способ подготовки спермы животных-производителей к ее использованию

Формула изобретения

Способ подготовки спермы животных-производителей к ее использованию, включающий смешивание углеводных, криогенно-протекторных и липидно-белковых компонентов в водной среде, смешивание со спермой и замораживание полученной смеси, затем при необходимости использования ее размораживание путем нагревания, отличающийся тем, что сперму со средой для разбавления смешивают в соотношении, равном 1:1, последующее замораживание полученной смеси осуществляют на фторопластовой пластине, предварительно помещенной на 10 мин в жидкий азот, в который затем помещают полученные гранулы для хранения, а перед использованием размораживание гранул разбавленной спермы осуществляют в течение 5-10 мин при температуре 40°С в среде в того же разбавителя, в состав которого дополнительно вводят карнитин в количестве 30 мг на 100 мл раствора при соотношении разбавителя с картитином к размороженным гранулам спермы, равным 3:1, при этом в качестве разбавителя используют среду следующего состава, мас.%:

Лактоза	2,17
Лимонная кислота	1,52
Трис-(оксиметил)-аминометан	0,27
Глицерин	2,0
Бромид-N	0,025
Желток куриного яйца	15,0
Вода	Остальное

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к сельскому хозяйству и предназначено для получения криоконсервированной спермы животных-производителей и ее использование путем размораживания в среде для разбавления, повышающей активность спермы.

Известен «Способ приготовления среды для разбавления спермы производителей», включающий смешивание углеводных, криогенно-протекторных и липидно-белковых компонентов в водной среде с последующей стерилизацией раствора разбавителя, при этом стерилизацию раствора разбавителя осуществляют в герметично закрытых емкостях электромагнитным полем определенной частоты, удельной энергоемкости при температуре нагрева 70-75°С. Патент РФ № 1769422, МКИ: 6 A61D 19/02, публ. 1995.06.27.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является «Способ приготовления среды для разбавления спермы животных-производителей», включающий смешивание углеводных, криогенно-протекторных и липидно-белковых компонентов в водной среде, при этом смесь компонентов герметизируют в емкостях, которые помещают в водную среду с температурой 18-20°С и воздействуют на смесь электромагнитным полем СВЧ-диапазона, затем данные емкости выдерживают в течение 16-20 часов, а потом осуществляют их нагрев до 58-60°С в течение 20-25 мин.

Патент РФ № 2073499, МКИ: 6 A61D 19/02, публ. 1997.02.20.

Основными недостатками вышеописанных способов являются необходимость наличия сложной дорогостоящей техники, специального обученного персонала, следовательно высокую стоимость затрат на выполнение этих способов.

К техническому результату относится снижение затрат на получение замороженной спермы животных-производителей и среды для ее разбавления, а также повышение качества полученного состава для искусственного осеменения животных путем использования при размораживании спермы среды, в состав которой введен компонент, повышающий воспроизводительную способность сперматозоидов.

Технический результат достигается путем того, что «СПОСОБ ПОДГОТОВКИ СПЕРМЫ ЖИВОТНЫХ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ К ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЮ» включает смешивание углеводных, криогенно-протекторных и липидно-белковых компонентов в водной среде. Затем полученный состав разбавителя смешивают со спермой и замораживают полученную смесь. При необходимости использования смесь спермы с разбавителем размораживают путем нагревания. Сперму со средой для разбавления смешивают в соотношении, равном 1:1. Последующее замораживание полученной смеси осуществляют на фторопластовой пластине, предварительно помещенной на 10 минут в жидкий азот. В полученные гранулы для хранения также помещают в жидкий азот. Перед использованием размораживание гранул разбавленной спермы осуществляют в течение 5-10 минут при температуре 40°С в среде того же разбавителя, в состав которого дополнительно введен карнитин в количестве 30 мг на 100 мл раствора при соотношении разбавителя с карнитином к размороженным гранулам спермы, равным 3:1, при этом в качестве разбавителя используют среду следующего состава: мас.%:

Лактоза	2,17
Лимонная кислота	1,52
Трис-(оксиметил)-аминометан	0,27
Глицерин	2
Бромид-N	0,025
Желток куриного яйца	15
Вода	остальное.

Примеры осуществления способа: криоконсервация спермы животных-производителей проводилась в подсобном хозяйстве института, расположенного в поселке Горки Ленинские Московской обл. и на индивидуальных фермах. Отбор спермы животных производился два раза в неделю дуплетно (второе взятие через 10-15 мин). Пробы спермы помещались на исскуственную вагину, температура которой находилась в пределах 38-40°С. Сперму разбавляли средой, состав которой указан в таблице 1, в соотношении 1:1.

Таблица 1
№ п/п	Состав криоконсервирующей среды	Мас.%
1	Лактоза	2,17
2	Лимонная кислота	1,52
3	Трис-(оксиметил)-аминометан	0,27
4	Глицерин	2
5	Бромид-N	0,025
6	Желток куриного яйца	15
7	Вода	остальное
При рН, равной 7-7,05

При этом бромид-N представляет собой соединение N-диметил-N-децил-4-окси-3,5-ди-трет-бутил-бензиламина.

Затем сперму переносили в инкубатор CO₂ при температуре 37-38°С и оценивали под микроскопом «Аксиоверт». Замораживание спермы производили на фторопластовой пластине, предварительно поместив ее в жидкий азот на 10 мин. Автоматической пипеткой, объемом 0,15-0,2 мл, отбирали разбавленную сперму и наносили на охлажденную фторопластовую пластину, гранулы опускали в жидкий азот и переносили в контейнер с жидким азотом в сосуд Дъюара для хранения. Размораживание спермы проводили в растворе, который содержит ингредиенты среды из табл.1, с дополнительно введенными в ее состав 30 мг карнитина на 100 мл среды при соотношении разбавителя с карнитином к размороженным гранулам спермы, равным 3:1. Результаты сравнивались с двумя другими методами размораживания и сведены в таблицу 2.

Таблица 2
№ п/п	Состав среды для размораживания спермы	Количество образцов	Время с момента размораживания, час
	0	0,5	1	3
1	Среда см. табл.1) + 30 мг карнитина на 100 мл среды	15	0,5	0,8	0,8	0,4
2	Цитрат натрия	15	0,4	0,6	0,6	Подвижность не наблюдалась
3	Сухой метод	15	0,5	0,7	0,6	Подвижность не наблюдалась

Как видно из табл.2, при размораживании спермы в среде с добавлением карнитина активность спермы выше, чем в других примерах 2 и 3 и находится в пределах от 0,4 до 0,8 баллов.

Наблюдалось увеличение активности сперматозоидов в среде 1 (табл.2) через 0,5-1 час при культивировании в термостате на 0,2 балла по сравнению со средами 2 и 3. Одновременно с повышением живучести спермы отмечалась визуальная активность сперматозоидов в среде 1.

С этой целью образцы размороженной спермы в средах 1, 2 и 3 из (табл.2) исследовали под микроскопом «Аксиоверт» через 0, 2, 6, 24, 48 часов предварительно поместив образцы в термостат при температуре 40°С на 5-10 мин.

Влияние карнитина на активность и живучесть сперматозоидов показано в таблице 3.

Таблица 3
№ /п	Состав среды	Количество образцов	Время использования образцов, час
0	2	6	24	48
1	Среда (табл.1)	15	0,8	0,8	0,7	0,5	0,2
2	Среда (табл.1) + карнитин	15	0,9	0,9	0,8	0,6	0,5

Данные в таблице 3 показывают, что введение карнитина в среду для размораживания спермы оказывает положительное влияние на активность и живучесть сперматозоидов, даже в начальный период активность их на 0,1 балл выше чем в среде без карнитина, и даже через 48 часов выживаемость сперматозоидов на 0,3 балла выше чем в среде без карнитина.

Опыты по использованию полученной и размороженной спермы в среде разбавителя с добавкой карнитина проводились в крольчатнике, где осеменялись подготовленные крольчихи.

Для осеменения использовали шприцы, предназначенные для искусственного осеменения овец, узкий конец которых обрезали и оплавляли для получения на конце изгиба, длиной 1,5-2 см. Длина вводимой части шприца составляла 14 см. Для стимуляции и овуляции использовали хорионический гонадотропин в дозе 25И.Е., который вводили внутривенно. Осеменение крольчих проводили через 2-3 часа после введения хорионического гонадотропина.

Результаты осеменения крольчих при использовании различных способов получения сред для криоконсервации и размораживания представлены в таблице 4.

Таблица 4
№ п/п	Состав среды	Время стимуляции и овуляции при осеменении	Оплодотворяемость	Получено крольчат	Плодовитость на одну самку
Кол-во самок	Из них сукрольных	%
1	Среда (табл.1)	ХГ через 2-3 часа	10	8	80	Самки - 27 Самцы - 29 Всего - 56	5,6
2	Среда (табл.1) + карнитин	ХГ через 2-3 часа	10	9	90	Самки - 40 Самцы - 21 Всего - 61	6,1

Анализ данных, сведенных в таблицы 1, 2 и 3 и 4, показал оптимальность предложенного способа получения криоконсервированной спермы животных-производителей и ее размораживания в среде для разбавления, в состав которой введен компонент, повышающий воспроизводительную способность сперматозоидов.