определение хромосомных аномалий в клетках, полученных из фолликулярной жидкости

Формула изобретения

1. Способ идентификации аномалии репродуктивной системы, представляющей собой анеуплоидию, включающий в себя

a) получение соматических клеток из фолликулярной жидкости у человека;

b) выполнение генетического анализа указанных клеток;

где идентификация по меньшей мере одной хромосомной аномалии в части клеток указывает на слабовыраженный гонадный мозаицизм.

2. Способ по п.1, где фолликулярную жидкость получают во время процедуры оплодотворения in vitro.

3. Способ по п.1, где фолликулярную жидкость получают во время процедуры внутрицитоплазматической инъекции сперматозоида.

4. Способ по п.1, где фолликулярную жидкость получают из одного яичника субъекта.

5. Способ по п.1, где фолликулярную жидкость получают из обоих яичников субъекта.

6. Способ по п.1, где генетический анализ представляет собой флуоресцентную гибридизацию in situ.

7. Способ по п.1, где генетический анализ представляет собой кариотипирование.

8. Способ по п.1, где генетический анализ представляет собой секвенирование ДНК.

9. Способ по п.1, где генетический анализ представляет собой способ, выбранный из группы, состоящей из сравнительной геномной гибридизации (CGH), многоцветного бэндинга (МСВ), количественной FISH (Q-FISH), полимеразной цепной реакции (PCR), технологии GBA (минитипирования), мультиплексного секвенирования, SNaPshot, MassEXTEND, MassArray, лигирования на миниматрицах, минисеквенирования на микроматрицах, маркерных матриц, удлинения праймеров на матрицах (APEX), удлинения праймеров на микроматрицах, GOOD-анализа, кодироуемых микросфер, анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (RFLP), аллель-специфического анализа олигонуклеотидов (ASO), специфичной к метилированию ПЦР (MSPCR), способа пиросеквенирования, анализа acycloprime, обратного дот-блот-анализа, микроматриц GeneChip, динамической аллель-специфической гибридизации (DASH), пептидных зондов нуклеиновых кислот (PNA) и запирающих зондов нуклеиновых кислот (LNA), TaqMan, Molecular Beacons, интеркалирующего окрашивания, FRET-праймеров, AlphaScreen, SNPstream, Invader assay, управляемого матрицей включения (TDI), флуоресцентной поляризации, анализа олигонуклеотидного лигирования и выделения кодируемых последовательностей, лигазной цепной реакции, запирающих зондов, амплификации по типу катящегося кольца и колориметрического анализа олигонуклеотидного лигирования (OLA).

10. Способ по п.9, где сравнительную геномную гибридизацию выполняют с метафазными хромосомами или CGH-матрицей.

11. Способ по п.1, где анеуплоидия представляет собой полную или частичную трисомию.

12. Способ по п.11, где трисомия представляет собой трисомию 13, трисомию 16, трисомию 18, трисомию 21, трисомию 22, XXY, XYY или XXX.

13. Способ по п.1, где анеуплоидия представляет собой полную или частичную моносомию.

14. Способ по п.13, где моносомия представляет собой моносомию X, моносомию 13, моносомию 16, моносомию 18, моносомию 21 или моносомию 22.

15. Способ по п.14, где анеуплоидия представляет собой полную или частичную нуллисомию.

16. Способ по п.15, где нуллисомия представлена для хромосом 13, 16, 18, 21, 22, X или Y.

17. Способ анализа повышенного риска бесплодия, вызванного анеуплоидией, у млекопитающего, предпочтительно человека, включающий в себя

a) получение соматических клеток из фолликулярной жидкости животного; и

b) выполнение генетического анализа клеток;

где идентификация по меньшей мере слабовыраженного гонадного мозаицизма в части клеток указывает на наличие повышенного риска бесплодия.

18. Способ по п.17, где фолликулярную жидкость получают во время процедуры оплодотворения in vitro или процедуры внутрицитоплазматической инъекции сперматозоида.

19. Способ по п.18, согласно которому эмбрион, полученный во время процедуры оплодотворения in vitro, подвержен предимплантационному генетическому анализу.

20. Способ по п.19, где генетический анализ показывает, что эмбрион не имеет хромосомной аномалии, и эмбрион переносят в матку животного.

Описание изобретения к патенту

Перекрестные ссылки народственную заявку

В настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной индийской заявке на патент № 642/MUM/2004, зарегистрированной 11 июня 2004 г.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способу определения у индивидуума в клетках, полученных из фолликулярной жидкости хромосомных аномалий, включая гонадный мозаицизм.

Описание смежной области

Представленные в ядре эукариотических клеток хромосомы несут генетическую информацию клетки. Как правило, в каждой диплоидной клетке человека присутствует 23 пары хромосом с общим количеством 46 хромосом. Аномалии в структуре или количестве хромосом могут приводить к физиологическим и связанным с развитием аномалиям. Структурные аномалии хромосом могут представлять собой транслокации (реципрокные и робертсоновские), делеции, инверсии (парацентрические и перицентрические), кольцевые хромосомы и изохромосомы. Структурные хромосомные аномалии также включают в себя реаранжировку хромосом, возникающую в результате разрыва хромосомы и последующей сборки с различной сбалансированной или несбалансированной конфигурацией (Mueller RF and Young ID; Emery's Elements of Medical Genetics Ninth Edition, 1995, p. 37).

Количественные хромосомные аномалии представляют собой потерю или увеличение на одну или несколько хромосом (анеуплоидия), потерю полного набора хромосом (моноплоидия) или увеличение на один или несколько полных наборов хромосом (полиплоидия). Анеуплоидия может встречаться в форме нуллисомии (потери пары гомологичных хромосом, 2n-2), моносомии (потери одной хромосомы, 2n-1), трисомии (увеличении на одну хромосому, 2n+1) или тетрасомии (увеличении на пару гомологов, 2n+2). Анеуплоидия может быть результатом отсутствия расхождения, когда парные хромосомы не разделяются друг с другом во время деления клетки. Если нерасхождение происходит во время гаметогенеза, половина (нерасхождение при мейозе II) или все (нерасхождение при мейозе I) образующиеся гаметы будут являться анеуплоидными. Нерасхождение также может происходить при митозе, образуя две клеточные линии с различным количеством хромосом.

Следовательно, отдельный индивидуум может иметь две или несколько клеточных популяций с различными кариотипами или генетическим составом, который можно назвать мозаицизмом, хромосомным мозаицизмом или гонадным мозаицизмом. Здесь мозаичным является организм, состоящий из клеток с двумя или несколькими различными генотипами. Различные части тела индивидуума могут иметь клетки с различным общим количеством хромосом или содержанием хромосом, если явление нерасхождения происходит на этапе раннего развитии индивидуума. Мозаицизм также может являться следствием событий генных мутаций. Аналогичным образом, если мутация происходит на этапе раннего эмбрионального развития, некоторые, но не все, клетки индивидуума могут иметь мутацию.

Хромосомный мозаицизм может возникать в любом количестве тканей, в зависимости от временн ого интервала явления нерасхождения и типа клеток, в которых оно происходит. Следовательно, трудно предсказать тип или тяжесть симптомов у индивидуума с хромосомным мозаицизмом. Если мозаицизм ограничен гонадами, он известен как гонадный мозаицизм (Goldstein et al., J. Pediatrics, 1977, 90:604). Гонадный мозаицизм может возникать в результате происходящей в гонадах развивающегося эмбриона мутации.

Также известно, что хромосомные аномалии влияют на развитие и функционирование яичников в зависимости от доли аномальных клеток в яичниках (Cunniff et al., Hum Genet., 1991, 86: 553-556). Например, показано, что женщины с потерей копии X-хромосомы (45,X) или обладающие дополнительной копией X-хромосомы (46,XX) имеют повышенный риск преждевременного угасания функции яичников (Cunniff et al., Hum. Genet., 1991, 86: 553-556; Zinn et al., Trends Genet. 1993, 9: 90-93). Исследования показали, что до 99% оплодотворений с моносомией 45,X приводят к преждевременному прерыванию беременности (Hook and Warburton, Hum. Genet., 1983, 64: 24-27; Hassold et al., Am. J. Hum. Genet., 1988, 42: 534-541). Мозаичная X-хромосомная моносомия (45,X/46,XX) ассоциирована с атрезией фолликулов, гонадной дисгенезией, а также отчасти является причиной прерывания беременности на ранних сроках (Zinn et al., Trends Genet., 1993, 9: 90-93; Shreck et al., Emery and Rimoni's Principles of Practice of Medical Genetics, Vol. 1, Churchill Livingstone, 2002, 982-97).

Женщины с гонадным мозаицизмом могут иметь ооциты с хромосомными аномалиями, которые могут являться причиной бесплодия или хромосомных аномалий у развивающегося эмбриона. Данные возможные эффекты служат основанием для консультации или лечебных действий, как, например, донорство ооцитов/эмбрионов, предимплантационная генетическая диагностика или пренатальная диагностика. Следовательно, усовершенствование определения или диагностики гонадного мозаицизма улучшат обслуживание больных.

Существующие способы идентификации и диагностики хромосомных аномалий ограничены гонадным мозаицизмом, а при обнаружении слабо выраженного мозаицизма доступные способы являются инвазивными или неэффективными. Например, подозрение на хромосомную аномалию у индивидуума можно подтвердить или исключить посредством анализа образца крови. Однако данное исследование необязательно определяет мозаицизм, ограниченный одним органом или тканью или даже ограниченной части клеток в данной ткани. Например, анализ образца крови может не определить гонадный мозаицизм. Кроме того, люди с гонадным мозаицизмом могут оставаться в значительной степени бессимптомными в течение жизни, что дополнительно снижает возможности диагностики.

Для диагностики ограниченного одной тканью мозаицизма должны быть проанализированы клетки данной конкретной ткани. Обнаружение мозаицизма в данной ткани зависит от количества пораженных клеток и количества проанализированных клеток. Кариотипирование представляет собой часто применяемый генетический тест для хромосомного анализа, при котором исследуют полный хромосомный состав клетки индивидуума посредством визуализации хромосом и подсчета хромосом. Подверженные кариотипированию клетки предпочтительно культивируют и останавливают митоз на стадии метафазы клеточного деления, так как хромосомы лучше всего визуализируются на стадии метафазы клеточного деления. Это делает кариотипирование длительной и трудоемкой процедурой и не позволяет анализировать очень большое количество клеток. Следовательно, при помощи кариотипирования можно не определить слабо выраженный мозаицизм, при котором поражена лишь небольшая часть клеток в органе или ткани.

В настоящее время для определения гонадного мозаицизма гонадную ткань выделяют посредством биопсии гонад. Биопсия гонад не является обычной процедурой, ее выполняют посредством тонкоигольной пункционно-аспирационной биопсии или клинообразной биопсии с применением лапаротомии или лапароскопии. После этого полученный образец ткани кариотипируют, что может не выявить слабо выраженный гонадный мозаицизм. Следовательно, существующие исследования для определения хромосомных аномалий имеют ограниченные возможности в определении гонадного мозаицизма, конкретно слабовыраженного гонадного мозаицизма.

Следовательно, желательно предоставить миниинвазивный способ для определения хромосомных аномалий, включая гонадный мозаицизм, предпочтительно определяющий даже слабовыраженный гонадный мозаицизм.

КРАТКАЯ СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам определения по меньшей мере одной хромосомной аномалии в клетках, полученных из фолликулярной жидкости, включающим в себя

a) получение клеток из фолликулярной жидкости;

b) генетический анализ клеток;

где часть клеток имеет по меньшей мере одну хромосомную аномалию. В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам идентификации аномалий репродуктивной системы, где идентификация по меньшей мере одной хромосомной аномалии в части полученных из фолликулярной жидкости клеток является характерной аномалией репродуктивной системы. Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам идентификации гонадного мозаицизма посредством идентификации по меньшей мере одной хромосомной аномалии в клетках, полученных из фолликулярной жидкости с применением тех же способов. В конкретных вариантах осуществления гонадный мозаицизм представляет собой слабовыраженный гонадный мозаицизм, где предпочтительно менее 10% клеток, более предпочтительно, менее чем 5%-10% клеток в ткани или органе имеют хромосомную аномалию. В предпочтительных вариантах осуществления фолликулярную жидкость получают от животного, более предпочтительно, от человека. Полученные из фолликулярной жидкости клетки могут происходить из репродуктивных тканей и в конкретных вариантах осуществления представляют собой соматические клетки. В предпочтительных вариантах осуществления, фолликулярную жидкость получают во время процедуры оплодотворения или процедуры внутрицитоплазматической инъекции сперматозоида in vitro . В других вариантах осуществления, фолликулярную жидкость не получают в связи с любой из данных процедур. Предпочтительно фолликулярную жидкость получают из одного или обоих яичников субъекта.

Настоящее описание изобретения также относится к способам анализа повышенного риска бесплодия у животных, включающим в себя

a) получение клеток из фолликулярной жидкости животного; и

b) генетический анализ клеток,

где определение по меньшей мере одной хромосомной аномалии в части клеток является характерным указанием на повышенный риск бесплодия. В предпочтительных вариантах осуществления животным является человек. Полученные из фолликулярной жидкости клетки могут происходить из репродуктивных тканей и в конкретных вариантах осуществления представляют собой соматические клетки. В предпочтительных вариантах осуществления фолликулярную жидкость получают во время процедуры оплодотворения или процедуры внутрицитоплазматической инъекции сперматозоида in vitro. В других вариантах осуществления фолликулярную жидкость получают способом, не связанным с любой из указанных процедур. Предпочтительно фолликулярную жидкость получают из одного или обоих яичников животного. В предпочтительных вариантах осуществления, когда идентифицируют, что животное имеет повышенный риск бесплодия, и подвергают животное процедуре оплодотворения in vitro, эмбрион, полученный из выделенных у животного ооцитов, можно подвергать предимплантационному генетическому анализу. В более предпочтительных вариантах осуществления, когда генетический анализ показывает, что эмбрион не имеет хромосомной аномалии, эмбрион предпочтительно пересаживают в матку животного.

Любой из описанных здесь способов можно применять в качестве хорошо известных специалисту в данной области способов генетического анализа для определения хромосомных аномалий в клетках, полученных из фолликулярной жидкости. В предпочтительных вариантах осуществления, генетический анализ представляет собой флуоресцентную гибридизацию in situ, кариотипирование или секвенирование ДНК. В других предпочтительных вариантах осуществления генетический анализ представляет собой сравнительную геномную гибридизацию (CGH) (например, выполненную с метафазными хромосомами или CGH-матрицей), многоцветный бэндинг (MCB), количественную FISH (Q-FISH), полимеразную цепную реакцию (PCR), технологию GBA (минитипирование), мультиплексное секвенирование, SNaPshot, MassEXTEND, MassArray, лигирование на миниматрицах, минисеквенирование на микроматрицах, маркерные миниматрицы, удлинение праймеров на матрицах (APEX), удлинение праймеров на микроматрицах, GOOD-анализ, кодированные микросферы, анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (RFLP), аллель-специфический анализ олигонуклеотидов (ASO), специфичную к метилированию ПЦР (MSPCR), способ пиросеквенирования, анализ acycloprime, обратный дот-блот, микроматрицы GeneChip, динамическую аллель-специфическую гибридизацию (DASH), пептидные зонды нуклеиновых кислот (PNA) и запирающие зонды нуклеиновых кислот (LNA), TaqMan, Molecular Beacons, интеркалирующее окрашивание, праймеры FRET, AlphaScreen, SNPstream, Invader assay, управляемое матрицей включение (TDI), флуоресцентную поляризацию, анализ олигонуклеотидного лигирования и выделение кодированных последовательностей, лигазную цепную реакцию, запирающие зонды, амплификацию по типу катящегося кольца или колориметрический анализ олигонуклеотидного лигирования (OLA).

В выделенных из фолликулярной жидкости клетках можно идентифицировать любое количество хромосомных аномалий, которые могут являться характерными для гонадного мозаицизма или слабо выраженного гонадного мозаицизма. В конкретных вариантах осуществления, хромосомная аномалия, идентифицированная во всех клетках или в части клеток из фолликулярной жидкости, представляет собой анеуплоидию, транслокацию, делецию, микроделецию, инверсию или удвоение. Идентифицированная анеуплоидия может представлять собой полную или частичную трисомию, например, трисомию 13, трисомию 16, трисомию 18, трисомию 21, трисомию 22, XXY, XYY или XXX; полную или частичную моносомию, например, моносомию X, моносомию 13, моносомию 16, моносомию 18, моносомию 21 или моносомию 22; или полную или частичную нуллисомию, например, для хромосом 13, 16, 18, 21, 22, X или Y.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Сопровождающие фигуры являются частью настоящего изобретения и включены для дополнительной демонстрации конкретных аспектов настоящего изобретения. Описание изобретения можно лучше понять со ссылкой на одну или несколько данных фигур в сочетании с подробным описанием представленных здесь конкретных вариантов осуществления.

Фигура 1. Микрофотография анализа FISH нормальной диплоидной человеческой женской клетки, полученной из фолликулярной жидкости. Применяют специфичные для хромосом X (зеленый), Y (оранжевый) и 18 (голубой) зонды, а докрашивают клетки темно-синим контрастирующим красителем DAPI. Видны два голубых сигнала для хромосомы 18 и два зеленых сигнала для хромосомы X, обозначающие нормальную диплоидную женскую клетку.

Фигура 2. Микрофотография анализа FISH полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки с моносомией 18. Применяют специфичные для хромосом X (зеленый), Y (оранжевый) и 18 (голубой) зонды, а докрашивают клетки темно-синим контрастирующим красителем DAPI. Видны один голубой сигнал для хромосомы 18 и два зеленых сигнала для хромосомы X, обозначая в женской клетке моносомию 18.

Фигура 3. Микрофотография анализа FISH полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки с моносомией X. Применяют специфичные для хромосом X (зеленый), Y (оранжевый) и 18 (голубой) зонды, а докрашивают клетки темно-синим контрастирующим красителем DAPI. Видны два голубых сигнала для хромосомы 18 и один зеленый сигнал для хромосомы X, обозначая в женской клетке моносомию X.

Фигура 4. Микрофотография анализа FISH полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки с трисомией 18. Применяют специфичные для хромосом X (зеленый), Y (оранжевый) и 18 (голубой) зонды, а докрашивают клетки темно-синим контрастирующим красителем DAPI. Видны три голубых сигнала для хромосомы 18 и два зеленых сигнала для хромосомы X, обозначая в женской клетке трисомию 18.

Фигура 5. Микрофотография анализа FISH полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки с трисомией X. Применяют специфичные для хромосом X (зеленый), Y (оранжевый) и 18 (голубой) зонды, а докрашивают клетки темно-синим контрастирующим красителем DAPI. Видны два голубых сигнала для хромосомы 18 и три зеленых сигнала для хромосомы X, обозначая в женской клетке трисомию X.

Фигура 6. Микрофотография анализа FISH нормальной полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки. Применяют специфичные для хромосом 13 (зеленый) и 21 (оранжевый) зонды, а докрашивают клетки темно-синим контрастирующим красителем DAPI. Видны два зеленых сигнала для хромосомы 13 и два оранжевых сигнала для хромосомы 21, обозначая диплоидную клетку с нормальным набором хромосом 13 и 21.

Фигура 7. Микрофотография анализа FISH полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки с трисомией 13. Применяют специфичные для хромосом 13 (зеленый) и 21 (оранжевый) зонды, а докрашивают клетки темно-синим контрастирующим красителем DAPI. Видны три зеленых сигнала для хромосомы 13 и два оранжевых сигнала для хромосомы 21, обозначая трисомию 13 женской клетки.

Фигура 8. Микрофотография анализа FISH полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки с трисомией 21. Применяют специфичные для хромосом 13 (зеленый) и 21 (оранжевый) зонды, а докрашивают клетки темно-синим контрастирующим красителем DAPI. Видны два зеленых сигнала для хромосомы 13 и три оранжевых сигнала для хромосомы 21, обозначая трисомию 21 женской клетки.

Фигура 9. Кариотипический анализ полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки с моносомией X. В данном кариотипе видна одна хромосома X, обозначая моносомию X данной клетки. При анализе дополнительных клеток из того же образца фолликулярной жидкости, 3 из 20 проанализированных клеток продемонстрировали аналогичный профиль, означающий гонадный мозаицизм при моносомии X.

Фигура 10. Кариотипический анализ полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки с трисомией 21. В данном кариотипе показаны три 21 хромосомы, обозначая трисомию 21 данной клетки.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем описании изобретения описаны способы идентификации хромосомных аномалий у субъекта посредством получения клеток из фолликулярной жидкости и анализа данных клеток, например, генетического анализа хромосомных аномалий. Предпочтительно посредством описанного способа выявляют субъектов с гонадным мозаицизмом или слабовыраженным гонадным мозаицизмом. Слабовыраженным гонадный мозаицизм является, если мозаичность субъекта составляет предпочтительно менее 10% клеток, а более предпочтительно, менее чем от 5% до 1% клеток в ткани или органе. В одном варианте осуществления проанализированные посредством описанных здесь способов клетки происходят из репродуктивной ткани субъекта, от которого выделяют образец фолликулярной жидкости. В еще одном варианте осуществления клетки, проанализированные посредством описанных здесь способов, являются соматическими клетками субъекта, от которого выделяют образец фолликулярной жидкости, и исключают любые присутствующие в фолликулярной жидкости половые клетки, как, например, ооциты. Хромосомные аномалии можно идентифицировать с применением любого одного из ряда известных специалисту в данной области способов генетического анализа. Здесь выражение "генетический анализ" относится к любому анализу на основании хромосом, ДНК или РНК, с помощью которого можно определить в клетках индивидуума, или предпочтительно в полученных из фолликулярной жидкости клетках аномалии хромосом, ДНК или экспрессии генов.

Полученные из фолликулярной жидкости клетки также можно подвергать анализу ДНК для идентификации повреждений отдельных генов вместо аномалий хромосомного уровня. Идентификация повреждений отдельных генов, нарушений импринтинга или предрасположенности к злокачественной опухоли можно выполнять с применением любого способа, приемлемого для определения по меньшей мере одной замены нуклеиновой кислоты, например, однонуклеотидного полиморфизма (SNP). Тогда как перечисленные выше способы генетического анализа являются предпочтительными, другие способы, способные использовать клетки из фолликулярной жидкости для идентификации хромосомных аномалий, включающих в себя гонадный мозаицизм или слабовыраженный мозаицизм, находятся в рамках объема настоящего изобретения и известны специалисту в данной области.

Хромосомные аномалии являются общей причиной бесплодия и врожденных пороков развития и включают в себя структурные и количественные аномалии. Организм может иметь мозаицизм при хромосомных аномалиях, обнаруженных только в конкретных клеточных популяциях или линиях в организме, тогда как другие клетки являются нормальными. Наряду с тем, что целостный организм может являться мозаичным, также мозаицизм может быть ограничен конкретными органами или тканями, как, например, гонадный мозаицизм. Гонадный мозаицизм может оставаться необнаруженным из-за преимущественного отсутствия симптомов у пораженных индивидуумов. Однако, если гонадный мозаицизм представляет собой предполагаемую причину бесплодия, существующие способы для идентификации или определения гонадного мозаицизма требуют хирургического вмешательства для забора образца ткани для анализа. Таким образом, существующие аналитические способы являются продолжительными и ограничивают количество клеток, которые можно проанализировать, ограничивая тем самым определение слабо выраженного гонадного мозаицизма.

В настоящем описании изобретения анализируют полученные из фолликулярной жидкости клетки посредством генетического анализа для определения хромосомных аномалий и для диагностики гонадного мозаицизма, например, слабо выраженного гонадного мозаицизма. Например, фолликулярную жидкость выделяют у подверженного сбору ооцитов для оплодотворения in vitro пациента. При данной процедуре содержащую ооциты фолликулярную жидкость отсасывают из яичников пациента с применением, например, трансвагинального ультразвука. В фолликулярной жидкости идентифицируют и удаляют ооциты с окружающими скоплениями клеток, а жидкость затем, как правило, сбрасывают. Следовательно, для уже подверженных извлечению ооцитов пациенток, настоящее описание изобретения не требует дополнительных хирургических вмешательств для обеспечения возможности детекции гонадного мозаицизма.

В предпочтительном варианте осуществления, фолликулярную жидкость собирают при заборе ооцитов для оплодотворения in vitro. Способы фолликулярной аспирации хорошо известны специалисту в области гинекологии и акушерства. Как правило, ооциты извлекают посредством фолликулярной аспирации через 36 часов после индукции овуляции, после чего ооциты с окружающими их клетками удаляют из оставшейся фолликулярной жидкости. Предпочтительным способом получения клеток из оставшейся фолликулярной жидкости является центрифугирование, но можно применять любой известный способ клеточного выделения. Предпочтительно, фолликулярную жидкость центрифугируют в течение любого интервала времени приблизительно от 1 минуты приблизительно до 30 минут, приблизительно от 1000 об/мин до 3000 об/мин и при любой температуре приблизительно от 20°C приблизительно до 40°C. В альтернативном варианте осуществления, фолликулярную жидкость не собирают при извлечении ооцитов для оплодотворения in vitro, например, посредством фолликулярной аспирации или лапароскопии.

После того, как клетки выделены из фолликулярной жидкости, их можно подвергнуть генетическому анализу для детекции хромосомных аномалий. По предпочтительному варианту осуществления, клетки подвергают анализу FISH. Например, клетки подвергают обработке гипотоническим раствором в течение приблизительно от 5 до 45 минут при температуре приблизительно от 20°C приблизительно до 40°C, а затем фиксируют на приемлемой поверхности приемлемым фиксатором, как, например, фиксатор Карнуа, приблизительно от 1°C приблизительно до 25°C. Можно проводить гибридизацию соответствующих зондов с однократно фиксированными клетками образца с применением известных специалисту в данной области способов. Предпочтительно, меченые зонды ДНК для анализируемых хромосом предварительно смешивают с блокирующей ДНК и гибридизационным буфером, а затем вносят к фиксированным клеткам из образца фолликулярной жидкости. Затем зонд и образец подвергают денатурации в течение 5 минут приблизительно при 73°C и инкубируют в темной гибридизационной камере приблизительно при 37°C в течение приблизительно от 16 до 18 часов для обеспечения гибридизации. После гибридизации стекла промывают приблизительно в течение 2 минут приблизительно при 73°C в растворе из 1 мл 20×SSC, 49 мл RO H ₂O и 150 мкл Igepal или другого аналогичного сурфактанта, а затем в течение приблизительно 1 минуты приблизительно при комнатной температуре в растворе из 5 мл 20×SSC, 45 мл RO H₂O и 50 мкл Igepal или другого аналогичного сурфактанта. После отмывки стеклам позволяют высохнуть и докрашивают с применением, предпочтительно, DAPI. После этого клетки можно анализировать с применением флуоресцентного микроскопа. Приблизительно от 20 до 1000 клеток из данного образца фолликулярной жидкости можно анализировать с применением данных предпочтительных способов. Можно выявлять поражающий лишь небольшую часть клеток в яичниках слабо выраженный гонадный мозаицизм, так как подход FISH позволяет анализировать большое количество клеток из отдельного образца фолликулярной жидкости.

В предпочтительных вариантах осуществления клетки, выделенные из фолликулярной жидкости, анализируют на хромосомные аномалии, например, анеуплоидию, как, например, моносомию или трисомию, любой хромосомы можно определять с применением хорошо известных специалисту в данной области способов генетического анализа. В предпочтительных вариантах осуществления клетки, выделенные из фолликулярной жидкости, анализируют для определения анеуплоидии для хромосом 13, 15, 16, 18, 21, 22, X или Y. Хромосомные аномалии можно определять с применением анализа FISH со специфичными для данных хромосом зондами. Сходным образом, обнаружение клеток с моносомией для хромосом 13, 15, 16, 18, 21, 22, X или Y можно выполнять с применением специфичных для данных хромосом зондов. Известно, что моносомия хромосом 15, 16, 21 и 22 вовлечена в прерывание беременности (Munne, S. et al., 2004, Reprod. Biomed. Online, 8: 91-90).

По другим предпочтительным вариантам осуществления, кариотипирование можно применять для анализа хромосомных аномалий в клетках. В предпочтительном способе кариотипирования клетки, полученные из фолликулярной жидкости, сначала культивируют с применением приемлемой культуральной среды. Примеры коммерчески доступных культуральных сред включают в себя Amniomax, среду F10 или Rose Park Memorial Institute medium. Клетки предпочтительно культивируют с применением известных специалисту в данной области стандартных способов при подходящей температуре (например, 37°C) до получения сплошного роста. Затем культивированные клетки предпочтительно собирают с применением обычных способов и фиксируют на соответствующей поверхности приемлемым фиксатором, как, например, фиксатор Карнуа при температуре приблизительно от 1°C приблизительно до 25°C. Бэндинг микропрепаратов выполняют с применением известных обычному специалисту в данной области способов и микропрепараты анализируют на метафазные хромосомы под контролем соответствующего микроскопа. Можно проанализировать приблизительно от 1 до 40 клеток из данного образца фолликулярной жидкости, применяя данные предпочтительные способы.

В других предпочтительных вариантах осуществления применяют сравнительную геномную гибридизацию (CGH) для идентификации хромосомных аномалий, включающих в себя едва различимые хромосомные аномалии. CGH основан на количественной двухцветной FISH, с применением синтезированных из контрольного образца зондов, например, выделенных из фолликулярной жидкости клеток и клеток нормального контрольного референсного образца. Предпочтительно, одновременно проводят гибридизацию зондов с метафазными хромосомами из нормального референсного образца. Сравнение интенсивности сигнала от гибридизованных зондов может показать области патологии в клетках фолликулярной жидкости.

В других вариантах осуществления, сконструированные выше зонды можно наносить на матрицу ДНК в называемом CGH-матрица способе. Показали, что CGH-матрица подтверждает аномалии, как, например, мозаицизм трисомии 20 (Schaeffer et al., Am. J. Hum. Genet., 2004; 74: 1168-1174), несбалансированную транслокацию (Klein et al., Clin. Genet., 2004; 65: 477-82), несбалансированные субтеломерные реаранжировки (Ness et al., Am. J. Med. Genet, 2002, 113: 125-136) и несбалансированные инверсии или хромосомные реаранжировки (Daniely et al., Cytogenet. Cell. Genet., 1999, 86: 51-5). Способы CGH-матриц и получения специфичных для хромосом библиотек ДНК описаны и известны в данной области (Hu, et al., Mol. Hum. Reprod., 2004, 10: 283-289; Bolzer et al., Cytogenet. Cell. Genet., 1999, 84: 233-240). Применение основанного на матрицах CGH для определения генетического мозаицизма в клеточной популяции также показано Mansoor Mohammed в опубликованной заявке на патент США № 20030124584, которая включена сюда в качестве ссылки в полном объеме.

Специалисту в данной области хорошо известны другие способы для анализа хромосомных и генетических аномалий, в качестве не ограничивающих примеров включающие в себя многоцветный бэндинг (MCB), количественную FISH (Q-FISH), полимеразную цепную реакцию (PCR), технологию GBA (минитипирование), мультиплексное секвенирование, SNaPshot, MassEXTEND, MassArray, лигирование на мини-матрицах, мини-секвенирование на микроматрицах, маркерные миниматрицы, удлинение праймеров на матрицах (APEX), удлинение праймеров на микроматрицах, GOOD-анализ, кодированные микросферы, анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (RFLP), аллель-специфический анализ олигонуклеотидов (ASO), специфичную к метилированию ПЦР (MSPCR), способ пиросеквенирования, анализ acycloprime, обратный дот-блот, микроматрицы GeneChip, динамическую аллель-специфическую гибридизацию (DASH), пептидные зонды нуклеиновых кислот (PNA) и запирающие зонды нуклеиновых кислот (LNA), TaqMan, Molecular Beacons, интеркалирующее окрашивание, праймеры FRET, AlphaScreen, SNPstream, Invader assay, управляемое матрицей включение (TDI), флуоресцентную поляризацию, анализ олигонуклеотидного лигирования и выделение кодированных последовательностей, лигазную цепную реакцию, запирающие зонды, амплификацию по типу катящегося кольца и колориметрический анализ олигонуклеотидного лигирования (OLA).

В программах оплодотворения in vitro предимплантационная генетическая диагностика ооцитов и эмбрионов является способом выбора для отделения аномального эмбриона перед пересадкой эмбриона. Таким образом, в альтернативных вариантах осуществления, у субъектов с идентифицированным гонадным мозаицизмом предимплантационную генетическую диагностику и диагностику хромосомных аномалий в ооцитах и эмбрионах можно выполнять для повышения вероятности отбора и имплантации выживающего в продолжение беременности эмбриона.

Наконец, определение хромосомной аномалии, включающей в себя гонадный мозаицизм, применимо у других животных, предпочтительно млекопитающих, и конкретно трансгенных животных. Генетический мозаицизм часто возникает у полученных посредством микроинъекции в пронуклеустрансгенных животных. Успешный способ скрининга родительских животных на гонадный мозаицизм до спаривания может сократить стоимость размножения трансгенных линий и посредством скрининга родительских животных на гонадный мозаицизм до спаривания повысить эффективность получения трансгенных животных для получения трансгенных млекопитающих.

В свете настоящего описания изобретения, описанные и заявленные здесь способы можно разрабатывать и осуществлять без проведения лишней экспериментальной работы. Хотя способы настоящего описания изобретения описаны в границах предпочтительных вариантов осуществления, специалисту в данной области очевидно, что в способы и в стадии или в последовательность стадий описанных здесь способов можно вносить вариации без отклонения от концепции, объема и сущности изобретения. Более конкретно, очевидно, что вместо описанных здесь средств можно использовать определенные химически или физиологически близкие средства, если достигают аналогичных или сходных результатов. Считают, что все очевидные специалисту в данной области подобные аналогичные замены и модификации находятся в пределах сущности, объема и концепции изобретения, как обозначено в прилагаемой формуле изобретения.

Следующие далее примеры включены сюда для иллюстрации предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Специалисту в данной области следует понимать, что в примерах описаны способы, сопровождающие представленные способы, открытые авторами изобретения для правильной работы при применении изобретения, и, таким образом, могут рассматриваться для составления предпочтительных способов его применения. Однако в свете настоящего изобретения специалист в данной области должен понимать, что в определенных вариантах осуществления можно сделать много описанных изменений, и, тем не менее, получить подобный или аналогичный результат без отклонения от объема и сущности изобретения.

Пример 1

1) Забор и обработка клеток из образцов фолликулярной жидкости

Образцы оставшейся фолликулярной жидкости подверженных оплодотворению in vitro пациенток собирают в центрифужные пробирки в аликвотах приблизительно от 5 до 10 мл. Затем образцы центрифугируют приблизительно при 1000 об/мин в течение 10 минут. После этого большую часть супернатанта удаляют, оставляя над осадком приблизительно 0,5 мл жидкости. К осадку добавляют приблизительно 8 мл предварительно нагретого до 37°C 75 мМ KCl, перемешивают, а затем инкубируют при 37°C в течение 20 минут. После инкубации пробирки центрифугируют приблизительно при 1000 об/мин в течение 10 минут. После этого супернатант сбрасывают, оставляя над осадком приблизительно 0,5 мл жидкости. При постоянном перемешивании добавляют приблизительно 8 мл холодного фиксатора Карнуа. Пробирки инкубируют при 2-8°C в течение по меньшей мере 30 минут, а затем центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут. После центрифугирования супернатант сбрасывают, оставляя над осадком приблизительно 0,5 мл жидкости. Стадию отмывки с фиксатором повторяют 2 раза.

2) Подготовка микропрепарата и анализ FISH

На задней стороне чистых стекол алмазным маркером отмечают один или два небольших квадрата. В каждый квадрат добавляют 10 мкл фиксированных клеток и оставляют стекла сохнуть на воздухе. Стекла последовательно обезвоживают в спирте: 70% одну минуту; 85% одну минуту; 100% две минуты. После этого покровные стекла обрезают до размера области образца и наносят на покровное стекло 1-2 мкл зонда. Стекло переворачивают на покровное стекло и заклеивают каучуковым клеем. Затем стекло подвергают денатурации, помещая его на подогревательный столик при 73°C в течение пяти минут. После этого стекла немедленно помещают в гибридизационную камеру и инкубируют при 37°C в течение времени от 16 до 18 часов. После инкубации покровные стекла снимают в 5 мл 20×SSC и 45 мл RO H₂O. Затем стекло отмывают в 1 мл 20×SSC и 49 мл RO H₂ O и 150 мкл Igepal (Sigma) в течение двух минут, с последующей еще одной отмывкой в растворе 5 мл 20×SSC, 45 мл H₂ O и 50 мкл Igepal в течение одной минуты. Стекло сушат на воздухе и заключают в 10 мкл заключающей среды (200 нг/мл DAPI в Vectashield, Vector Lab) и накладывают покровное стекло. Стекло заклеивают каучуковым клеем и изучают под контролем флуоресцентного микроскопа.

3) Зонды для анализа FISH

Для определения гонадного мозаицизма для хромосом 18, X и Y применяют смесь зондов, содержащую CEP 18 Spectrum Aqua/X Spectrum Green/Y Spectrum Orange (AneuVysion EC DNA probe kit, Vysis). Также можно раздельно применять отдельные зонды для 18, X и Y хромосом, несмотря на то, что авторы применяли в виде смеси.

Таблица 1
Серийн. №	№ образца	Один яичник	Состояние оплодотворе-ния
№ проанализиро-ванных клеток	Норма для X&18 (%)	Х хр. аном. %	хр. 18 аном. %
1	FF-001	100	100	0	0	-
2	FF-002	100	96	2	2	-
3	FF-003	200	90	10	0	-
4	FF-004	100	100	0	0	-
5	FF-005	100	100	0	0	-
6	FF-006	100	100	0	0	+
7	FF-007	100	100	0	0	+
8	FF-008	100	100	0	0	-
9	FF-009	100	95	2	3	-
10	FF-010	100	95	5	0	-
11	FF-011	100	92	3	5	-
12	FF-012	100	100	0	0	-
13	FF-013	100	100	0	0	+/потеря (прерывание беременности)
14	FF-014	100	96	2	2	+
15	FF-015	100	100	0	0	-
16	FF-016	100	90	4	6	-
17	FF-017	100	100	0	0	-
18	FF-018	100	100	0	0	-
19	FF-019	100	97	1	2	-
20	FF-020	100	100	0	0	+
21	FF-021	100	100	0	0	-
22	FF-022	100	98	1	1	-
23	FF-023	100	100	0	0	-
24	FF-024	100	100	0	0	-
25	FF-025	100	100	0	0	+/потеря (прерывание беременности)
26	FF-026	200	96	3	0	-
27	FF-027	200	99	1	0	+
28	FF-028	200	94	5	1	+
29	FF-029	200	97	0	3	-
30	FF-030	200	95	3	2	-
31	FF-031	200	97	1	2	-
32	FF-032	100	96	3	1	-
33	FF-033	100	96	1	3	-
34	FF-034	100	100	0	0	+
35	FF-035	100	98	2	0	-

36	FF-036	100	100	0	0	-
37	FF-037	30	28	2	0	-
38	FF-038	100	100	0	0	+
39	FF-039	100	98	1	1	-
40	FF-040	100	100	0	0	-
41	FF-041	100	96	2	2	-
42	FF-042	100	100	0	0	+
43	FF-043	100	100	0	0	-
44	FF-044	100	100	0	0	+/потеря (прерывание беременности)
45	FF-045	100	98	2	0	+
46	FF-046	100	100	0	0	+
47	FF-047	200	92	6	2	-
48	FF-048	100	97	1	2	+
49	FF-049	200	96	3	1	-
50	FF-050	200	95	3	2	-
51	FF-051	200	99	1	0	-
52	FF-052	100	96	1	3	+
53	FF-053	200	97	2	1	-
54	FF-054	100	100	0	0	-
55	FF-055	100	100	0	0
56	FF-056	200	96	3	1	+
57	FF-057	200	99	1	0	-
58	FF-058	200	94	5	1	-
59	FF-059	200	97	0	3	+
60	FF-060	200	95	3	2	+
61	FF-061	200	97	1	2	-
62	FF-062	200	96	3	1	+
63	FF-063	200	99	1	0	+
64	FF-064	200	94	1	5	-
65	FF-065	200	97	0	3	-
66	FF-066	100	89	10	1	-
67	FF-067	200	95	3	2	-
68	FF-068	200	97	1	2	-
69	FF-069	100	100	0	0	+/потеря (прерывание беременности)
70	FF-070	100	95	3	2	-
71	FF-071	100	100	0	0	-
72	FF-072	100	99	1	0	-
73	FF-073	100	92	5	2	-
74	FF-074	200	93	5	2	-

75	FF-075	200	95	5	0	-
76	FF-076	200	95	5	0	-
77	FF-077	200	90	8	2	-
78	FF-078	200	93	5	2	-
79	FF-079	200	93	6	1	-
80	FF-080	100	89	11	0	-
81	FF-081	100	97	3	0	+
82	FF-082	100	98	2	0	+
83	FF-083	100	95	5	0	-
84	FF-084	100	100	0	0	-
85	FF-085	100	93	5	2	+/потеря (прерывание беременности)
86	FF-086	100	100	0	0	-
87	FF-087	100	100	0	0	+
88	FF-088	100	99	1	0	-
89	FF-089	100	98	2	0	-
90	FF-090	100	100	0	0	-
91	FF-091	100	100	0	0	-
92	FF-092	100	97	3	0	-
93	FF-093	100	98	1	1	+
94	FF-094	100	100	0	0	+
95	FF-095	100	92	6	2	+/потеря (прерывание беременности)
96	FF-096	100	100	0	0	+
97	FF-097	100	93	5	2	+/потеря (прерывание беременности)
98	FF-098	100	99	1	0	-
99	FF-099	100	100	0	0	-
100	FF-100	Отсутствие клетки				-
101	FF-101	100	99	1	0	+
102	FF-102	Отсутствие клетки				-
103	FF-103	100	97	3	0	+
104	FF-104	100	100	0	0	-
105	FF-105	Отсутствие клетки				-
106	FF-106	100	100	0	0	+
107	FF-107	100	100	0	0	-
108	FF-108	100	100	0	0	+
109	FF-109	100	92	6	2	-
110	FF-110	100	100	0	0	+
111	FF-111	100	90	9	1	-
112	FF-112	100	100	0	0	-

113	FF-113	100	100	0	0	-
114	FF-114	Отсутствие клетки				+
115	FF-115	300	100	0	0	+
116	FF-116	Отсутствие клеток				-
117	FF-117	200	94	1	5	-
118	FF-118	200	97	1	2	-
119	FF-119	Отсутствие клеток				-
120	FF-120	100	96	2	2	+
121	FF-121	200	98	1	1	-
122	FF-122	100	100	0	0	-
123	FF-123	100	95	3	2	-
124	FF-124	200	93	3	4	-
125	FF-125	200	96	1	3	-
126	FF-126	100	92	3	5	-
127	FF-127	100	100	0	0	-
128	FF-128	200	87	12	1	-
129	FF-129	200	97	3	0	-
130	FF-130	100	100	0	0	-
131	FF-131	200	98	0	2	-
132	FF-132	200	92	1	7	-
133	FF-133	200	95	2	3	-
134	FF-134	200	96	1	3	+
135	FF-135	200	94	2	4	+
136	FF-136	200	98	2	0	-
137	FF-137	200	98	2	0	-
138	FF-138	200	99	1	0	-
139	FF-139	200	98	2	0	-
140	FF-140	200	100	0	0	+
141	FF-141	100	93	4	3	+/потеря (прерывание беременности)
142	FF-142	100	96	4	0	-
143	FF-143	100	98	2	0	+
144	FF-144	200	97	2	1	-
145	FF-145	100	100	0	0	+
146	FF-146	100	92	4	4	-
147	FF-147	200	96	1	3	-
148	FF-148	200	94	2	4	+
149	FF-149	200	98	2	0	+
150	FF-150	200	98	2	0	-
151	FF-151	200	99	1	0	-
152	FF-152	200	98	2	0	-

153	FF-153	100	93	4	3	+
154	FF-154	100	100	0	0	-
155	FF-155	Отсутствие клетки				+
156	FF-156	200	92	6	2	+/потеря (прерывание беременности)
157	FF-157	100	97	1	2	-
158	FF-158	200	96	3	1	-
159	FF-159	200	95	3	2	-
160	FF-160	200	99	1	0	-
161	FF-161	100	96	1	3	+
162	FF-162	200	97	2	1	+
163	FF-163	Отсутствие клетки				-
164	FF-164	200	96	3	1	+
165	FF-165	200	95	1	4	+
166	FF-166	200	97	3	0	-
167	FF-167	200	98	2	0	-
168	FF-168	200	94	5	1	-
169	FF-169	200	95	2	3	-
170	FF-170	200	96	3	0	-
171	FF-171	200	99	1	0	-
172	FF-172	200	94	5	1	+/потеря (прерывание беременности)
173	FF-173	200	97	0	3
174	FF-174	200	95	3	2	-
175	FF-175	200	97	1	2	-
176	FF-176	Отсутствие клетки				-
177	FF-177	200	98	1	1	+/потеря (прерывание беременности)
178	FF-178	100	97	3	0	-
179	FF-179	200	94	2	4	-
180	FF-180	200	98	2	0	+
181	FF-181	200	98	2	0	-
182	FF-182	200	99	1	0	-
183	FF-183	100	96	2	2	-
184	FF-184	200	97	3	0	+/потеря (прерывание беременности)
185	FF-185	Отсутствие клетки				+
186	FF-186	200	92	6	2	-
187	FF-187	200	92	1	7	+
188	FF-188	200	95	2	3	+
189	FF-189	200	96	1	3	+/потеря (прерывание беременности)

190	FF-190	200	94	2	4	-
191	FF-191	200	98	2	0	+/потеря (прерывание беременности)
192	FF-192	200	98	2	0	-
193	FF-193	200	99	1	0	-
194	FF-194	200	98	2	0	+
195	FF-195	Отсутствие клетки				-
196	FF-196	200	97	3	0	-
197	FF-197	200	95	1	4	-
198	FF-198	100	97	0	3	+
199	FF-199	200	96	1	3	+
200	FF-200	200	99	1	0	+
201	FF-201	200	94	1	5	+
202	FF-202	200	98	1	1	-
203	FF-203	200	100	0	0	-
204	FF-204	200	98	2	0	-
205	FF-205	100	97	1	2	+/потеря (прерывание беременности)
206	FF-206	200	94	2	4	-
207	FF-207	100	95	5	0	-
208	FF-208	200	98	2	0	+
209	FF-209	200	98	2	0	-
210	FF-210	200	99	1	0	-
211	FF-211	100	95	3	2	-
212	FF-212	100	97	3	0	-
213	FF-213	100	98	2	0	-
214	FF-214	100	99	1	0	-
215	FF-215	200	92	6	2	-
216	FF-216	100	100	0	0	+
217	FF-217	100	98	1	1	-
218	FF-218	100	97	2	1	+
219	FF-219	100	97	2	1	+
220	FF-220	100	97	2	1	-
221	FF-221	100	100	0	0	+
222	FF-222	100	97	2	1	+
223	FF-223	100	97	3	0	+
224	FF-224	200	98	2	0	-
225	FF-225	100	94	5	1	-
226	FF-226	100	91	5	4	-
227	FF-227	Отсутствие клеток				-
228	FF-228	100	93	6	1	-

229	FF-229	100	98	2	0	-
230	FF-230	100	89	9	2	+
231	FF-231	Отсутствие клетки				-
232	FF-232	100	96	1	3	+
233	FF-233	100	98	2	0	-
234	FF-234	100	98	2	0	+
235	FF-235	100	97	3	0	-
236	FF-236	100	98	2	0	-
237	FF-237	100	98	2	0	+
238	FF-238	100	100	0	0	-
239	FF-239	100	98	1	1	-
240	FF-240	100	96	3	1	-
241	FF-241	100	98	2	0	+
242	FF-242	100	99	1	0	-
243	FF-243	100	96	3	1	+
244	FF-244	200	97	3	0	-
245	FF-245	100	98	2	0	-
246	FF-246	100	94	6	0	+/потеря (прерывание беременности)
247	FF-247	200	95	3	2	+
248	FF-248	100	100	0	0	+
249	FF-249	100	96	3	1	-
250	FF-250	200	97	3	0	-
251	FF-251	100	98	2	0	+
252	FF-252	200	95	3	2	+
253	FF-253	100	98	2	0	-
254	FF-254	200	97	2	1	-
255	FF-255	100	95	5	0	-
256	FF-256	100	100	0	0	-
257	FF-257	100	96	3	1	-
258	FF-258	200	97	3	0	+/потеря (прерывание беременности)
259	FF-259	100	98	2	0	+
260	FF-260	200	95	3	2	-
261	FF-261	Отсутствие клетки				-
262	FF-262	100	100	0	0	+
263	FF-263	100	100	0	0	+
264	FF-264	100	100	0	0	-
265	FF-265	100	100	0	0	-
266	FF-266	100	98	2	0	-

267	FF-267	100	98	1	1	+/потеря (прерывание беременности)
268	FF-268	100	100	0	0	-
269	FF-269	100	100	0	0	-
270	FF-270	100	98	2	0	-
271	FF-271	200	92	6	2	-
272	FF-272	100	97	2	1	-
273	FF-273	100	100	0	0	+
274	FF-274	100	97	2	1	-
275	FF-275	100	90	8	2	-
276	FF-276	100	97	1	2	-
277	FF-277	100	96	4	0	-
278	FF-278	100	96	2	2	-
279	FF-279	100	97	3	0	-
280	FF-280	100	100	0	0	+
281	FF-281	100	99	0	1	+/потеря (прерывание беременности)
282	FF-282	100	99	0	1	-
283	FF-283	100	97	2	1	-
284	FF-284	100	95	3	2	+
285	FF-285	100	95	2	3	-
286	FF-286	100	98	2	0	-
287	FF-287	100	98	2	0	-
288	FF-288	100	95	2	3	-
289	FF-289	100	98	2	0	-
290	FF-290	100	97	3	0	-
291	FF-291	100	100	0	0	-
292	FF-292	100	99	0	1	-
293	FF-293	100	97	2	1	+
294	FF-294	100	100	0	0	+
295	FF-295	100	97	2	1	+
296	FF-296	100	97	3	0	+
297	FF-297	100	93	4	3	-
298	FF-298	100	96	4	0	+
299	FF-299	100	96	3	1	-
300	FF-300	100	92	4	4	-
301	FF-301	200	98	2	0	-
302	FF-302	100	100	0	0	+
303	FF-303	100	100	0	0	-
304	FF-304	100	100	0	0	+
305	FF-305	100	98	2	0	+

306	FF-306	100	92	6	2	-
307	FF-307	100	98	1	1	+
308	FF-308	100	98	1	1	-
309	FF-309	100	95	4	1	-
310	FF-310	100	98	1	1	-
311	FF-311	100	95	4	1	-
312	FF-312	100	100	0	0	+
313	FF-313	100	98	2	0	-
314	FF-314	100	95	3	2	-
315	FF-315	200	95	3	2	+
316	FF-316	100	100	0	0	-
317	FF-317	100	100	0	0	-
318	FF-318	100	93	5	2	-
319	FF-319	100	99	1	0	+
320	FF-320	100	98	1	1	-
321	FF-321	100	95	4	1	+
322	FF-322	100	100	0	0	+
323	FF-323	100	96	3	1	-
324	FF-324	Отсутствие клетки				-
325	FF-325	100	98	1	1	-
326	FF-326	100	95	4	1	+
327	FF-327	100	100	0	0	+/потеря (прерывание беременности)
328	FF-328	100	100	0	0	+
329	FF-329	100	95	2	3	+
330	FF-330	100	97	1	2	-
331	FF-331	100	100	0	0	+
332	FF-332	100	100	0	0	+/потеря (прерывание беременности)
333	FF-333	100	96	1	3	+
334	FF-334	100	94	3	3	-
335	FF-335	100	100	0	0	-
336	FF-336	100	99	1	0	-
337	FF-337	100	96	2	2	-
338	FF-338	100	96	3	1	+/потеря (прерывание беременности)
339	FF-339	100	100	0	0	-
340	FF-340	100	100	0	0	-
341	FF-341	100	100	0	0	+
342	FF-342	100	100	0	0	-
343	FF-343	100	95	3	2	-

344	FF-344	100	100	0	0	+
345	FF-345	100	100	0	0	+
346	FF-346	100	98	1	1	-
347	FF-347	100	95	4	1	-
348	FF-348	100	95	3	2	-
349	FF-349	100	96	2	2	+
350	FF-350	100	96	3	1	+
351	FF-351	100	100	0	0	-
352	FF-352	100	100	0	0	+
353	FF-353	100	100	0	0	+
354	FF-354	100	100	0	0	+
355	FF-355	100	100	0	0	-
356	FF-356	100	94	5	1	-
357	FF-357	100	99	1	0	+
358	FF-358	100	98	1	1	-
359	FF-359	100	99	0	1	-
360	FF-360	100	99	0	1	-
361	FF-361	100	97	2	1	-
362	FF-362	100	95	3	2	-
363	FF-363	100	95	2	3	-
364	FF-364	100	98	2	0	-
365	FF-365	100	98	2	0	-
366	FF-366	Отсутствие клетки				-
367	FF-367	100	98	2	0	-
368	FF-368	Отсутствие клетки				-
369	FF-369	100	100	0	0	-
370	FF-370	100	99	1	0	-
371	FF-371	100	98	2	0	-
372	FF-372	100	96	4	0	~
373	FF-373	200	88	0	12	-
374	FF-374	100	98	2	0	+
375	FF-375	100	99	1	0	-
376	FF-376	100	93	7	0	+
377	FF-377	100	91	5	4	-
378	FF-378	100	100	0	0	+
379	FF-379	100	95	3	2	-
380	FF-380	100	100	0	0	-
381	FF-381	100	99	1	0	-
382	FF-382	100	97	3	0	-
383	FF-383	100	98	2	0	+
384	FF-384	100	97	1	2	-

385	FF-385	100	95	3	2	-
386	FF-386	100	96	3	1	-
387	FF-387	100	96	1	3	+
388	FF-388	100	100	0	0	+/потеря (прерывание беременности)
389	FF-389	100	98	2	0	-
390	FF-390	100	95	2	3	+
391	FF-391	30	28	2	0	+
392	FF-392	100	100	0	0	-
393	FF-393	100	100	0	0	-
394	FF-394	100	100	0	0	-
395	FF-395	100	100	0	0	-
396	FF-396	100	98	2	0	-
397	FF-397	100	98	2	0	-
398	FF-398	100	98	1	1	-
399	FF-399	100	94	4	2	-
400	FF-400	Отсутствие клетки				-
401	FF-401	100	100	0	0	-
402	FF-402	100	97	1	2	+
403	FF-403	100	100	0	0	-
404	FF-404	100	100	0	0	-
405	FF-405	Отсутствие клеток				-
406	FF-406	100	96	0	4	+
407	FF-407	100	100	0	0	-
408	FF-408	100	100	0	0	-
409	FF-409	100	100	0	0	-
410	FF-410	100	98	2	0	+/потеря (прерывание беременности)
411	FF-411	100	100	0	0	+/потеря (прерывание беременности)
412	FF-412	100	98	0	2	-
413	FF-413	100	98	2	0	+
414	FF-414	100	94	6	0	+/потеря (прерывание беременности)
415	FF-415	100	97	3	0	-
416	FF-416	100	94	2	4	-
417	FF-417	100	95	3	2	-
418	FF-418	100	100	0	0	-
419	FF-419	100	100	0	0	-
420	FF-420	100	98	2	0	-
421	FF-421	100	100	0	0	+

422	FF-422	100	100	0	0	-
423	FF-423	100	98	2	0	-
424	FF-424	100	98	0	2	+
425	FF-425	100	98	2	0	-
426	FF-426	100	100	0	0	-
427	FF-427	100	95	3	2	+/потеря (прерывание беременности)
428	FF-428	200	94	5	1	-
429	FF-429	200	97	0	3	-
430	FF-430	200	95	3	2	-
431	FF-431	200	97	1	2	-
432	FF-432	100	96	3	1	+
433	FF-433	100	96	1	3	-
434	FF-434	100	100	0	0	-
435	FF-435	100	100	0	0	+
436	FF-436	100	100	0	0	-
437	FF-437	100	100	0	0	-
438	FF-438	100	94	3	3	-
439	FF-439	100	95	3	2	-
440	FF-440	100	94	2	4	+
441	FF-441	100	100	0	0	-
442	FF-442	100	98	0	2	-
443	FF-443	100	98	2	0	-
444	FF-444	100	100	0	0	-
445	FF-445	100	95	3	2	-
446	FF-446	200	94	5	1	-
447	FF-447	200	95	3	2	+
448	FF-448	200	95	3	2	+
449	FF-449	200	97	1	2	+
450	FF-450	100	96	3	1	-
451	FF-451	100	96	1	3	+
452	FF-452	100	94	2	4	-
453	FF-453	100	100	0	0	-
454	FF-454	200	97	0	3	+
455	FF-455	200	95	3	2	+
456	FF-456	100	93	4	3	+
457	FF-457	100	100	0	0	+
458	FF-458	100	98	2	0	-
459	FF-459	100	100	0	0	-
460	FF-460	100	95	3	2	-
461	FF-461	200	94	5	1	+

462	FF-462	200	97	0	3	-
463	FF-463	200	95	3	2	-
464	FF-464	200	97	0	3	-
465	FF-465	200	95	3	2	+/потеря (прерывание беременности)
466	FF-466	100	100	0	0	-
467	FF-467	100	100	0	0	+
468	FF-468	100	98	0	2	-
469	FF-469	100	98	2	0	+
470	FF-470	100	100	0	0	+
471	FF-471	100	95	3	2	-
472	FF-472	100	96	1	3	-
473	FF-473	100	95	3	2	-
474	FF-474	100	98	1	1	-
475	FF-475	100	94	0	6	-
476	FF-476	100	95	3	2	+
477	FF-477	100	95	3	2	-
478	FF-478	100	98	1	1	+

На фигурах 1-5 показаны клетки, выбранные из указанных выше образцов, проанализированные посредством FISH. На фигуре 1 показана микрофотография анализа FISH одной из клеток с нормальным состоянием хромосом 18 и X, полученных из фолликулярной жидкости в исследуемом образце FF-205. На фигуре 2 показана микрофотография анализа FISH одной из клеток с моносомией 18, полученных из фолликулярной жидкости в исследуемом образце FF-070. На фигуре 3 показана микрофотография анализа FISH одной из клеток с моносомией X, полученных из фолликулярной жидкости в исследуемом образце FF-097. На фигуре 4 показана микрофотография анализа FISH одной из клеток с трисомией 18, полученных из фолликулярной жидкости в исследуемом образце FF-200. На фигуре 5 показана микрофотография анализа FISH одной из клеток с трисомией X, полученных из фолликулярной жидкости в исследуемом образце FF-318.

Представленные в таблице 1 данные обобщены в таблице 2:

Таблица 2
	№ случаев
Количество проанализированных для каждого яичника образцов	478
Непригодные клетки для анализа	19
Общее количество проанализированных образцов	459
Общее количество нормальных пациенток по диплоидной хромосоме X после анализа FISH	415
Анеуплоидию для хромосомы X обнаружили в 5% клеток из выделенной фолликулярной жидкости	44 (9,58%)

Далее в таблице 3 показан ретроспективный анализ в состоянии беременности или выкидыша у пациенток с нормальными хромосомами X или аномальной X-хромосомной анеуплоидией, определяемыми посредством FISH:

Таблица 3
	Пациентки с X-хромосомной анеуплоидией в фолликулярной жидкости (44)	Пациентки с нормальным состоянием X-хромосом в фолликулярной жидкости (415)
№ пациенток с беременностью	11/44 (25%)	148/415 (35,66%)
№ пациенток с прерыванием беременности	7/11 (63,63%)	21/148 (14,19%)

Из проанализированных для каждого яичника 478 образцов фолликулярной жидкости в 19 случаях не получили клетки, необходимые для анализа. Результаты FISH на клетках фолликулярной жидкости в остальных 459 случаях показаны в таблице 1. В лаборатории авторов изобретения полагают, что 1-4% анеуплоидных клеток представляют собой нормальную величину. Это также обнаружили в других лабораториях (Vysis AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit (Part Number 32-161075 & 33-161075 & 35-161075) листок-вкладыш, таблица 4, прикрепленная сюда как приложение A и включенная сюда в качестве ссылки). Из проанализированных посредством FISH образцов, у 415 пациенток показан нормальный профиль хромосомы X, в то же время у 44 пациенток показан мозаичный профиль фолликулярной жидкости ( 5% анеуплоидии хромосомы X). У индивидуумов с обнаруженной мозаичной анеуплоидией хромосомы X также выполняли кариотипирование и анализ FISH на образцах крови. У восемнадцати из этих 44 (40,9%) пациенток в крови так же выявили слабо выраженный мозаицизм ( 5% анеуплоидии) хромосомы X, подтверждая результаты фолликулярной жидкости. Остальные 26 пациенток при анализе крови являлись нормальными по анеуплоидии хромосомы X, давая возможность предположить, что мозаицизм у этих 26 пациенток может быть ограничен гонадами (гонадный мозаицизм).

При дополнительном анализе авторы обнаружили, что 11 из 44 пациенток (25%) с определенной посредством FISH анеуплоидией являлись беременными. В то же время являлись беременными 148 из 415 пациенток (35,66%) с нормальной фолликулярной жидкостью по результатам FISH. Таким образом, соотношение беременных среди пациенток с определенной в клетках фолликулярной жидкости анеуплоидией является меньшим, чем соотношение для пациенток с нормальной фолликулярной жидкостью по результатам FISH. Это подтверждает, что гонадный мозаицизм коррелирует со сниженными коэффициентами фертильности среди использующих оплодотворение in vitro с целью забеременеть женщин. Кроме того, из 11 забеременевших пациенток с анеуплоидией хромосомы X, у 7 пациенток произошло прерывание беременности (63,63%). С другой стороны, из 148 забеременевших пациенток с нормальной фолликулярной жидкостью по результатам FISH, только у 21 пациентки произошло прерывание беременности (14,19%), что коррелирует с нормальным соотношением прерывания беременностей в общей популяции. Это подтверждает, что гонадный мозаицизм для анеуплоидии хромосомы X коррелирует с повышенным риском прерывания беременности.

Пример 2

Идентификация гонадного мозаицизма в отношении аномалий хромосом 13 и 21 посредством FISH с применением клеток из фолликулярной жидкости из каждого яичника.

Клетки и стекла обрабатывают, как указано в примере 1. Однако образцы фолликулярной жидкости получали от пациенток с анамнезом пораженных трисомией 13 или 21 детей. Самим пациенткам посредством анализа крови также ставили диагноз наличия мозаичного профиля анеуплоидии для 13 или 21 хромосом. Применяют специфичные для хромосомы 13 (LSI 13 Spectrum Green) и 21 (LSI 21 Spectrum Orange) зонды (AneuVysion EC DNA probe kit, Vysis). Результаты данных исследований показаны далее в таблице 4:

Таблица 4
сер. №	№ образца	Идентификация аномалий хромосом 13 и 21 на клетках, полученных из фолликулярной жидкости из каждого яичника	состояние оплодотворения
№ проанализир. клеток	Норма для 13 & 21 (%)	аном. хр. 13 %	аном. хр. 21 %
1	FF-A01	200	92	8	0	+
2	FF-A02	200	94	6	0	-
3	FF-A03	200	99	0	1	-

4	FF-A04	200	91	1	8	+
5	FF-A05	200	88	2	10	-
6	FF-A06	200	96	2	2	-
7	FF-A07	200	97	1	2	-
8	FF-A08	200	92	3	5	-
9	FF-A09	200	99	1	0	-
10	FF-A10	200	93	3	4	+

На фигурах 6-8 показаны клетки, выбранные из указанных выше образцов, проанализированные посредством FISH. На фигуре 6 показана микрофотография анализа FISH одной из клеток с нормальным состоянием хромосом 13 и 21, полученных из фолликулярной жидкости в исследуемом образце FF-A01. На фигуре 7 показана микрофотография анализа FISH одной из клеток с трисомией 13, полученных из фолликулярной жидкости в исследуемом образце FF-A03. На фигуре 8 показана микрофотография анализа FISH одной из клеток с трисомией 21, полученных из фолликулярной жидкости в исследуемом образце FF-A053.

Пример 3

Идентификация гонадного мозаицизма в отношении аномалий хромосом 18, X и Y посредством FISH, с применением клеток из полученной из обоих яичников индивидуума фолликулярной жидкости.

Данный эксперимент проводили в тех же условиях, что и для примера 1, за исключением того, что клеточный образец фолликулярной жидкости получали из обоих яичников, а не из каждого из яичников, как в примере 1. Результаты данных исследований показаны далее в таблице 5:

Таблица 5

сер. №	№ образца	Левый	Правый	Состояние оплодотво-рения
№ проанали-зирован-ных клеток	Норма для X&18 (%)	Х хр. аном. %	аном. хр. 18 (%)	№ проанализированных клеток	Норма для X&18 (%)	Х хр. аном. (%)	аном. хр. 18 (%)
1	FF-479	100	92	6	2	100	86	8	2	-
2	FF-480	100	92	6	2	100	91	5	4	-
3	FF-481	100	100	0	0	100	100	0	0	-
4	FF-482	100	97	3	0	100	100	0	0	-
5	FF-483	100	100	0	0	100	100	0	0	-
6	FF-484	100	100	0	0	100	98	2	0	+
7	FF-485	100	98	2	0	100	100	0	0	-
8	FF-486	100	95	4	0	100	98	0	2	-
9	FF-487	100	94	3	3	100	98	2	0	-
10	FF-488	100	94	5	1	100	93	4	3	-
11	FF-489	100	94	0	6	100	97	0	3	+
12	FF-490	100	99	0	1	100	94	6	0	+
13	FF-491	50	96	2	2	100	97	3	0	-
14	FF-492	100	82	14	4	100	92	6	2	+/потеря (прерывание беременности)
15	FF-493	100	97	0	3	100	95	3	2	-
16	FF-494	100	100	0	0	100	98	2	0	-
17	FF-495	100	100	0	0	100	91	5	4	-
18	FF-496	100	95	5	0	100	95	5	0	-
19	FF-497	100	96	1	4	100	96	2	2	+
20	FF-498	100	96	4	0	100	98	1	1	-
21	FF-499	100	100	0	0	100	94	4	2	-
22	FF-500	100	94	3	3	100	93	2	5	+
23	FF-501	100	95	3	2	100	97	0	3	-
24	FF-502	100	97	0	3	100	97	0	3	-
25	FF-503	100	100	0	0	100	97	3	1	+
26	FF-504	100	95	2	3	100	93	3	4	-
27	FF-505	100	96	4	0	100	97	0	3	+
28	FF-506	100	92	2	6	100	95	1	4	-
29	FF-507	100	95	3	2	100	94	2	4	-
30	FF-508	100	100	0	0	100	94	4	2	-
31	FF-509	100	97	0	3	100	94	4	2	+
32	FF-510	100	96	2	3	100	95	1	4	-
33	FF-511	100	96	2	2	100	98	2	0	+
34	FF-512	100	99	1	0	100	100	0	0	-
35	FF-513	100	94	5	2	100	95	5	0	-
36	FF-514	100	96	0	4	100	93	3	4	+/потеря (прерывание беременности)

37	FF-515	100	97	3	0	100	98	0	2	+
38	FF-516	100	97	1	2	100	96	2	2	-
39	FF-517	100	97	1	2	100	98	2	0	-
40	FF-518	100	98	0	2	100	97	3	0	-
41	FF-519	100	97	2	1	100	96	4	2	-
42	FF-520	100	93	2	5	100	99	0	1	-
43	FF-521	100	90	5	5	100	94	5	2	+
44	FF-522	100	98	1	1	100	97	2	1	-
45	FF-523	100	95	3	2	100	95	2	3	-
46	FF-524	100	91	3	6	100	93	5	2	+/потеря (прерывание беременности)
47	FF-525	100	95	3	2	100	93	2	5	-
48	FF-526	100	100	0	0	100	94	2	4	-
49	FF-527	100	97	2	1	100	98	1	1	+/потеря (прерывание беременности)
50	FF-528	100	95	2	3	100	86	7	7	-
51	FF-529	100	100	0	0	100	100	0	0	-
52	FF-530	100	93	2	3	100	100	0	0	-
53	FF-531	100	96	3	1	100	94	2	5	+/потеря (прерывание беременности)
54	FF-532	100	97	2	1	100	94	2	4	+
55	FF-533	100	100	0	0	100	100	0	0	-
56	FF-534	100	95	3	2	100	93	3	4	-
57	FF-535	100	100	0	0	100	100	0	0	-
58	FF-536	100	93	5	2	100	95	5	0	-
59	FF-537	100	93	1	5	100	90	3	7	-
60	FF-538	100	97	1	2	100	92	2	6	+
61	FF-539	100	98	0	2	100	94	0	6	-
62	FF-540	100	98	0	2	100	94	4	2	-
63	FF-541	100	96	2	2	100	95	1	4	-
64	FF-542	100	96	2	2	100	96	2	2	-
65	FF-543	100	87	6	7	100	92	3	5	-
66	FF-544	100	93	3	4	100	94	2	4	+
67	FF-545	100	95	3	2	100	91	5	4	+/ прерывание беременности)
68	FF-546	100	94	2	4	100	93	3	4	+
69	FF-547	100	97	0	3	100	96	2	2	-
70	FF-548	100	97	1	2	100	100	0	0	+
71	FF-549	100	93	4	3	100	96	2	2	-
72	FF-550	100	92	3	5	100	91	4	5	-
73	FF-551	100	95	1	4	100	97	2	3	-
74	FF-552	100	89	2	9	100	93	2	5	-

75	FF-553	100	96	2	2	100	94	2	5	-
76	FF-554	100	96	1	3	100	98	1	1	-
77	FF-555	100	96	0	4	100	95	1	4	-
78	FF-556	100	91	4	5	100	94	0	6	+
79	FF-557	100	93	3	4	100	95	2	3	-
80	FF-558	100	94	2	4	100	94	2	4	-
81	FF-559	100	86	6	8	100	83	8	9	-

Данные из таблицы 5 обобщили и проанализировали, а результаты показаны далее в таблице 6:

Таблица 6
	№ случаев
Количество проанализированных для обоих яичников образцов	81
Непригодные для анализа клетки	0
Общее количество проанализированных образцов	81
Общее количество пациенток, нормальных в отношении X-хромосомной аномалии, согласно анализу FISH	67
Анеуплоидия по хромосоме X 5% в фолликулярной жидкости в каждом яичнике	06
Анеуплоидия по хромосоме X 5% в фолликулярной жидкости в обоих яичниках	08

Далее в таблице 7 показан ретроспективный анализ в состоянии беременности или выкидыша у нормальных пациенток по сравнению с пациентками с определяемой посредством FISH X-хромосомной анеуплоидией:

Таблица 7
	Пациентки с X-хромосомной анеуплоидией в фолликулярной жидкости в обоих яичниках	Пациентки с X-хромосомной анеуплоидией в фолликулярной жидкости в любом яичнике	Пациентки с нормальным состоянием X-хромосом в фолликулярной жидкости
№ пациенток с беременностью	2/8 (25%)	2/6 (33,33%)	16/67 (23,88%)
№ пациенток с прерыванием беременности	2/2 (100%)	1/2 (50%)	3/16 (18,75%)

Из 81 проанализированного образца фолликулярной жидкости, 67 образцов не показали X-хромосомной аномалии ( 5% анеуплоидных клеток; таблица 6). В образцах из одного яичника анеуплоидию обнаружили только для 6 из оставшихся 14 случаев, тогда как в образцах фолликулярной жидкости из обоих яичников анеуплоидию обнаружили в других 8 случаях (таблица 6).

При ретроспективном анализе 2 из 8 пациенток с X-хромосомной анеуплоидией в обоих яичниках являлись беременными, но у обеих произошло прерывание беременности. Две из 6 пациенток с X-хромосомной анеуплоидией в каждом из двух проанализированных яичников являлись беременными, у одной из них произошло прерывание беременности. При сравнении, из 67 нормальных по X-хромосоме пациенток 16 являлись беременными (23,88%), из которых только у 3 произошло прерывание беременности (18,75%).

Пример 4

Определение гонадного мозаицизма при кариотипическом анализе с применением клеток из фолликулярной жидкости (Способ с покровным стеклом).

1) Забор клеток из фолликулярной жидкости.

Клетки из фолликулярной жидкости собирают от 4 пациенток, подверженных способу оплодотворения in vitro, как описано в примере 1.

2) Клеточная культура

Для осаждения клеток образец фолликулярной жидкости от каждой пациентки центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант сбрасывают, оставляя над осадком приблизительно 4 мл жидкости, а затем ресуспендируют осадок в оставшейся жидкости. На помещенное в чашку Петри стерильное покровное стекло капают из пипетки приблизительно 0,5 мл. Образцу позволяют подсохнуть в течение нескольких минут перед добавлением 0,5 мл культуральной среды (Amniomax; Sigma) и инкубируют в течение ночи при температуре 37°C и 5% CO₂. На следующий день добавляют приблизительно 2 мл культуральной среды и инкубируют планшеты в течение дополнительных двух суток. Ежедневно под контролем микроскопа за культурами наблюдают в отношении образования фибробластов и вносят дополнительную культуральную среду, если необходимо. Супернатант удаляют и добавляют свежую среду, когда культуры являются конфлуентными. Через двое суток клетки собирают, добавлением в культуру 20 мкл Demicolcine (Sigma), инкубируя в CO₂-инкубаторе в течение 20 минут и добавляя 2 мл гипотонического раствора (0,75 М KCl и 0,6% цитрата натрия). После этого культуры инкубируют в течение 20 минут при 37°C.

3) Фиксация клеток и кариотипирование

К культурам при комнатной температуре медленно добавляют пять капель свежего фиксатора и инкубируют культуры при 37°C в течение 10 минут. Добавляют еще одну 1 мл аликвоту фиксатора, а через 10 минут добавляют еще 2 мл. Через 20 минут весь фиксатор удаляют при комнатной температуре и добавляют 2 мл свежего фиксатора, и снова инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре. Эту последнюю стадию фиксации повторяют дважды. Покровное стекло вынимают из чашки Петри и оставляют на влажной ткани для высушивания. Затем покровное стекло заключают на чистом, сухом стекле с применением заключающей среды DPX. После этого стекло окрашивают способом GTG-бэндинга (The AGT Cytogenetics Laboratory Manual, 3rd Edition, 1997, P 259-324) и сушат на воздухе. Затем стекло изучают под масляной иммерсией для проверки четкой исчерченности хромосом. При исследовании количественных и структурных аномалий анализируют как минимум от 20 до 30 метафаз.

4) Результаты

Моносомию обнаружили в 3 метафазах (фигура 9) из 20 проанализированных в образце от одного индивидуума метафаз. Данный результат также подтвердили в 1 из 20 проанализированных в образце крови метафаз.

Пример 5

Определение гонадного мозаицизма при кариотипическом анализе с применением клеток из фолликулярной жидкости (Способ с культуральным флаконом)

1) Забор клеток фолликулярной жидкости

Образцы фолликулярной жидкости забирают от шести подвергнутых процедуре оплодотворения in vitro индивидуумов, как описано в примере 1.

2) Клеточная культура и фиксация

Для осаждения клеток образец фолликулярной жидкости от каждого индивидуума центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант сбрасывают, оставляя над осадком приблизительно 4 мл жидкости. Затем осадок ресуспендируют в оставшемся супернатанте. В два флакона для культур ткани вносят соответственно по 2 мл клеточной суспензии. Во флаконы добавляют культуральную среду (Amniomax, Sigma) и инкубируют флаконы при 37°C в течение 6-8 суток. В каждый флакон вносят дополнительные 2 мл культуральной среды и инкубируют флаконы еще двое суток. Ежедневно под контролем микроскопа за культурами наблюдают в отношении образования фибробластов и вносят культуральную среду по мере необходимости. При обнаружении колоний фибробластов клетки собирают, добавляя 50 мкл Demicolcine (Sigma) и инкубируя приблизительно при 37°C в течение от 2 до 3 часов. Затем клетки переносят в центрифужную пробирку. Во флакон добавляют раствор ЭДТА, встряхивают флакон и снова переносят содержимое в центрифужную пробирку. После этого флакон отмывают раствором трипсина в продолжение от двух до трех минут и снова переносят содержимое в центрифужную пробирку.

В содержащую культивированные клетки центрифужную пробирку добавляют приблизительно 2 мл гипотонического раствора (0,75 М KCl и 0,6% цитрата натрия) и оставляют пробирку приблизительно при 37°C в течение приблизительно 20 минут. К этому медленно добавляют от 10 до 12 капель свежего фиксатора комнатной температуры и оставляют пробирку приблизительно при 37°C в течение приблизительно 10 минут. После этого пробирку центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант сбрасывают, оставляя над осадком приблизительно 0,5 мл раствора. Осадок ресуспендируют в оставшемся супернатанте. Сначала добавляют 1 мл свежего охлажденного фиксатора; к этому добавляют еще приблизительно 5 мл фиксатора и суспензию оставляют при 2-8°C в течение 16-20 часов. Фиксированные образцы центрифугируют и сбрасывают супернатант, оставляя над осадком приблизительно 0,5 мл раствора. Вносят приблизительно 6 мл свежего холодного (от 2 до 8°C) фиксатора Карнуа, содержимое центрифугируют и вносят дополнительный фиксатор. Эту стадию фиксации повторяют дважды.

3) Кариотипирование

Несколько капель клеточной суспензии помещают на охлажденное влажное стекло. После этого стекло в течение 2 секунд нагревают на настроенной на 60-68°C водяной бане и затем переносят на установленную на 45°C горячую плитку на одну минуту. Стекло исследуют на метафазы с длинными сильно спирализованными хромосомами под контролем фазово-контрастного микроскопа при 10× увеличении. Стекло окрашивают способом GTG-бэндинга, как описано выше, и сушат. Затем стекло изучают под масляной иммерсией для проверки хорошей и четкой исчерченности хромосом. При исследовании количественных и структурных аномалий анализируют как минимум от 20 до 30 метафаз.

4) Результаты

Трисомию 21 определили в 4 метафазах из 30 проанализированных в образце от каждой пациентки метафаз с анамнезом у плода синдрома Дауна (фигура 10). Напротив, все исследованные в образце крови метафазы являлись нормальными. Данные результаты подтверждают наличие гонадного мозаицизма у данного индивидуума.

Как показано в примерах 1-5, гонадный мозаицизм, включающий в себя слабо выраженный гонадный мозаицизм, можно выявлять в полученных из фолликулярной жидкости клетках. Это показывает, что полученные из фолликулярной жидкости клетки можно использовать в качестве эффективного средства для выявления хромосомных аномалий в популяции симптоматических и бессимптомных индивидуумов.