингредиентов фармацевтической комбинации в виде монотерапии вызывало только незначительную задержку опухолевого роста в сравнении с эффектом, наблюдаемым в плацебо-группе.

Последовательное введение ингредиентов этой фармацевтической комбинации показывает, что обработка Р15 обходит химическую устойчивость опухоли как in vitro, так и in vivo. В этом изобретении подразумевается, что «обход химической устойчивости или хемосенсебилизации опухоли» относится к событию уменьшения дозы препарата, чтобы получать 50% противоопухолевого эффекта после предварительной обработки пептидом Р15. Пример 3 иллюстрирует эффект предварительной обработки пептидом Р15 на хемосенсебилизацию клеток опухоли, и она вызывает от 10- до 100-кратного уменьшения эффективной дозы препарата. Аналогичным образом данные, приведенные в таблице 3, показывают, что последовательное введение фармацевтической комбинации обходит химическую устойчивость, свойственную клеткам опухоли in vitro . В этом изобретении химическая устойчивость in vitro рассматривается, когда уровень ICS50 достигает более чем 1000 мкм концентрации.

Подобно результатам in vitro предварительная обработка пептидом Р15 in vivo обходит химическую устойчивость, свойственную опухоли (пример 4) (Фигуры 2А, 2Б, 2В).

Ингредиент пептид Р15 (аминокислотная последовательность: CWMSPRHLGTC) был ранее известен как ингибитор СК2 (Perea S.E., et al. (2004) Antitumor effect of a novel proapoptotic peptide impairing the phosphorylation by the protein kinase СК2. Cancer Res. 64:7127-7129). Однако этот пептид неожиданно регулировал группу белков на клетках опухоли (Таблица 4), которые усиливают и интерпретируют синергический противоопухолевый эффект ингредиентов из фармацевтической комбинации, а также хемосенсебилизацию, полученную при помощи предварительной обработки пептидом Р15. Например, пептиды, регулируемые Р15, играют существенную роль в контроле пролиферации опухолевых клеток и апоптозе, и эти механизмы индуцируются неодинаково посредством остальных ингредиентов из этой фармацевтической комбинации, в частности, цитостатики являются предпочтительными в этом изобретении.

Аналогичным образом, другими белками, которые регулируются при помощи ингредиента Р15, являются белки, вовлеченные в молекулярные механизмы химической устойчивости опухоли к цитостатику, предпочтительные в этом изобретении. Эти неожиданные результаты составляют молекулярную основу хемосенсебилизации опухоли, полученной при помощи этой фармацевтической комбинации, когда ингредиенты вводятся последовательно.

Отличительной чертой в этом изобретении является тот факт, что эффективные концентрации цитостатических веществ в фармацевтической комбинации от 10- до 100-кратно уменьшаются по сравнению с эффективной дозой, когда цитостатические вещества применяются отдельно. Это обозначает, что происходит синергическое взаимодействие между ингибитором СК2 и цитостатическими веществами, предпочтительными в этом изобретении. С практической точки зрения это синергическое взаимодействие обозначает, что токсичность лекарственного препарата, основанного на этой фармацевтической комбинации, гораздо ниже, чем наблюдалось для отдельных цитостатических веществ.

Аналогичным образом, хемосенсебилизация опухоли, выявленная после последовательного введения ингредиентов из этой фармацевтической комбинации, представляет собой большое преимущество, так как она позволяет лечить химическую устойчивость, которая часто наблюдается в солидных опухолях и опухолях гематопоэтического происхождения.

Описание фигур

Фигура 1: Усиление противоопухолевого эффекта при помощи фармацевтической комбинации в модели рака на животных: (А) представляет синергизм между цисплатином+Р15, (Б) представляет синергизм между циклофосфамидом+Р15, (В) представляет синергизм in vivo митомицина С+Р15.

Фигура 2: Эффект хемосенсебилизации опухоли при помощи пептида Р15 in vivo: (А) представляет обход химической устойчивости к цисплатину. (Б) представляет обход химической устойчивости к паклитакселу и (С) представляет обход химической устойчивости к доксорубицину.

Подробное описание примеров

Основные процедуры

Культуры клеток: Линия клеток Н-125 была получена из немелкоклеточной легочной карциномы человека (NSCLC), а клеточная линия SW948 была получена из карциномы толстой кишки человека. Обе клеточные линии вели на культуральной среде RPMI 1640 (Gibco) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и гентамицина (50 мкг/мл). Инкубация клеточных культур проводилась при 37°С в 5% СО₂.

Анализ выживаемости клеток: Для этой цели к клеткам в каждой плашке добавляли по 20 мкл Тетразолия (MTS) (Promega). После 2 часов при 37°С измеряли коэффициент поглощения при 492 нм. В результате оценивали уровни ICS50 исходя из дозозависимых кривых, используя программное обеспечение «CurveExpert».

Модель рака на животных: Модель на животных, используемая в этом изобретении, основывалась на имплантации опухолей человека голым мышам (Nu/Nu, BalBC). Схематически, 5×10⁶ клеток Н-125 суспендировали в растворе фосфатного буфера (PBS) и прививали подкожно. После появления опухоли (приблизительно 30 мм³) начинали лечение с использованием фармацевтической комбинации, описанной в этом изобретении. Чтобы оценить противоопухолевый эффект фармацевтической комбинации, был измерен объем опухолевой массы и был вычислен относительный объем с использованием формулы: V=ширина² x длина/2.

Анализ белкового профиля клеточных экстрактов: Клетки Н-125 были обработаны или не обработаны пептидом Р15, ингредиентом фармацевтической комбинации, описанной в этом изобретении, в течение 40 минут. Затем монослои клеток промывали PBS и клетки соскребали с поверхности. После двух последующих промывок холодным PBS клеточные бляшки ресуспендировали в 10 мМ tris-HCl с рН 7.5, 0,25М сахарозе, 1 мМ EGTA+коктейль ингибиторов протеаз и была получена ядерная фракция белка, как описано выше (González L.J., et al (2003) Identification of nuclear proteins of small cell lung cancer cell line Н82: An improved protocol for the analysis of silver sained proteins. Electrophoresis 24:237-252). Чтобы проанализировать белки, регулируемые Р15, экстракты соответствующих ядерных белков были аналогичным образом разделены при помощи 2D-двумерных гелей (рН 4-7) и/или жидкостной хроматографии (nano HPLC), соединенной с масс-спектрометрией.

Это изобретение объяснено посредством следующих примеров.

Пример 1: Синергический эффект сочетания пептид Р15+традиционные цитостатические вещества

Был оценен противоопухолевый синергический эффект между ингредиентом пептид Р15 в сочетании с различными цитостатическими веществами в различных экспериментальных условиях: клетки Н-125 были посеяны в 96-луночные плайты, и в каждый плайт было добавлено 10 и 50 мкМ пептида Р15. Одновременно был добавлен каждый из цитостатических веществ, предпочтительных в данном изобретении, в дозах, изменяющихся в пределах от 1 до 2000 нМ, и инкубация продолжалась в течение 72 часов в одинаковых условиях. В результате, как описано выше в изобретении, были определены выживаемость клеток и уровни IC50. Результаты, представленные в Таблице 1, показывают, что уровни IC50 для каждого цитостатического вещества от 10- до 100-кратно уменьшаются при одновременном сочетании с 10 либо 50 мкМ ингредиента Р15. Эти результаты, безусловно, демонстрируют потенцирование противоопухолевого эффекта фармацевтической комбинации, содержащего в качестве ингредиентов пептид Р15 и цитостатические вещества, предпочтительные в данном изобретении.

Таблица 1 Противоопухолевое синергическое взаимодействие посредством одновременного введения ингредиентов в этой фармацевтической комбинации
Вариант	Цитостатическое вещество отдельно	Цитостатическое вещество+Р15 (10 мкМ)	Цитостатическое вещество+Р15 (50 мкМ)
Цисплатин	720 нМ	530 нМ	40 нМ
Паклитаксел	17 нМ	8 нМ	3 нМ
5-Флуоурацил	1200 нМ	420 нМ	60 нМ
Винкристин	856 нМ	100 нМ	8 нМ
Доксорубицин	423 нМ	200 нМ	76 нМ
Циклофосфамид	2400 нМ	1004 нМ	85 нМ
Митомицин С	994 нМ	93 нМ	9 нМ
Иматиниб	600 нМ	200 нМ	58 нМ
Велкад	2000 нМ	1200 нМ	700 нМ
Иресса	689 нМ	174 нМ	47 нМ

Пример 2: Потенциирования противоопухолевого эффекта посредством фармацевтической комбинации на модели рака у животных

Для этой цели 5×10⁶ опухолевых клеток Н-125 были имплантированы, как описано выше в данном изобретении, 6-8-недельным голым мышам BalBc. После появления опухоли были введены ингредиенты фармацевтической комбинации, как следует ниже. Пептид в солевом растворе был введен внутрибрюшинно в количестве 0,5 мг/кг/день в течение 5 дней. Сопутствующим образом были сделаны внутрибрюшинные инъекции цисплатина (Фигура 1А), или циклофосфамида (Фигура 1Б), или Митомицина (Фигура 1В) в количестве 1 мг/кг/день с той же частотой. Цитостатические вещества также растворяют в солевом растворе. Был зарегистрирован объем опухоли, как описано выше в этом изобретении. Результаты, представленные на Фигурах 1А, 1Б и 1В, показывают, что фармацевтическая комбинация потенцирует противоопухолевый эффект при одновременном введении ингредиентов и, как было показано, посредством полной регрессии опухоли. С другой стороны, когда ингредиенты вводили в качестве монотерапии, наблюдался лишь несущественный противоопухолевый эффект относительно плацебо-группы. Таким образом дополнительно демонстрируется синергическое взаимодействие между ингредиентами этой фармацевтической комбинации в текущей преклинической модели рака.

Пример 3: Эффект пептида Р15 в обходе химической устойчивости in vitro

В этом анализе оценивался эффект фармацевтической комбинации в обходе феномена химической устойчивости, когда ингредиенты вводятся последовательно. Для этой цели клетки Н-125 были посеяны в 96-луночные плайты в количестве 2000 клеток/лунку и по прошествии 24 часов было добавлено 20 мкМ пептида Р15. После 16 часов инкубации с ингредиентом пептид Р15 монослои клеток были дважды промыты солевым раствором. В результате были добавлены цитостатические вещества, предпочтительные в этом изобретении, в концентрации, изменяющейся в пределах от 1 до 2000 нМ, и инкубация продолжалась на протяжении 72 часов. В конце были определены выживаемость клеток и уровни IC50 для каждого цитостатического вещества, как описано выше в этом изобретении. Результаты, представленные в Таблице 2, показывают, что предварительная обработка опухолевых клеток ингредиентом пептид Р15 увеличивает чувствительность этих клеток к каждому из цитостатических веществ, предпочтительных в этом изобретении. Кроме того, мы оценили эффект предварительной обработки Р15 на клетках SW948, которые в сущности устойчивы к эффекту цитостатических веществ. Результаты показали, что ингредиент пептид Р15 также превращает в сущности лекарственно-резистентные опухолевые клетки в чувствительные к цитостатическим веществам, предпочтительным в этом изобретении, клетки (Таблица 3).

Наши данные показывают, что последовательное введение ингредиента пептид Р15 относительно цитостатических веществ, предпочтительных в этом изобретении, приводит к сенсебилизации опухолевых клеток к противоопухолевому эффекту таких препаратов.

Таблица 2 Хемосенсебилизация фармацевтической комбинации in vitro посредством последовательного введения ингредиентов
Вариант	Цитостатическое вещество отдельно	Цитостатическое вещество+предварительная обработка Р15
Цисплатин	720 нМ	20 нМ
Паклитаксел	17 нМ	0,9 нМ
5-Флуоурацил	1200 нМ	105 нМ
Винкристин	856 нМ	83 нМ
Доксорубицин	423 нМ	72 нМ
Циклофосфамид	2400 нМ	100 нМ
Митомицин С	994 нМ	20 нМ
Иматиниб	600 нМ	10 нМ
Велкад	2000 нМ	370 нМ
Иресса	689 нМ	63 нМ

Таблица 3 Хемосенсебилизация фармацевтической комбинации in vitro посредством последовательного введения ингредиентов на по существу лекарственно-резистентные опухолевые клетки
Вариант	Цитостатическое вещество отдельно	Цитостатическое вещество+предварительная обработка Р15
Цисплатин	1000 мкМ	120 мкМ
Паклитаксел	1000 мкМ	97 мкМ
Доксорубицин	1000 мкМ	320 мкМ

Эффект ингредиента пептид Р15 на хемосенсебилизацию дополнительно подтвержден при помощи регулируемого лекарствами профиля белков, наблюдаемого в опухолевых клетках, использованных в этом изобретении. Для этой цели были проанализированы, как ранее описано в этом изобретении, ядерные белковые экстракты, полученные из клеток Н-125, обработанных или не обработанных ингредиентом пептид Р15. Таблица 4 представляет группу белков, которые регулируются при помощи ингредиента пептид Р15 и благодаря их известной функции; это усиливает молекулярную основу хемосенсебилизации опухоли, вызванную этим пептидом в фармацевтической комбинации в этом изобретении.

Таблица 4 Регулируемый Р15 белковый профиль
Белки, отрицательно регулируемые ингредиентом пептид Р15	Уровень ингибирования
Нуклеофосмин	48
Т-Пластин	3,34
Белки теплового шока (HSP-27, -70, -90)	2,5
Транскрипционный фактор Y-box 1	3,33
Предшественник эритропоэтина	120
S-глутатион трансфераза	4,87
Протеосомный активирующий комплекс	3,35
Убиквитин-активированный Е1 фермент	2,49
Глюкозо-6-фосфат изомераза	8,53
Глицеральдегид-6-фосфат дезгидрогеназа	6,62
Пируват киназа	8,34
Трансляционно-контролируемый опухолевый белок	4,32
Белки, положительно регулируемые ингредиентом пептид Р15	Уровень активации
Прохибитин	2,28
Альфа-1 тубулин	3,23
Бета-2 тубулин	2,56
Бета-3 тубулин	3,15

Пример 4: In vitro хемосенсебилизация, вызванная ингредиентом пептида Р15.

Для этой цели 5×10⁶ клеток SW948 были имплантированы голым мышам, как описано ранее в этом изобретении. После появления опухоли фармацевтическая комбинация была последовательно введена, как следует ниже: во-первых, был внутрибрюшинно введен ингредиент пептид Р15 в количестве 0,5 мг/кг/день в течение 5 дней. Последовательно были введены цисплатин (Фигура 2А), Паклитаксел (Фигура 2Б) и доксорубицин (Фигура 2В) в количестве 5 мг/кг/день в течение последующих 5 дней. Результаты здесь показывают, что предварительная обработка Р15 in vivo способна вернуть к прежнему хеморезистентному фенотипу опухоли, которые начинают отвечать на цитостатические вещества, предпочтительные в этом изобретении. Эти сведения также обеспечивают доказательства того, что фармацевтическая комбинация по изобретению способна обходить обычно наблюдаемую в сущности опухолевую устойчивость, когда ингредиенты вводятся последовательно.