способ приготовления плотной питательной среды

Формула изобретения

Способ приготовления плотной питательной среды для выращивания микроорганизмов, предусматривающий внесение в жидкий питательный субстрат уплотнителя, добавление ингредиентов согласно стандартной прописи среды, последующую стерилизацию в автоклаве и охлаждение расплавленной среды, отличающийся тем, что в охлажденную до температуры (60±5)°С расплавленную среду дополнительно вносят 0,2-0,3 мас.% предварительно приготовленной эмульсии смеси перфторорганических соединений в соотношении 3:1 перфтор-1,3-диметилциклогексана и перфтордекалина со средними размерами эмульгированных частиц 90-270 нм.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к способам приготовления плотных питательных сред для культивирования микроорганизмов, и может быть использовано в практике микробиологических лабораторий.

Известен способ приготовления плотных питательных сред для выращивания микроорганизмов, заключающийся в добавлении к жидкой питательной основе специальных добавок по предназначению (микро- и макроэлементов в составе разных химических соединений, индикаторов, стимуляторов и ингибиторов роста, красителей и др.) и уплотнителей (отвердителей), способных к гелеобразованию и придающих плотность этим средам (Методы общей бактериологии / Под ред. Ф.Герхардта // Пер. с англ., под ред. Е.Кондратьевой и Л.Калакуцкого в 3 т. - М.: Мир, 1983. - Т.1 - 536 с).

К недостаткам данного способа следует отнести то, что застывшие агаровые гели обеспечивают относительно слабый уровень диффузии питательных веществ, индикаторных и биологически активных добавок в плотных средах в направлении растущей на поверхности плотной среды микробной культуры, что, в конечном итоге, приводит к замедлению роста микробных культур и снижению урожая микробных клеток.

Наиболее близким к заявляемому является способ приготовления плотной среды, где в качестве уплотнителя используется агар в количестве 2,5% (в зависимости от вида среды и качества самого агара) (Семенов С. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. - М.: Агропромиздат, 1990. - С.86-94.). Питательный субстрат растворяют в воде, добавляют необходимое количество агар-агара и нагревают до полного растворения в автоклаве текучим паром в течение 40-90 мин. По окончании кипячения объем среды доводят до первоначального значения горячей дистиллированной водой и кипятят еще 2-3 мин. Расплавленную среду помещают в теплое место, чтобы она отстоялась, и фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр. Осадок не используют. Проверяют и если нужно корректируют рН, затем разливают в соответствующую посуду, не замачивая края горлышек, куда вставляют ватные пробки. Стерилизуют среду 15-30 мин автоклавированием при температуре в автоклаве 120°С. После стерилизации плотную питательную среду асептически разливают в чашки Петри, пробирки и другую микробиологическую посуду, в которой агаровый гель застывает при охлаждении.

Общим с заявляемым способом является использование при приготовлении плотных питательных сред уплотнителей, источников углерода, азота, фосфора, минеральных солей, микроэлементов, других питательных и дополнительных ингредиентов и технологии, обычно применяемой при приготовлении плотных питательных сред.

К недостаткам данного способа следует отнести то, что плотные питательные среды, получаемые принятым способом, из-за относительно низкого уровня диффузии в застывшем геле питательных веществ (химических микро- и макроэлементов, воды, углеводов и т.д.) индикаторных и биологически активных добавок в направлении растущей на поверхности плотной среды микробной культуры, не обеспечивают должный интенсивный рост и прорастание всей засеваемой популяции микроорганизмов.

Задачей предполагаемого изобретения является разработка способа приготовления плотной питательной среды, позволяющего увеличить интенсивность роста и получаемый урожай культур микроорганизмов, засеваемых на эти среды.

Поставленная задача решается путем внесения предварительно приготовленной эмульсии смеси перфторорганических соединений (ПФОС) - перфтор-1,3-диметилциклогексана (карбогала) и перфтордекалина в соотношении 3:1 со средними размерами эмульгированных частиц 90-270 нм до конечной общей концентрации 0,2-0,3 мас.% в расплавленную после стерилизации в автоклаве плотную питательную среду, имеющую жидкую консистенцию при охлаждении до температуры (60±5)°С.

Карбогал (КГ, химическая формула - C₈F₁₆), ТУ 95-1693 - бесцветная прозрачная негорючая жидкость без запаха, с вязкостью 1,04 мм² × сСт^-1 при 25°С, плотностью 1,85 г/см ³ и температурой кипения 102°С. КГ не растворим в воде и в органических растворителях, смешивается без ограничений с фторуглеродными жидкостями, обладает исключительно высокими физической и химической устойчивостью, взаимодействует с кислотами и щелочами при температуре выше 450°С.

Перфтордекалин (ПФД, химическая формула - C₁₀F₁₈), ТУ 95-1233 - бесцветная прозрачная негорючая жидкость без запаха, с вязкостью 2,74 мм² × сСт при 25°С, плотностью 1,945 г/см³ и температурой кипения 155°С. ПФД не растворим в воде и в органических растворителях, смешивается с фторуглеродными жидкостями без ограничений, обладает исключительно высокими физической (термически устойчив до 400°С) и химической устойчивостью, взаимодействует с кислотами и щелочами при температуре выше 400°С, является основным компонентом голубой крови (Перфторорганические соединения в биологии и медицине/ Под ред. Г.Р.Иваницкого и В.В.Мороза. - Пущино, 1999. - 286 с). КГ и ПФД не являются питательными веществами и не утилизируются микроорганизмами.

Наличие в агаровом геле 0,2-0,3 мас.% эмульгированных частиц смеси КГ и ПФД в указанном соотношении в застывшей при ее охлаждении плотной питательной среде эффективно поддерживает диффузию питательных веществ к растущей культуре микроорганизмов и высокий уровень обмена между средой и микробными клетками. При этом в среде формируется двухфазная система, где, на границе раздела фаз, частицы ПФОС, имеющие суммарную площадь поверхности около 12-18 м², обеспечивают существенное повышение уровней диффузии и оптимальные условия для направленного перемещения потоков питательных веществ, клеточных метаболитов, индикаторных и биологически активных добавок в плотных средах в направлении растущей на поверхности плотной среды микробной культуры, что в конечном итоге приводит к улучшению условий прорастания всей засеваемой популяции микроорганизмов, увеличению интенсивности роста и увеличению урожая растущей микробной культуры.

КГ, ПФД и 0,01 мас.% агар в дистиллированной воде стерилизуются отдельно текучим паром в течение 50 мин, затем КГ и ПФД смешиваются асептически в соотношении 3:1 при температуре 60-70°С и при данной температуре к данной смеси добавляется равное количество по массе стерилизованного жидкого 0,01 мас.% водного агара. Полученная неоднородная смесь подвергается в течение 20 мин перемешиванию на высокоскоростной мешалке без доступа воздуха и газов при скорости вращения ротора не менее 6 тысяч об/мин с погружением вращающейся лопасти или турбины мешалки в смесь ПФОС при температуре 55-65°С. Полученная данным методом эмульсия содержит взвесь ПФОС со средним размером частиц в диапазоне от 90-270 нм, не подвергающихся коалесценции в течение не менее 20 сут при температуре 10-22°С. Полученную эмульсию с содержанием 50 мас.% по массе ПФОС используют в дальнейшем в качестве добавки в расплавленные плотные питательные агаровые среды после их охлаждения до (60±5)°С. Для получения конечной концентрации смеси ПФД и КГ 0,2-0,3 мас.%, в среду добавляют 0,4-0,6 мас.% приготовленной эмульсии ПФОС.

Сущность предложенного способа заключается в следующем. Питательный субстрат растворяют в воде, добавляют ингредиенты согласно стандартной прописи среды и необходимое количество агар-агара, нагревают до полного растворения в автоклаве текучим паром в течение 20-90 мин. По окончании кипячения объем среды доводят до первоначального значения горячей дистиллированной водой и кипятят еще 2-3 мин. Расплавленную среду помещают в теплое место, чтобы она отстоялась, и фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр. Осадок не используют. Проверяют и если нужно корректируют рН, затем разливают в соответствующую посуду, не замачивая края горлышек, куда вставляют ватные пробки. Стерилизуют среду 15-40 мин автоклавированием при давлении насыщенного пара 0,2-0,3 МПа, обеспечивающего температуру в автоклаве 121-134°С. Затем в плотную питательную среду, имеющую жидкую консистенцию после стерилизации в автоклаве и охлаждении до температуры (60±5)°С, вносят 0,2-0,3 мас.% предварительно приготовленной эмульсии смеси перфторорганических соединений в соотношении 3:1 перфтор-1,3-диметилциклогексана и перфтор декалина со средними размерами эмульгированных частиц 90-270 нм. После этого плотную питательную среду асептически разливают в чашки Петри, пробирки и другую микробиологическую посуду, в которой среда застывает при охлаждении. Полученные плотные питательные среды выдерживают 1 сут и засевают известным способом (шпателем, иглой, пипеткой и т.п.), после чего инкубируют требуемое время в условиях, необходимых для культивирования конкретных микроорганизмов.

Изобретение позволяет улучшить условия прорастания популяции микроорганизмов, повысить интенсивность роста микробной культуры и увеличить урожай культур, засеваемых на разные плотные питательные среды, приготовленные разработанным способом.

Возможность осуществления изобретения показана следующими примерами. В качестве тест-микробов использовали лабораторные штаммы микроорганизмов различных таксономических групп Escherichia coli М 17, Saccharomyces cerevisiae 5, Pseudomonas putida 15, Azotobacter chroococcum 17, Fusarium nivale 1727 и Streptomyces purpurogeniscleroticus ВБМ 158 (таблицы 1-8).

Для выращивания культур микроорганизмов использовали плотные питательные среды, имеющие стандартные прописи ингредиентов, приготовленные обычным и предлагаемым способами.

Количество живых клеток в 1 см³ исследуемой суспензии (М) определяли чашечным методом Коха - путем высева соответствующих десятикратных разведений исследуемой суспензии микроорганизмов на плотные питательные среды и расчетом по формуле

,

где а - среднее число колоний при высеве из данного разведения;

10 - коэффициент разведения;

n - порядковый номер разведения, из которого сделан высев;

V - объем суспензии, взятый для посева (см³).

В качестве посевных в экспериментах использовали культуры микроорганизмов, выращенные на плотной питательной среде в течение 24-72 ч, разведенные физиологическим раствором до заданной концентрации по оптическому стандарту мутности (ОСМ) ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

Под урожаем понимали конечное количество микроорганизмов, выросших на средах в заданных условиях при высеве 10⁶ микробных клеток по ОСМ на чашку Петри.

В качестве контроля использовали высевы тех же разведений приготовленных суспензий микроорганизмов на плотные питательные среды того же состава, но приготовленные без использования ПФОС.

По результатам, представленным в таблицах 1-8, видно, что разные по составу плотные питательные среды, специфичные для микроорганизмов разных таксономических групп, при использовании предлагаемого способа их приготовления с внесением в застывающий после стерилизации агаровый гель 0,2-0,3 мас.% эмульгированных частиц смеси КГ и ПФД соотношении 3:1 обеспечивает улучшение условий прорастания засеваемой популяции микроорганизмов на 10,5-44,4% и увеличение урожая растущей микробной культуры на 16,3-41,6% без внесения в состав сред дополнительных количеств питательных веществ.

Таблица 1
Количество клонов бактерий родов Escherichia и Pseudomonas, вырастающих на мясопептонном агаре и среде Эйкмана, приготовленных принятым и предлагаемым способами, при высеве 102 микробных клеток по ОСМ на чашку Петри
Среда	Способ приготовления среды	Количество клонов бактерий штамма выросших на плотной среде, абсолютное число (в процентах к контролю)
		Е. coli M 17	P. putida 15
Мясопептонный агар	принятый (контроль)	84±6 (100,0)	57±5 (100,0)
	предлагаемый	97±6 (115,4)	63±4 (110,5)
Эйкмана	принятый (контроль)	86±8 (100,0)	61±5 (100,0)
	предлагаемый	106±7 (123,3)	69±6 (113,1)

Таблица 2
Урожай культур бактерий родов Escherichia и Pseudomonas за 24 ч роста на мясопептонном агаре и среде Эйкмана, приготовленных принятым и предлагаемым способами, при высеве 106 микробных клеток по ОСМ на чашку Петри
Среда	Способ приготовления среды	Урожай культуры бактерий штамма , полученный на плотной среде, абсолютное число ×10 9 (в процентах к контролю)
Е. coli M 17	P. putida 15
Мясопеп- тонный агар	принятый (контроль)	27±3 (100,0)	21±3 (100,0)
Эйкмана	предлагаемый	34±3 (125,9)	26±4 (123,8)
принятый (контроль)	31±4(100,0)	40±4(100,0)
предлагаемый	38±3 (122,6)	49±5 (122,5)

Таблица 3
Количество клонов микромицетов родов Fusarium и Saccharomyces на средах Сабуро и Чапека, приготовленных принятым и предлагаемым способами, при высеве 102 микробных клеток по ОСМ на чашку Петри
Среда	Способ приготовления среды	Количество клонов микромицетов штамма выросших на плотной среде, абсолютное число (в процентах к контролю)
S. cerevisiae 5	F. nivale - 1727
Сабуро	принятый (контроль)	27±3 (100,0)	57±5 (100,0)
предлагаемый	39±3 (144,4)	63±4 (110,5)
Чапека	принятый (контроль)	21±4(100,0)	61±5 (100,0)
предлагаемый	29±3 (138,1)	69±6 (113,1)

Таблица 4
Урожай культур микромицетов родов Fusarium и Saccharomyces за 72 ч роста на средах Сабуро и Чапека, приготовленных принятым и предлагаемым способами, при высеве 106 микробных клеток по ОСМ на чашку Петри
Среда	Способ приготовления среды	Урожай культуры микромицетов штамма полученный на плотной среде, абсолютное число ×107 (в процентах к контролю)
		S. cerevisiae 5	F. nivale - 1727
Сабуро	принятый (контроль)	42±4 (100,0)	21±3 (100,0)
предлагаемый	58±5 (138,1)	28±3 (133,3)
Чапека	принятый (контроль)	36±4 (100,0)	18±4 (100,0)
предлагаемый	51±5 (141,6)	25±3 (138,8)

Таблица 5
Количество клонов актиномицета Streptomyces purpurogeniscleroticus ВБМ 158 на овсяном агаре и среде Ваксмана, приготовленных принятым и предлагаемым способами, при высеве 102 микробных клеток по ОСМ на чашку Петри
Среда	Способ приготовления среды	Количество клонов актиномицета, выросших на плотной среде, абсолютное число (в процентах к контролю)
Овсяный агар	принятый (контроль)	41±3 (100,0)
предлагаемый	55±4 (134,1)
Ваксмана	принятый (контроль)	34±3 (100,0)
предлагаемый	48±4 (141,2)

Таблица 6
Урожай культуры актиномицета Streptomyces purpurogeniscleroticus ВБМ 158 за 72 ч роста на овсяном и картофельный агарах, приготовленных принятым и предлагаемым способами, при высеве 106 микробных клеток по ОСМ на чашку Петри
Среда	Способ приготовления среды	Урожай культуры актиномицета, полученный на плотной среде, абсолютное число ×10 7 (в процентах к контролю)
Овсяный	принятый (контроль)	26±3 (100,0)
агар	предлагаемый	33±4 (126,9)
Картофельный агар	принятый (контроль)	19±3 (100,0)
предлагаемый	25±3 (131,6)

Таблица 7
Количество клонов A. chroococcum 17 на агаровых средах Эшби и Федорова, приготовленных принятым и предлагаемым способами, при высеве 102 микробных клеток по ОСМ на чашку Петри
Среда	Способ приготовления среды	Количество клонов азотобактера, выросших на плотной среде, абсолютное число (в процентах к контролю)
Эшби	принятый (контроль)	61±3 (100,0)
	предлагаемый	71±4(116,4)
Федорова	принятый (контроль)	58±3 (100,0)
	предлагаемый	70±4 (120,7)

Таблица 8
Урожай культуры A. chroococcum 17 за 48 ч роста на агаровых средах Эшби и Федорова, приготовленных принятым и предлагаемым способами, при высеве 106 микробных клеток по ОСМ на чашку Петри
Среда	Способ приготовления среды	Урожай культуры азотобактера, полученный на плотной среде, абсолютное число ×10 8 (в процентах к контролю)
Эшби	принятый (контроль)	49±5 (100,0)
	предлагаемый	57±4 (116,3)
Федорова	принятый (контроль)	41±4(100,0)
	предлагаемый	52±3 (126,8)