способ селекции фрагментов днк, прочно связанных с белками клеточной поверхности и обладающих иммуномодулирующей активностью

Формула изобретения

1. Способ селекции фрагментов ДНК, прочно связанных с белками клеточной поверхности и обладающих иммуномодулирующей активностью, включающий отмывку эукариотических клеток от несвязавшейся ДНК, выделение ДНК, прочно связанных с белками клеточной поверхности, их амплификацию при помощи ПНР с использованием праймеров, клонирование полученных фрагментов ДНК, определение их последовательностей при помощи секвенирования клонов и поиск повторяющихся элементов последовательностей, отличающийся тем, что эукариотические клетки обрабатывают раствором фермента, отделяют центрифугированием, из полученного супернатанта выделяют ДНК, прочно связанные с белками клеточной поверхности, путем инкубации с активированной сефарозой в течение 4-6 ч, сорбент отмывают от неспецифически связанных ДНК сначала фосфатным буфером, содержащим 0,05% Tween 20, а затем фосфатным буфером, содержащим 0,5 М NaCl, проводят элюцию со смолы прочно связанных ДНК с помощью буфера, содержащего 30 мМ НСООН/NH₄OH (рН 2,6), разделяют полученные фрагменты ДНК по длине и выделяют короткие фрагменты ДНК с длиной 6-16 нуклеотидов с последующим лигированием адаптеров, их амплификацией, клонированием и секвенированием, среди полученных фрагментов ДНК проводят поиск мотивов длиной 5-8 н. и далее осуществляют поиск геномных последовательностей ДНК в базах данных in silico, содержащих найденные мотивы с частотой не менее 50% с последующим синтезом олигонуклеотидов выявленных последовательностей и проверкой их иммуномодулирующей активности.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве фермента используют 0,125-0,25%-ный раствор трипсина.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве смолы используют сефарозу CL-4B, активированную цианогенбромидом.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области молекулярной и клеточной биологии и медицины, а именно к способам селекции ДНК последовательностей, обладающих иммуномодулирующей активностью.

Прочное связывание клеточных рецепторов с лигандами необходимо для реализации множества процессов: рецепции и транспорта, передачи активирующего/ингибирующего сигналов, клеточной миграции и.т.д. В качестве клеточных рецепторов выступают, как правило, биополимеры, в которых узнавание лиганда происходит за счет взаимодействия с белковой частью молекулы. Действительно, было показано, что нуклеиновые кислоты, в частности ДНК, так же связываются с поверхностными белками клеток и это связывание необходимо для их транспорта в клетки и реализации биологических эффектов. Влияние экзогенных внеклеточных ДНК на клеточные функции, такие как экспрессия генов (малые интерферирующие РНК, антисмысловые олигонуклеотиды, генная иммунизация), могут быть реализованы только после проникновения ДНК в клетки. Для реализации иммуномодулирующего действия ДНК также необходимо проникновение ДНК в клетки, поскольку основной рецептор ДНК TLR-9 не экспонирован на клеточной мембране, а локализован внутри клетки в эндосомальных компартментах. В случае взаимодействия иммуностимулирующей ДНК с внутриклеточными рецепторами, связывание ДНК с клеточной поверхностью является ключевым моментом в иммуностимуляции, поскольку оно определяет эффективность транспорта ДНК. Таким образом, иммунологически активные молекулы ДНК должны обладать повышенным сродством к клеточной поверхности [1].

Известно, что на поверхности эукариотических клеток постоянно и в значительном количестве (1-3% геномной ДНК) присутствуют внеклеточные ДНК эндогенного происхождения [2]. Эти ДНК находятся в составе прочных комплексов с клеточной поверхностью, поскольку стабильны к действию ДНКаз (гидролизуется от 0 до 30% в зависимости от типа клеток) и могут быть элюированы с поверхности клеток обработкой протеазами, например трипсином. Очевидно, что такие ДНК препятствуют связыванию экзогенных ДНК с клетками и могут быть вовлечены в регуляцию клеточных процессов и поддержание гомеостаза. В частности, среди фрагментов ДНК, прочно связанных с белками клеточной поверхности, потенциально могут встречаться последовательности, обладающие иммуномодулирующим действием. Поиск таких последовательностей является актуальной задачей, поскольку молекулы ДНК, активирующие неспецифический иммунный ответ и помогающие бороться с инфекцией, могут стать основой для создания антибактериальных и вирусных вакцин.

Наиболее близким к заявленному способу - прототипом, является способ селекции фрагментов ДНК, способных прочно связываться с белками клеточной поверхности эукариотических клеток [3], включающий:

- синтез библиотеки двуцепоченных ДНК (дцДНК), состоящей из вырожденной последовательности длиной 10 нуклеотидов, фланкированной с обеих сторон 23-нуклеотидными фрагментами известной последовательности,

- 6 раундов селекции, каждый из которых включает инкубацию библиотеки дцДНК с клетками, отмывку клеток от несвязавшейся ДНК, выделение коротких фрагментов ДНК из мембранно-цитозольной фракции, их амплификацию при помощи ПЦР с использованием праймеров, комплементарных фланкирующим последовательностям, и повтор этих раундов 6 раз,

- клонирование полученных фрагментов ДНК, определение их последовательностей при помощи секвенирования клонов и поиск повторяющихся элементов последовательностей в области рандомизованного фрагмента (10 нуклеотидов) ДНК конструкции.

- исследование взаимодействия с клетками найденного мотива, путем синтеза олигонуклеотидов, содержащих тандемно повторенные последовательности этого ДНК-мотива.

Недостатком описанного способа является то, что эукариотические клетки, с которыми ведется инкубация библиотеки дцДНК, уже содержат на своей поверхности прочно связанные эндогенные ДНК. Эти ДНК выступают в качестве конкурентов для взаимодействия экзогенных нуклеиновых кислот с клетками. Поскольку библиотеки рандомизованных последовательностей длиной 10 нуклеотидов теоретически содержат не менее 4¹⁰ последовательностей, экзогенные ДНК определенной последовательности представлены в очень низкой концентрации и не могут конкурировать с эндогенными последовательностями. Значительное количество белков, экспонированных на поверхности клеток, связывают ДНК сиквенс-неспецифично, что дополнительно мешает отбору селективно взаимодействующих с клеточной поверхностью ДНК, а последовательность фланкирующих олигонуклеотидов зачастую вносит больший вклад во взаимодействие, чем рандомизованная ДНК последовательность. Кроме того, эффективная отмывка ДНК с поверхности эукариотических клеток практически не осуществима в силу того, что она должна проводиться в условиях, близких к физиологическим (чтобы не разрушить клетки и не изменить структуру биополимеров клеточной поверхности), что также препятствует селекции прочно связанных ДНК.

Технической задачей изобретения является разработка эффективного способа селекции фрагментов ДНК, прочно связанных с белками клеточной поверхности первичных клеток человека и обладающих иммуномодулирующей активностью.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующих последовательных стадиях.

1. Выделение ДНК, прочно связанных с белками клеточной поверхности.

Первичные клетки человека отмывают от культуральной среды и инкубируют с 0,125-0,25% раствором протеазы в течение 5 минут. Протеазу ингибируют, клетки осаждают центрифугированием при 400 g в течение 10-15 минут. Полученный супернатант инкубируют с активированной смолой, преимущественно с сефарозой CL-4B, активированной цианогенбромидом, в течение 4-6 часов. Оставшиеся реакционно-способные группы инактивируют добавлением 0,2 М раствора Глицин/NaOH (pH 8.0). Сефарозу переносят в хроматографическую колонку и отмывают фосфатным буфером, содержащим 0,05% Tween 20 (3 объема колонки), затем фосфатным буфером, содержащим 0.5 М NaCl (2 объема колонки) и затем элюируют фрагменты ДНК, прочно связанные с белками клеточной поверхности буфером 30 мМ HCOOH/NH₄OH (pH 2,6).

2. Разделение полученных фрагментов ДНК по длине, выделение фрагментов длиной 6-16 нуклеотидов, с последующим лигированием адаптеров согласно методике, описанной ранее в [4], их амплификацией, клонированием и секвенированием.

3. Идентификация среди полученных фрагментов ДНК мотивов длиной 5-8 нуклеотидов, которые встречаются среди секвенированных последовательностей с частотой выше 10%. Полученные после стадии 3 ДНК-мотивы прочно связываются с белками клеточной поверхности и могут быть использованы для селекции фрагментов ДНК, обладающих иммуномодулирующей активностью.

4. Поиск в геноме человека последовательностей ДНК, содержащих выбранные мотивы с частотой не менее 50% (не менее 3-х мотивов ДНК на участке генома длиной 30 оснований), с использование возможностей, предоставляемых сервером Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

5. Химический синтез олигонуклеотидов с последовательностью, найденной в результате выполнения предыдущей стадии способа, иммуномодулирующее действие которых проверяют по способности активировать секрецию противовоспалительных цитокинов клетками иммунной системы человека.

Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа, по сравнению с прототипом, является следующее.

1. Первичные клетки человека обрабатывают раствором фермента, преимущественно 0,125-0,25% раствором трипсина, в условиях, не приводящих к лизису клеток, но приводящих к освобождению ДНК-белковых комплексов клеточной поверхности, что позволяет выделить эндогенные природные ДНК, прочно связанные с белками клеточной поверхности.

2. Полученный после центрифугирования супернатант инкубируют с активированной смолой, преимущественно с сефарозой CL-4B, активированной цианогенбромидом, в течение 4-6 часов, что позволяет эффективно удалить непрочно связанные молекулы ДНК и выделить фрагменты ДНК, прочно связанные с белками клеточной поверхности благодаря формированию ковалентных связей между адсорбентом и белковыми компонентами нуклеопротеиновых комплексов клеточной поверхности (что в отличие от прототипа элиминирует не эффективную стадию отмывки ДНК с поверхности живых клеток).

3. Осуществляют последовательную отмывку сефарозы в хроматографической колонке фосфатным буфером, содержащим 0,05% Tween 20 (3 объемами колонки), и фосфатным буфером, содержащим 0.5 М NaCl (2 объема колонки), что позволяет удалять неспецифические и непрочно связанные с сорбентом молекулы ДНК.

4. Элюцию фрагментов ДНК с сефарозы проводят буфером, содержащим 30 мМ HCOOH/NH₄ OH (pH 2,6), что позволяет выделять прочно связанные с белками клеточной поверхности фрагменты ДНК с их последующим клонированием и секвенированием.

5. Полученные фрагменты ДНК, прочно связанные с белками клеточной поверхности разделяют по длине и выделяют короткие фрагменты ДНК с длиной 6-16 нуклеотидов, что позволяет селектировать фрагменты ДНК, прочно связанные с белками клеточной поверхности по размеру.

6. Идентифицируют среди полученных фрагментов ДНК мотивы длиной 5-8 нуклеотидов с последующим поиском в геноме человека последовательностей ДНК, содержащих выбранные мотивы с частотой не менее 50%, что позволяет провести химический синтез олигонуклеотидов с последовательностью, найденной в результате селекции фрагментов ДНК для оценки иммуномодулирующей активности (в прототипе используются тандемно повторенные последовательности найденных мотивов).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1.

Первичные эндотелиальные клетки из пупочной вены человека (5·10⁶ клеток) отмывали от культуральной среды тремя сменами изотонического фосфатного солевого раствора, инкубировали с 0,25% раствором трипсина в течение 5 минут. Трипсин инактивировали добавлением ингибитора трипсина. Клетки осаждали центрифугированием при 400 g в течение 10 минут. Полученный супернатант инкубировали с активированной цианогенбромидом се фарозой CL-4B в течение 4 часов. Оставшиеся реакционно-способные группы инактивировали добавлением 0,2 М раствора Глицин/NaOH (pH 8.0). Сефарозу переносили в хроматографическую колонку и отмывали фосфатным буфером, содержащим 0,05% Tween 20 (3 объемами колонки), затем фосфатным буфером, содержащим 0.5 М NaCl (2 объема колонки) и затем элюировали ДНК, прочно связанные с белками клеточной поверхности буфером 20 мМ HCOOH/NH₄OH (pH 2,6).

Полученную ДНК прогревали при 100°C, охлаждали на льду и вводили радиоактивный фосфор при помощи полинуклеотидкиназы Т4 и -P³²-АТФ, как описано в [4]. Для выделения фрагментов ДНК длиной 8-16 нуклеотидов ДНК разделяли электрофорезом в 20% ПААГ с 7М мочевиной и определяли места локализации ДНК в геле при помощи радиоавтографии. Одноцепочечные фрагменты длиной 6-16 нуклеотидов элюировали из геля при помощи электроэлюции и лигировали адапторы с 5'- и 3'-концов, как описано ранее [4]. Фрагменты амплифицировали при помощи ПЦР и обрабатывали рестриктазами EcoRI и BamHI, затем клонировали в вектор pBluescript II KS, предварительно обработанный рестриктазами EcoRI и BamHI. Последовательность вставок определяли при помощи автоматического секвенатора ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems).

Последовательности полученных фрагментов ДНК представлены в таблице 1:

№	последовательность	комплементарная последовательность	примечания
Ф-1	5'-CTACGTCNT-3'	5'-ANGACGTAG-3'	(N=Т или C)
Ф-2	5'-CATGCATT-3'	5'-AATGCATG-3'
Ф-3	5'-NGNCTT-3'	5'-AAGNCN-3'	(N1=T или C; N2=G или T)
Ф-4	5'-NGGAAGAA-3'	5'-TTCTTCCN-3'	(N=G или C)
Ф-5	5'-TGTCATCAT-3'	5'-ATGATGACA-3'
Ф-6	5'-ATGCAT-3'	5'-ATGCAT-3'
Ф-7	5'-CGTAGTA-3'	5'-TACTACG-3'
Ф-8	5'-GCATGCATT-3'	5'-AATGCATGC-3'
Ф-9	5'-AGTNGTGGG-3'	5'-CCCACNACT-3'	(N=А или C)
Ф-10	5'-GATCCA-3'	5'-TGGATC-3'
Ф-11	5'-STNNRTCC-3'	5'-GGAYNNAS-3'	(S=G/C, N1=A/G, N2=G/C)
Ф-12	5'-AGCNGGA-3'	5'-TCCNGCT-3'	N=T/G
Ф-13	5'-CGTGGTCT-3'	5'-AGACCACG-3'
Ф-14	5'-CGTCCGGC-3'	5'-GCCGGACG-3'
Ф-15	5'-GATCCAGG-3'	5'-CCTGGATC-3'
Ф-16	5'-ACGAGT-3'	5'-ACTCGT-3'
Ф-17	5'-AGAAGG-3'	5'-ССТТСТ-3'
Ф-18	5'-CTACGTTC-3'	5'-GAACGTAG-3
Ф-19	5'-ATGCGTGT-3'	5'-ACACGCAT-3
Ф-20	5'-TCCGTAC-3'	5'-GTACGGA-3'
Ф-21	5'-CTACGTAC-3'	5'-GTACGTAG-3'
Ф-22	5'-CTACGTCG-3'	5'-CGACGTAG-3'
Ф-23	5'-GCCCCCCGTA-3'	5'-TACGGGGGGC-3'
Ф-24	5'-GTCTACGTCTTCA-3'	5'-TGAAGACGTAGAC-3'

На основании последовательностей полученных фрагментов были идентифицированы ДНК-мотивы длиной 5-8 нуклеотидов, последовательности которых представлены в таблице 2:

ОДН	Последовательность
F-1	5'-GCATGCATT-3'
F-2	5'-GATCCA-3'
F-3	5'-TACGT-3'

В геноме человека были найдены последовательности ДНК, содержащие комбинации отсеквенированных мотивов с частотой не менее 50%. Один из вариантов последовательности ДНК можно описать общей формулой: (Ф-23)N_1-15(Ф-7)N _0-15(Ф-23). На основе геномных последовательностей, содержащих секвенированные фрагменты, были синтезированы искусственные олигодезоксирибонуклеотиды (ОДН), представленные в таблице 3:

№	Последовательность	ИЛ-6, пкг/мл	ИЛ-8, нг/мл
1	5'-pGCATGCATTGCATGCATTGCATGCATTGCATGCATTT-3'	150	0.2
2	5'-pTGATATAGCATGCATTTATGCATGCATTTTGAAAACT-3'	600	1.575
3	5'-pTCATCTGGTGCATGCATTTTCGCATGCATTTCTTGTT-3'	550	1.55
4	5'-pAGGAGGCATGCATTGTCAGAGGCATGCATTGTCAGGT-3'	550	1.25
5	5'-pAGTAAGCATGCATTTGAGGGTGGAGCATGCATTTCAT-3'	700	1.575
6	5'-pATAGGCATGCATTTAATTTATTGGCATGCATTTAATT-3'	670	1.7
7	5'-pCTGCATCCCAGAGCATGGATCCAGGAGGTGGGAAGAT-3'	600	2.1
8	5'-pGATCCAGGGATCCAGGGATCCAGGGATCCAGGT-3'	620	1.45
9	5'-pCTACGTCGATGCGTGTTCCGTACCTACGTCTTT-3'	530	1.05
10	5'-pCACCTGCCAGATCCAGATCCAGGTGAATCTGAT-3'	300	0.525
11	5'-pATACGTGGATCCAATACGTGGATCCAATATGTT-3'	110	2.05
12	5'-pGATCCAATACGTGGATCCAATACGTGGATCCAT-3'	640	2.15
13	5'-pCTGCATGCATTTCCTTCTGCATTCCAGCTGGAT-3'	670	2.05
14	5'-pTGAAGGTAGAAGGAATCCCGGCCTGGATCCACT-3'	450	0.95
15	5'-pCGGAGGAATCCCGGGAGTAGTGGGAAGAAAAGT-3'	550	1.3

Иммуномодулирующие свойства этих олигодезоксинуклеотидов были исследованы на модели первичных эндотелиальных клеток человека. Для этого клетки рассаживали на 24-луночные планшеты (Linbro, США) в плотности 2·10 ⁴ клеток в лунке, дважды отмывали культуральной средой без сыворотки и добавляли культуральную среду без сыворотки, содержащую 1 мкМ ОДН. В качестве контролей использовали LPS в концентрации 0.5 мкг/мл или IMDM. После двух часов инкубации к клеткам добавляли ЭТС в количестве 1/10 объема культуральной среды в лунке. Клетки инкубировали 24 часа при 37°C в атмосфере 5% CO₂. После окончания инкубации собирали супернатанты HUVEC, центрифугировали для удаления клеток и измеряли концентрации ИЛ-6 и ИЛ-8 при помощи коммерческих наборов (Вектор-Бест, Новосибирск). Концентрация ИЛ-6 и ИЛ-8 в супернатанте клеток без стимуляторов составила 160 пкг/мл и 0.325 нг/мл соответственно, в супернатанте LPS-стимулированных клеток концентрации ИЛ-6 и ИЛ-8 составили 2600 пкг/мл и 6 нг/мл.

Установлено, что в зависимости от последовательности ОДН существенно отличаются по уровню индукции секреции ИЛ-6 и ИЛ-8, при этом некоторые ОДН активируют синтез интерлейкинов, а некоторые - ингибируют.

Пример 2.

Первичные фибробласты из десны человека обрабатывали 0,125% химотрипсином, ингибировали добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Дальнейшее выделение ДНК, прочно связанных с белками клеточной поверхности, проводили аналогично примеру 1.

Полученную ДНК прогревали при 100°C, охлаждали на льду и вводили радиоактивный фосфор при помощи полинуклеотидкиназы Т4 и -P³²-АТФ, как описано в [4]. Для выделения фрагментов ДНК длиной 8-16 нуклеотидов ДНК разделяли электрофорезом в 20% ПААГ с 7М мочевиной и определяли места локализации ДНК в геле при помощи радиоавтографии. Одноцепочечные фрагменты длиной 6-16 нуклеотидов элюировали из геля при помощи электроэлюции и лигировали адапторы с 5'- и 3' - концов, как описано ранее [4]. Фрагменты амплифицировали при помощи ПЦР и обрабатывали рестриктазами EcoRI и BamHI, затем клонировали в вектор pBluescript II KS, предварительно обработанный рестриктазами EcoRI и BamHI. Последовательность вставок определяли при помощи автоматического секвенатора ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems).

На основании отсеквенированных фрагментов ДНК длиной 6-16 нуклеотидов, были выбраны мотивы, последовательности двух выборочных мотивов представлены в таблице 4:

ОДН	Последовательность
F-1	5'-GATCCA-3'
F-2	5'-TACGT-3'

Поскольку найденные мотивы частично совпадали с мотивами, найденными в примере 1, в качестве олигонуклеотидов, содержащих последовательности геномной ДНК человека, были выбраны олигонуклеотиды из таблицы № 3, а именно ОДН 12 и ОДН 13. Иммуномодулирующее воздействие ОДН было исследовано, как описано в примере 1. Было показано, что в результате стимуляции первичных фибробластов ОДН не наблюдалось изменения в продукции интерлейкинов 6-го и 8-го, однако данные ОДН ингибировали PolyIC-индуцированную секрецию интелейкинов, и, таким образом, обладали иммуномодулирующей активностью.

Использование предлагаемого способа позволит, по сравнению с прототипом:

- получать природные фрагменты ДНК, прочно связанные с белками клеточной поверхности и использовать их в качестве исходного материала для поиска сиквенс-специфичных последовательностей;

- исключить влияние фланкирующих фрагментов в последовательностях нуклеиновых кислот на эффективность и прочность связывания последовательностей с белками клеточной поверхности;

- эффективно удалять непрочно связанные нуклеиновые кислоты за счет ковалентного присоединения нуклеопротеиновых комплексов клеточной поверхности к поверхности сорбента за счет белковой компоненты комплекса.

Источники информации

1. Lamphier M.S. et al, TLR9 and the Recognition of Self and Non-Self Nucleic acids // Ann. N.Y. Acad. Sci, 2006, V.1082, P.31-43.

2. Skvortsova Т.Е., et al, Cell-free and cell-bound circulating DNA in breast tumors: DNA quantification and analysis of tumor-related gene methylation // British J. Cancer, 2006, V.94 (10), P.1492-1495.

3. Mende, M., et al, Hexanucleotide selected for increased cellular uptake in cis contains a highly active CpG motif in human В cells and primary peripheral blood mononuclear cells // Immunology, 2007, V.120 (2), P.261-272.

4. Лактионов П.П., Мальшакова B.C., Морозкин E.C., Пышный Д.В., Власов В.В. Способ анализа неизвестных последовательностей одноцепочечных нуклеиновых кислот. Патент РФ № 2322508, оп. 20.04.2008, Бюл. № 11.