способ прижизненной дифференциальной диагностики трихоцефал тrichocephalus ovis, trichocephalus skrjabini и trichocephalus capreoli жвачных животных

Формула изобретения

Способ прижизненной дифференциальной диагностики трихоцефал Trichocephalus ovis, Trichocephalus skrjabini и Trichocephalus capreoli жвачных животных, заключающийся в отборе яиц трихоцефал на предметное стекло, просветления их в смеси 98,5%-ного раствора глицерина плотностью 1,256 и 40%-ной молочной кислоты, взятых в соотношении 1:1, после чего яйца накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом при увеличениях 600 и 900 под иммерсией, отличающийся тем, что для диагностики проводят определение микроструктурных отличий яиц и дифференцируют виды трихоцефал по следующим признакам: Trichocephalus ovis имеет широкие шапочки на пробочках, нежную, тонкую, прозрачную первую наружную оболочку, которая охватывает все яйцо и отчетливо видна лишь вблизи полюсов при увеличении 900, гладкую поверхность второй наружной кератизированной оболочки, пробочки короткие без выраженной шейки на полюсах, пробочки не соединяются с зародышем, а слегка выступают за пределы оболочек яиц, зародыш заполняет все внутреннее пространство яиц либо находится в центре яйца и имеет форму эллипса, воротнички у основания утолщенные и пальцеобразные вверху, зародышевая масса крупнозернистая с гранулами зеленого цвета, шейки пробочек винтообразной формы и состоят из 5 колец, из которых третье по счету от апикального конца шире остальных в два раза, Trichocephalus skrjabini имеет короткие шапочки на полюсах яиц, выраженную бугристость поверхности второй наружной кератизированной оболочки яйца, зародыш имеет вид зернистой массы желто-коричневого цвета и вогнут у полюсов, воротнички у основания, пробочек толстые, шейки пробочек винтообразной формы и состоят из 6 колец; Trichocephalus capreoli имеет сильно выступающие над поверхностью яиц длинные пробочки с короткими шапочками, толстую кератизированную поверхность второй наружной оболочки яйца со слабой ячеистостью, воротнички у основания пробочек толстые, зародыш у полюсов вогнут и имеет вид мелкозернистой массы, шейки пробочек винтообразной формы и состоят из 8 колец.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, а более конкретно - к паразитологии (гельминтологии) для постановки прижизненного дифференциального диагноза трихоцефал до вида по микроструктуре яиц:

Trichocephalus (Trichuris) ovis, T. skrjabini, T. capreoli, предназначенной для использования при постановке диагноза методами копроовоскопии (флотации, седиментации, комбинированным), при которых ставится диагноз болезни до рода гельминта (яйца трихоцефал имеют форму бочонка с двумя пробочками на полюсах) при заболевании трихоцефалезом домашних (овец, коз, крупного рогатого скота) и диких жвачных животных (лосей, маралов, косуль, жирафов, зубров и др.).

Известны работы по посмертной дифференциальной диагностике по структуре (Магомедбеков У.А., 1953 /3/) и микро- и ультраструктуре яиц трихоцефал (Пасечник В.Е., 1999, 2000 /4,5/, Pasechnik V.E., 1997 /10/).

Магомедбеков У.А. /3/ предложил два отличительных признака по структуре яиц трихоцефал: яйца Т. skrjabini имеют более длинные пробочки на полюсах, упирающиеся в вогнутый край содержимого яйца. Яйца Т. ovis снабжены короткими пробочками и край зернистой массы на полюсах выпуклый.

Этих двух отличительных признаков яиц Т. skrjabini и Т. ovis на практике оказалось крайне недостаточно для дифференциации видов даже посмертно, тем более прижизненно при наличии 29 видов гельминта у домашних и диких жвачных животных.

Пасечник В.Е. (Pasechnik V.E. /4, 5, 6, 10/) впервые в мировой науке изучил микроструктуру и ультраструктуру яиц 3-х видов трихоцефал от жвачных животных под световой и сканирующей электронной микроскопией и выявил наиболее характерные признаки по ультраструктуре яиц:

Т. ovis яйца бочонкообразные с гладкой поверхностной оболочкой. Ультраструктура собственно поверхности пробочек на полюсах волнистая и пробочки не выступают над поверхностью наружной оболочки яиц.

Т. skrjabini яйца имеют бочонкообразную форму с двумя пробочками на полюсах. Пробочки выступают над поверхностью оболочки яйца. Поверхностная оболочка яиц ячеистая, сетчатая, завершается на полюсах бугристостью. Выступающие пробочки яиц на полюсах имеют гранулообразное строение (вид ягоды малины).

Т. capreoli яйца - лимонообразной формы с выступающими пробочками на полюсах. Поверхность яиц неровная, покрыта вдавлениями и сетчатая, кроме полярных концов. Пробочки на полюсах имеют волнистую поверхность.

Приведенные автором дифференциальные признаки очень ценные при разработке дифференциальной посмертной и прижизненной диагностики трихоцефал по яйцам гельминта от жвачных животных.

Однако они имеют некоторые недостатки. Проведение прижизненной дифференциальной диагностики яиц трихоцефал до вида по микроструктуре и ультраструктуре возможно только при наличии хорошо оснащенной лаборатории со сканирующим электронным микроскопом, что в практических условиях бывает даже не во всех научных институтах страны. Кроме того, Пасечник В.Е. /4, 5, 6/ изучил только поверхность пробочек яиц трихоцефал, однако микроструктура шейки пробочек яиц гельминта осталась неизученной.

Прижизненно заражение домашних и диких жвачных трихоцефалами может быть установлено овоскопическим методом исследования фекалий (копроовоскопией), так как яйца их имеют достаточно характерную для рода форму бочонка с двумя пробочками на полюсах.

Величина яиц Trichocephalus ovis 0,073-0,078×0,035-0,037 мм и в среднем 0,0725×0,036 мм, a Trichocephalus skrjabim 0,065-0,080×0,035-0,040 мм и в среднем 0,0725×0,0375 мм, то есть реальной разницы в их размере нет.

Поэтому все исследователи каким бы известным прижизненным методом ни пользовались (флотации: по Фюллеборну и его модификации, седиментации (осаждения) по Эрлиху и его модификации, комбинированным: по Дарлингу и его модификации), ставят общий диагноз болезни - до рода паразита, а не до вида, так как способ прижизненной диагностики трихоцефал до вида не разработан (отсутствует) /2/.

У домашних и диких жвачных паразитируют различные виды трихоцефал, однако летальный исход вызывали по данным авторов из России, Молдовы, Индии, Канады и США следующие виды: Trichocephalus (Trichuris) ovis Abildgaard, 1795; Т. skrjabini Baskakov, 1924; Т. tenuis Chandler, 1930; Т. discolor Linstow, 1906. Гибель домашних и диких жвачных животных наступала при интенсивности инвазии этими видами: у овец более 800 экземпляров, у верблюда в зоопарке до 50000 экземпляров и у крупного рогатого скота до 4750 экземпляров трихоцефал на 1 павшее животное, А.Г.Богданов /1/; В.Е.Пасечник /5/; Chandler А.С. /7/; Georgi J.R. et al., /8/; Nooruddin M., et al., 191; Smit H.J. and Stevenson, R.G., /11/; Sriwastava A.K.; Sharma D.N., /12/.

Изестные методы прижизненной диагностики:

флотации по Фюллеборну с раствором хлорида натрия (1920) и его модификации по Котельникову и Хренову: стандартизированная методика флотации с раствором нитрата аммония (гранулированной или химически чистой аммиачной селитры) и др., /2/;

метод седиментации (осаждения взвешенных в жидкости фекалий яиц гельминта) по Эрлиху (1927) и его модификации: с целлофановыми пленками по Котельникову Г.А. и Хренову В.М., Stolla W. и др., /2/;

метод комбинированный по Дарлингу (1911) - основан на противоположных приемах обработки проб фекалий (седиментации (осаждении и флотации)) и его модификации: стандартизированная с раствором нитрата свинца (плотность 1,5) и с раствором нитрата аммония (плотность 1,3) по Котельникову Г.А. и Хренову В.М. и др., /2/, которые при исследовании на трихоцефалезы жвачных имеют один существенный недостаток.

Они позволяют исследователю прижизненно поставить общий диагноз заболеванию трихоцефалез. Однако это является диагнозом рода. А в научных целях и в практических условиях необходимо уточнять диагноз болезни, вызываемой гельминтом, до вида.

Особенно это важно при заболевании высокоценных племенных и на грани исчезновения видов животных в зоопарках, цирках и заповедниках Российской Федерации (зубр, Алтайский горный баран, Уссурийский пятнистый олень, Новоземельский северный олень, дзерен и др.), которых для уточнения диагноза до вида трихоцефал: Т. ovis; Т. skrjabini; Т. capreoli (возбудителя болезни) необходимо исследовать посмертно (на вскрытии), что влечет за собой огромные экономические потери.

Кроме того, заболевание животного с летальным исходом может быть вызвано одним видом или смешанной инвазией (несколько видов трихоцефал). Что влечет за собой иногда снижение эффективности методов лечения, так как при данной болезни отсутствует прижизненный способ диагностики до вида возбудителя болезни: Trichocephalus (Trichuris) ovis, Trichocephalus (Trichuris) skrjabini, Trichocephalus (Trichuris) capreoli.

Цель изобретения. Целью изобретения является использование изученной нами впервые микроструктуры 2-й поверхностной оболочки, шейки пробочек и зародыша зрелых 5000 яиц трихоцефал, извлеченных из вагины самок каждого идентифицированного до вида паразита, которые были собраны методом гельминтологических вскрытий от овец, коз и крупного рогатого скота спонтанно зараженных трихоцефалезом, которая могла бы быть применена в повышении эффективности способа и постановки прижизненного диагноза не до рода, как при известных методах прижизненной диагностики (флотации, седиментации, комбинированным), а до вида трихоцефал по микроструктуре яиц: Trichocephalus (Trichuris) ovis, Т. skrjabini, Т. capreoli - возбудителей болезни.

1. Поставленная цель достигается тем, что при проведении диагностики на трихоцефалез одним из известных методов: флотации, седиментации или комбинированным /2/ применяют разработанный нами способ прижизненной дифференциальной диагностики трихоцефал жвачных животных, который заключается в отборе на предметное стекло яиц, просветлении их в 98,5% растворе глицерина (плотностью 1,256) плюс 40% молочная кислота в соотношении 1:1, накрывают предметным стеклом и просматривают под микроскопом при увеличениях: 600 и 900 (под иммерсией), отличающийся от известных методов прижизненной диагностики (флотации, седиментации, комбинированный) тем, что с целью повышения эффективности диагностики проводят определение микроструктурных отличий яиц, ставя диагноз болезни не до рода: яйца в форме бочонка с двумя пробочками на полюсах, а до вида: Trichocephalus ovis /с.18, 19, 20/ имеет широкие шапочки на пробочках Фиг.1(а) - А, Фиг.1(б) - А; нежную, тонкую, прозрачную 1-ю наружную оболочку, которая охватывает все яйцо и отчетливо видна лишь вблизи полюсов (при увеличении 900) Фиг.1(б) - Б; гладкую поверхность 2-й наружной кератизированной оболочки Фиг.1(а) - Г; воротнички, утолщенные у основания и пальцеобразные вверху Фиг.1(б) - а и а; пробочки короткие без выраженной шейки на полюсах Фиг.1(а) - В; шейки пробочек винтообразной формы с 5-ю кольцами, из которых 3-е по счету от апикального конца шире остальных в два раза Фиг.1(б): 1, 2, 3, 4, 5; 5-е кольцо с широким основанием скрепляет основание шейки пробочек с третьей внутренней прозрачной оболочкой яйца Фиг.1(б): 5 и Г; пробочки не соединяются с зародышем, а слегка выступают за пределы оболочек яиц Фиг.1(б); зародыш заполняет все внутреннее пространство яиц либо находится в центре яйца и имеет форму эллипса Фиг.1(а) - Е; зародышевая масса крупнозернистая с гранулами зеленого цвета Фиг.1(б) - Е.

2. Способ прижизненной дифференциальной диагностики трихоцефал по п.1 отличается тем, что Trichocephalus skrjabini / с.18, 19, 20/ имеет короткие шапочки на полюсах яиц Фиг.2(а) - А, Фиг.2(б) - А; выраженную бугристость поверхности 2-й наружной кератизированной оболочки яиц Фиг.2(а) - В и 1, 2, 3; шейки пробочек - винтообразной формы и имеют 6-ть колец Фиг.2(б): 1, 2, 3, 4, 5, 6; последнее кольцо с широким основанием выполняет роль связующего звена между основанием шейки пробочек и третьей внутренней прозрачной оболочкой яйца Фиг.2(б): 5 и Г; зародыш имеет вид зернистой массы желто-коричневого цвета и вогнут у полюсов Фиг.2(а) - Д, Фиг.2(б) - Е.

3. Способ прижизненной дифференциальной диагностики трихоцефал по п.1 отличается тем, что Trichocephalus capreoli /с.18, 19, 20/ имеет на полюсах сильно выступающие над поверхностью яиц длинные пробочки с короткими на верхушках шапочками Фиг.3(а) - А и Фиг.3(б) - А; толстую кератизированную поверхность 2-й наружной оболочки яйца со слабой ячеистостью Фиг.3(а) - В и Ж; шейки пробочек - винтообразной формы и состоят из 8-ми колец Фиг.3(б): 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8; последнее кольцо выполняет роль связующего звена между основанием шейки пробочек и третьей внутренней прозрачной оболочкой зародыша Фиг.3.(б): 8 и Г; воротнички у основания пробочек толстые Фиг.3(б) - Б и Б; зародыш у полюсов вогнут и имеет вид мелкой зернистой массы (содержимое 4-й прозрачной оболочки яиц) Фиг.3(а) - Е, Фиг.3(б) - Е.

Эти морфологические отличия трех видов трихоцефал позволяют отдифференцировать в 100% случаев наиболее распространенные виды трихоцефал (Trichuris ovis; Т. skrjabini; T. capreoli) жвачных, не прибегая к убою животных.

Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом (флотации, седиментации и комбинированными) показывает, что заявляемый способ отличается от известных тем, что проводят раздельное сопоставление морфологических особенностей яиц и в соответствии с нашими рисунками (микрофотографиями) ставят диагноз болезни не до рода, а до вида гельминта: Trichocephalus (Trichuris) ovis, Trichocephalus skrjabini, Trichocephalus capreoli.

Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «новизна». Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, не выявлены в других технических решениях и поэтому они обеспечивают заявляемому техническому решению соответствие критерию «существенные отличия».

Пример конкретного выполнения предлагаемого способа.

Пример. В хозяйстве, стационарно неблагополучном по трихоцефалезу, выделили 50 овец и 25 крупного рогатого скота, которые планировали убить на мясокомбинате. Парнокопытных пометили ушными бирками и от каждого индивидуально из прямой кишки были взяты пробы фекалий, которые исследовали на наличие яиц трихоцефал известными методами копроовоскопии: флотации, седиментации и комбинированным.

В 45 пробах от овец и 5 пробах от крупного рогатого скота были выявлены яйца трихоцефал, что позволило поставить предварительный диагноз болезни по родовым признакам (яйца в форме бочонка с двумя пробочками на полюсах) трихоцефалез. В последующем используя разработанный нами способ прижизненной дифференциальной диагностики трихоцефал, выявили видовые признаки яиц в пробах от 45 овец и 5 голов крупного рогатого скота, которых мы определили как возбудителей болезни, вызванной тремя видами: Trichocephalus (Trichuris) ovis, Т. skrjabini, T. capreoli. Ниже приводим последовательность постановки диагноза до вида возбудителя инвазии.

Предварительно просветленные яйца паразита смесью 98,5% раствора глицерина (плотность 1,256) и 40% молочной кислоты в соотношении 1:1 помещали на предметное стекло и исследовали при увеличениях микроскопа: 600 и 900 (под иммерсией).

При соответствии морфологических признаков яиц трихоцефал /с.18, 19, 20/:

имеет широкие шапочки на пробочках Фиг.1(а) - А, Фиг.1(6) - А; нежную, тонкую, прозрачную 1-ю наружную оболочку, которая охватывает все яйцо и отчетливо видна лишь вблизи полюсов (при увеличении 900) Фиг.1(б) - Б; гладкую поверхность 2-й наружной кератизированной оболочки Фиг.1(а) - Г; воротнички, утолщенные у основания и пальцеобразные вверху Фиг.1(б) - а и а; пробочки короткие без выраженной шейки на полюсах Фиг.1(а) - В; шейки пробочек винтообразной формы с 5-ю кольцами, из которых 3-е по счету от апикального конца шире остальных в два раза Фиг.1(б): 1, 2, 3, 4, 5; 5-е кольцо с широким основанием скрепляет основание шейки пробочек с третьей внутренней прозрачной оболочкой яйца Фиг.1(б) - 5 и Г; пробочки не соединяются с зародышем, а слегка выступают за пределы оболочек яиц Фиг.1(б); зародыш заполняет все внутреннее пространство яиц либо находится в центре яйца и имеет форму эллипса Фиг.1(а) - Е; зародышевая масса крупнозернистая с гранулами зеленого цвета Фиг.1(б) - Е.

В таком комплексе признаков и сопоставлении их с нашими микрофотографиями (с.18, 19, 20) ставится диагноз вида: Trichocephalus (Trichuris) ovis.

При наличии морфологических признаков у яиц трихоцефал:

имеет короткие шапочки на полюсах яиц Фиг.2(а) - А, Фиг.2(б) - А; выраженную бугристость поверхности 2-й наружной кератизированной оболочки яиц Фиг.2(а) - В и 1, 2, 3; шейки пробочек - винтообразной формы и имеют 6-ть колец Фиг.2(б): 1, 2, 3, 4, 5, 6; последнее кольцо с широким основанием выполняет роль связующего звена между основанием шейки пробочек - и третьей внутренней прозрачной оболочкой яйца Фиг.2(б) - 6 и Г; зародыш имеет вид зернистой массы желто-коричневого цвета и вогнут у полюсов Фиг.2(а) - Д, Фиг.2(б) - Д и Е.

Совокупность этих признаков и соответствие их нашим микрофотографиям (с.18, 19, 20) позволило поставить диагноз возбудителя болезни, вызванной видом: Trichocephalus (Trichuris) skrjabini.

При соответствии следующих морфологических признаках яиц трихоцефал: имеют на полюсах сильно выступающие над поверхностью яиц длинные пробочки с короткими на верхушках шапочками Фиг.3(а) и Фиг.3(б) - А; толстую кератизированную поверхность 2-й наружной оболочки яйца со слабой ячеистостью Фиг.3(а) - В и Ж; шейки пробочек - винтообразной формы и состоят из 8-ми колец Фиг.3(б): 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8; последнее кольцо выполняет роль связующего звена между основанием шейки пробочек и внутренней третьей прозрачной оболочкой яйца Фиг.3(б): 8 и Г; воротнички у основания пробочек толстые Фиг.3(б) - Б; зародыш у полюсов вогнут и имеет вид мелкой зернистой массы (содержимое 4-й прозрачной оболочки яиц) Фиг.3(а) и Фиг.3(б) - Д, Е.

Совокупность этих признаков и соответствие их нашим микрофотографиям (с.18, 19, 20) позволило поставить диагноз возбудителя болезни, вызванной видом: Trichocephalus (Trichuris) capreoli.

После проведения вышеуказанных исследований овец и крупный рогатый скот убили (50 голов), а толстый отдел кишечника и слепую кишку подвергли гельминтологическому исследованию. У овец и крупного рогатого скота были обнаружены половозрелые гельминты 3-х видов: Trichocephalus (Trichuris) ovis, Т. skrjabini, T. capreoli.

Таким образом, результаты гельминтологических вскрытий подтвердили данные, полученные при использовании предлагаемого способа прижизненного дифференциального диагноза трихоцефал не до рода: (яйца имеют форму бочонка с двумя пробочками на полюсах), а до вида: Trichocephalus (Trichuris) ovis, Т. skrjabini, T. capreoli - возбудителя болезни, так как микроструктура яиц трихоцефал жвачных животных имеет свои видовые особенности, которые были впервые изучены и выявлены нами.

Использование предлагаемого способа прижизненной дифференциальной диагностики при трихоцефалезе жвачных животных обеспечивает по сравнению с существующими: флотации, комбинированным и седиментации следующие преимущества:

1. Сокращает время и снижает трудоемкость исследований за счет исключения необходимости проведения измерений большого количества яиц трихоцефал (диагностику можно проводить по нескольким яйцам паразита, попавшим в поле зрения исследователя).

2. Исключает необходимость исследования на вскрытии хозяйственно ценных пород: овец, коз, крупного рогатого скота, верблюдов и др.

3. Исключает необходимость исследования на вскрытии находящихся на грани исчезновения видов животных в зоопарках, цирках и заповедниках: зубр, Уссурийский пятнистый олень, дзерен и др.

4. Экономически выражается в сохранении больших финансовых сумм (иногда исчисляемая миллионами рублей) в результате точного видового диагноза возбудителя болезни: Trichocephalus (Trichuris) ovis; Т. skrjabini; T. capreoli и соответственно сохранении высокой продуктивности животных (молока, шерсти, мяса) и предотвращении гибели больных трихоцефалезом животных.

5. Сохраняет исчезающих в России и в мировой фауне редких видов зверей.

6. Разработка более эффективной терапии применительно к конкретному виду трихоцефал - возбудителю болезни.

7. Способ прижизненной дифференциальной диагностики при трихоцефалезе жвачных легко осуществим в лабораторных условиях.

8. Обеспечивает 100% точность постановки прижизненного дифференциального диагноза не до рода, а до вида паразита.

Источники информации

1. Богданов А.Г. Течение трихоцефалеза овец в Бурятии - Монгольской АССР. // Труды Бурят - Монгольской НИВС.- 1956. - В.3. - С.71-75.

2. Котельников Г.А. «Гельминтологические исследования животных и окружающей среды» // Справочник. - М.: Колос - 1984 - 208 с.

3. Магомедбеков У.А. // Диссер. кандидата ветеринарных наук. - М. - 1953-131 с.

4. Пасечник В.Е. К морфологии видов Trichuris (Trichocephalus) ovis Abildgaard, 1795 Т. skrjabini Baskakov, 1924 // Труды Всероссийского института гельминтологии имени К.И.Скрябина. - М. - 1999 - Том 35 - С.85-120.

5. Пасечник В.Е. // Диссер. кандидата ветеринарных наук. - М. - 2000 - 184 с.

6. Пасечник В.Е. Сканирующая электронная микроскопия Trichocephalus (Trichuris) capreoli Artjuch, 1948. // Труды Всероссийского института гельминтологии имени К.И. Скрябина. - М. - 2000 - Том 36 - С.141-156.

7. Chandler A.C. Specific characters in the genus Trichuris with a description of a new species, Trichuris tenuis from a camel. // J. Parasitol. Urbana - 1930 - V.16 - P.198-206.

8. Georgi J.R.; Whitlock R.H.; Flinton J.H. // Fatal Trichuris discolor in - fecion in a Holstein - Friesian heifer. Report of a case. Comell Veter. - 1972 - V. 62. - 1. - P.58-60.

9. Nooruddin М.; Baki M.A.; Das J.G. // Clinicopatholodgical studies of outbreak oftrichuriasis in cow calwes. - Indian J. of Veterinary Medicine. - 1987. - V.7. - 2. - P.116-119.

10. Pasechnik V.E. Ultrastmcture of eggs surface of the genus Trichocephalus Schrank, 1788// Second English language International Nematology Simposium of the Societi ofNematologist. - Abstract. - Moscow. - 23 - 30 August 1997. - P.20.

11. Smit H.J. and Stevenson, R.G. A clinical outbreak of Trichuris discolor infection in stabled calves. // Canad., veter., J. - 1970. - V.11 - 5. - P.102.

12. Sriwastava A.K.; Sharma D.N. // Fatal trichuriasis in cow calves - a clinical and pathomorphological study. - Veterinary Research Journal - 1982 - V.5. - 2. - P.104-106.