компьютерный анализ точечных цифровых изображений гистологических препаратов для определения концентрации гистамина в биологических структурах

Формула изобретения

Способ определения концентрации гистамина в биологических структурах путем фотографирования гистологических препаратов, обработанных по методу Кросса-Эвена-Роста с орто-фталиевым альдегидом и оценки фотографий, отличающийся тем, что используют цифровую фотографию, а концентрацию гистамина программно определяют по средней яркости участка цифрового изображения в условных единицах яркости от 0 до 255 посредством графических редакторов.

Описание изобретения к патенту

Компьютерный анализ точечных цифровых изображений гистологических препаратов для определения концентрации гистамина в биологических структурах

Изобретение относится к медицине, а именно к морфологии и гистохимии.

Для гистохимического выявления гистамина используется метод Кросса-Эвена-Роста с орто-фталиевым альдегидом (Cross, S.W.D. A study of the methods available for the cytochemical localization of histamine by fluorescence induced with o-phthalaldehyde or acetaldehyde / S.W.D. Cross, S.W.B. Ewen, F.W.D. Rost // Histochem. J. - 1971. - Vol.3. - P.471-476).

Впоследствии препарат подвергается цитоспектрофлуометрии при помощи фотометрической люминесцентной электронной насадки ФМЭЛ-1А для определения в условных единицах регистрирующего прибора концентрации гистамина в биологических структурах. Для определения интенсивности люминесценции гистамина в исследуемых объектах по традиционной методике используется интерференционный светофильтр № 7 фотометрической люминесцентной насадки ФМЭЛ-1А (максимальная длина пропускаемой волны 503±14 нм). Световой поток люминесценции от изучаемого участка поля зрения отсекается автоматически аппаратным зондом. ФЭУ преобразует светопоток от флуоресценции гистамина в силу тока, которая вызывает отклонение стрелки стандартного измерительного прибора, что пропорционально концентрации гистамина под зондом.

Запись полученных данных производится вручную, ориентируясь на показания стрелки измерительного прибора.

Цель фотографирования ограничивается качественным анализом полученных снимков.

В качестве объектов для исследования концентрации гистамина таким методом часто являются тучные клетки (Бочкарев В.А. Сравнение гистохимических свойств различных популяций (перитонеальных и мезентериальных) тучных клеток в условиях дисбаланса биогенных аминов: дисс. канд. мед. наук. - Чебоксары, 1987. - 158 с.; Бочкарева А.Г. Влияние болевого стресса и КВЧ-поля на морфофункциональное состояние селезенки крыс: дисс. канд. биол. наук. - Чебоксары, 2002. - 155 с.; Гунин А.Г. Содержание гистамина и функциональная активность альвеолярных макрофагов / А.Г Гунин, Д.С.Гордон, И.Р.Вазина // Иммунология. - 1990. - № 6. - С.12-13.; Диндяев С.В., Виноградов С.Ю. Биогенные амины крови и перитонеальной жидкости крыс в процессе полового цикла // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2006. - № 3. - С.5-10.; Любовцева Л.А. Локализация гистамина в структурах вилочковой железы в норме и условиях эксперимента у лабораторных животных: автореф. дисс. канд. биол. наук. - М., 1980. - 23 с.).

Последовательность операций при традиционном способе определения концентрации гистамина в биологических структурах:

1. включить регистрирующий прибор за 30-40 минут до начала работы;

2. за 20-30 минут до начала цитоспектрофлуорометрии включить блок питания микроскопа, зажечь ртутную лампу ДРШ-250;

3. выставить напряжение, подаваемое на ФЭУ ФМЭЛа - 2200 В (следить, чтобы оно было постоянным);

4. калибровка регистрирующего прибора;

5. контрольный замер эталона из уранового стекла ЖС-19 при всегда определенной чувствительности регистрирующего прибора зондами при интерференционном фильтре «0» до эталонной цифры.

Таким образом, недостатками определения интенсивности светового потока от микропрепарата с целью определения концентрации гистамина в микроструктурах с использованием микроскопа ЛЮМАМ И2 с фотометрической установкой - ФМЭЛ-1А и регистрационным стрелочным прибором являются:

1. Высокая стоимость самой установки.

2. Необходимость постоянной текущей калибровки регистрирующего прибора для каждого препарата.

3. Перманентное отклонение стрелки регистрирующего прибора от истинного значения в результате инерционности его конструкции и нестабильности напряжения в сети.

4. Недолговечность гистохимического препарата (24-48 часов), а следовательно, невозможность архивировать первичную информацию, то есть наблюдаемое изображение.

5. Работа постоянно сопровождается образованием озона, источником которого является ртутная лампа ЛЮМАМа ДРШ-250.

6. Необходимость работать в темном помещении.

7. Длительность фотометрии приводит к усталости зрительного анализатора.

8. Невозможность ввиду всего вышеперечисленного проводить пролонгированный анализ.

Технический результат предлагаемого способа заключается в том, что для количественного определения концентрации гистамина в биологических структурах используется цифровая фотография с последующим компьютерным анализом яркости участка цифрового изображения, соответствующего аппаратному зонду по форме и размерам, исходя из определения средней яркости участка цифрового изображения в условных единицах яркости от 0 до 255 при помощи стандартных компьютерных программ.

Описание сущности предлагаемого способа:

Мы поставили цель заменить существующий метод количественного определения концентрации гистамина в микроструктурах гистологических препаратов, обработанных по методу Кросса посредством регистрации интенсивности светового потока от флуоресцирующих структур на волне 515-520 нм при помощи ФМЭЛ, на метод, использующий компьютерный анализ яркости участка цифрового изображения, соответствующей зонду по форме и размерам с помощью стандартных компьютерных программ. Это решение было вызвано тем, что флуоресценция препарата при данном методе обработки может быть вызвана или наличием гистамина в изучаемых структурах, или аутолюминесценцией структур. Последнюю можно исключить при соблюдении при помощи стандартной для этого метода постановки контрольной пробы - определения флюоресценции препарата без обработки реагентом.

Для получения цифровых изображений нами при помощи фотоаппарата Canon Power Shot, 32 Mega Pixels без вспышки, в режиме "Листва", позволяющем сохранить яркость светлых тонов, проводилось фотографирование обработанных по методу Кросса (на гистамин) тучных клеток перитонеальной жидкости крыс-самок. В результате был создан архив jpeg иображений размером 2048 на 1536 пикселей. Одновременно с этим посредством зонда 0,5 ФМЭЛа и регистрационного прибора в тех же самых клетках, которые подвергались микрофотографии, определялась концентрация гистамина на волне 515-520 нм. Позднее с каждым цифровым изображением тучной клетки была соотнесена зарегистрированная стандартным методом в этой же тучной клетке концентрация гистамина.

Для симуляции реального зонда ФМЭЛ используемого размера при помощи стандартных программных средств была использована круглая маска 60 на 60 пикселей (она выступала в роли виртуального, т.е. воссоздаваемого программными средствами компьютера, зонда), которая «отсекала» те участки изображения, с которых не производилась регистрация светопотока. Данная программная возможность реализована в целом ряде графических программ. Нами была использована Corel PHOTO-PAINT 10. После этого посредством меню «гистограмма» нами определялись характеристики интенсивности суммарной яркости изображения в пределах маски.

Для демонстрации сущности предлагаемого метода приведены фотографии перитонеальных тучных клеток с низким и высоким содержанием гистамина (фото 1, 3). Изображения рабочего окна программы в момент замера средней яркости участка под маской для этих же тучных клеток (фото 2, 4). Тучная клетка на фото 1, 3 визуально менее яркая, при традиционной методике данные о концентрации гистамина - 0,8 условных единиц, данные, полученные по предлагаемой методике (средняя яркость изображения под маской), - 22,97 условной единицы. Тучная клетка на фото 2, 4 визуально более яркая, при традиционной методике данные о концентрации гистамина - 7,2 условной единицы, данные, полученные по предлагаемой методике (средняя яркость изображения под маской), - 74,41 условной единицы.

Для количественного доказательства эквивалентности традиционной и предлагаемой методик нами был применен однофакторный дисперсионный анализ. Его применение связано тем, что на суммарную яркость микропрепарата в маске кроме непосредственной интенсивности света оказывают влияние еще и инструментальные особенности фотоаппарата и невозможность точного наложения маски на зону, измеряемую зондом (выполняется вручную). Поэтому нужно было узнать ту долю, которую вносит интенсивность светопотока от флуоресцирующих гистаминсодержащих структур в суммарную яркость этих структур на цифровом изображении. Данную информацию дает однофакторный дисперсионный анализ, для проведения которого необходимо подтвердить нормальный закон распределения изучаемых признаков.

Для этого был использован критерий Колмогорова, который для массива первичных данных о распределении концентрации гистамина, полученных традиционным способом, составил 0,228, а для массива первичных данных о распределении концентрации гистамина, полученных предлагаемым способом, 0,912 (критическое значение, при котором распределение нельзя считать нормальным 0,05 и меньше).

Знание о нормальном характере распределения первичных данных позволило нам воспользоваться однофакторным дисперсионным анализом (см.таблицу), согласно которому действительно имеется влияние данных, полученных традиционным способом, на данные, полученные экспериментальным способом (Ф=60,6 при Ф критическом = 2,3). При этом сила влияния находится в пределах от 86-80% (р<0,05), в среднем 83% от суммарного влияния всех факторов. Если учесть, что данные, полученные традиционным способом, эквивалентны концентрации гистамина в биологических структурах, то концентрация гистамина на 83% определяет яркость этих структур на цифровом изображении. Это достаточно высокий показатель, если учесть, что абсолютно точно воспроизвести измеряемую зондом зону при помощи маски не представляется возможным.

Таким образом, определение интенсивности светопотока на волне 515-520 нм от флуоресцирующего препарата, обработанного по методу Кросса (на гистамин), можно адекватно заменить компьютерной оценкой яркости участка изображения микрообъекта, что позволяет стандартными средствами цифровой фотографии и программной обработки данных оценить интенсивность флуоресенции на волне 515-520 нм, а следовательно, определить концентрацию гистамина в биологических объектах.

Данные, полученные традиционным и предлагаемым способом, а также промежуточные данные для однофакторного дисперсионного анализа приведены в таблице.

Таблица
Группа (интервал)	Традиционный способ (сила тока)	Предлагаемый способ (средняя яркость участка изображения)	Среднее по группам для предлагаемого способа
1-1,99	1,1	34,25	40,35
1,2	30,29
1,3	43,83
1,4	38,25
1,4	51,47
1,4	30,44
1,4	48,18
1,5	41,37
1,5	41,18
1,6	53,19
1,6	35,89
1,6	48,85
1,6	35,28
1,6	32
1,7	23,19
1,75	39,09
1,8	39,83
1,9	49,53
1,9	50,54
2-2,99	2	74,04	54,006
2	48,23
2,1	47,92
2,1	28,46
2,2	37,08
2,2	82,98
2,2	49,44
2,3	63,53
2,35	36,77
2,35	36,59
2,4	44,88
2,5	87,55
2,5	46,57
2,6	57,37
2,7	52,99
2,7	55,95
2,7	58,2
2,8	49,93
2,8	73,05
2,9	48,59

3-3,99	3	75,59	65,48529
3,1	62,09
3,2	71,21
3,2	31,83
3,2	46,8
3,2	60,89
3,2	56,39
3,3	68,72
3,5	67,53
3,6	42,48
3,6	100,76
3,6	82,32
3,8	54,97
3,8	61,56
3,8	60,28
3,9	73,5
3,9	96,33
4-4,99	4	59,9	72,00462
4,3	61,04
4,5	55,7
4,5	68,02
4,6	90,06
4,6	57,35
4,7	81,76
4,7	112,66
4,8	66,26
4,8	55,26
4,8	79,28
4,85	77,28
4,87	71,49
5-5,99	5,4	55,04	73,66889
5,5	86,94
5,5	91,84
5,6	59,06
5,6	77,94
5,7	95,09
5,7	51,63
5,8	72,71
5,8	72,77
6-6,99	6	79,79	76,6575
6,2	73,99
6,2	95,91
6,2	75,27
6,2	55,14
6,2	55
6,6	81,04
6,7	97,12
7-7,99	7,1	94,48	95,655
	7,2	74,7
7,4	81,09
7,4	132,35
8-8,99	8,2	89,86	100,75
8,6	98,24
8,8	114,15
ИТОГО
Среднее		62,98097
Дисперсия		476,3596	396,8167
Количество замеров	93
Количество групп	8
F (значение преобразования Фишера для доверительной вероятности 0,05)	2,3
Ф (достоверность влияния)	60,57717	Ф>F, влияние достоверно
Сила влияния (Доля влияния от воздействие всех факторов. Влияние всех факторов - 1)	0,833019 (83%)
Доверительный интервал для показателя силы влияния с вероятностью 0,05	0,801391-0,86464723 (80-86%)