способ выполнения гемолитического тестирования конструкционного стоматологического материала

Формула изобретения

Способ выполнения гемолитического тестирования конструкционного стоматологического материала, включающий приготовление объекта для исследования, приготовление питательной среды, содержащей эритроциты, помещение исследуемого объекта на питательную среду, инкубацию при температуре 37±0,2°С и по окончании инкубации интерпретацию результатов, отличающийся тем, что в качестве объекта исследования берут образцы конструкционного стоматологического материала, выполненные в форме пластин, а в качестве питательной среды берут кровяной агар с эритроцитами человека, который разливают в две чашки Петри, одну из которых засевают чистой культурой микроорганизмов, характерных для микрофлоры полости рта и обладающих гемолитической активностью, затем в каждую чашку Петри укладывают по образцу исследуемого материала, после чего обе чашки подвергают инкубации, по окончании инкубации чашки осматривают и констатируют отсутствие или наличие гемолитических свойств конструкционного стоматологического материала по наличию зоны гемолиза эритроцитов непосредственно около образца, а по ширине зоны гемолиза эритроцитов судят о величине гемолитической активности, при этом, если зона гемолиза эритроцитов формируется только в чашке Петри с кровяным агаром, засеянным чистой культурой исследуемых микроорганизмов, то констатируют наличие гемолитических свойств конструкционного стоматологического материала только в присутствии исследуемых микроорганизмов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в стоматологии для выбора конструкционного стоматологического материала при протезировании зубов.

Зубные протезы имеют ценное лечебно-профилактическое значение, однако отдаленные результаты зубного протезирования свидетельствуют, что у некоторых пациентов возникают различные патологические изменения слизистой оболочки полости рта и тканей пародонта. Это объясняется тем, что зубные протезы, оказывая лечебно-профилактическое действие, наряду с этим, являются инородными телами и отвергаемыми раздражителями полости рта. В результате они дают побочные эффекты, которые нежелательны и в тоже время неизбежны. Поэтому в настоящее время задача выявления форм влияния конструкционных стоматологических материалов на микрофлору полости рта остается актуальной.

Известен способ определения адаптации к зубным протезам (СССР а.с. N 1149966, 15.04.85., А61С 13/00), в соответствии с которым диагностируют патологическое влияние конструкционных материалов зубных протезов путем определения скорости слюнотечения и определения содержания в слюне ионов кальция, калия, натрия. Патологическое влияние конструкционных материалов зубных протезов констатируют при отсутствии нормализации данных параметров.

Недостаток известного способа заключается в снижении достоверности результатов диагностики, поскольку скорость слюноотделения и химический состав слюны для каждого человека индивидуальны, а в известном способе сравнение этих показателей идет со среднестатистическими данными. Кроме того, как на скорость слюноотделения, так и на химический состав слюны влияет рефлекторный фактор, например, съеденная перед тестированием пища. При этом способ требует затрат времени (до десяти суток) для получения окончательных результатов тестирования, что снижает его оперативность. Кроме того, известный способ не позволяет выявить, какой конкретно материал протеза оказывает патологическое влияние, а оценивает лишь общую картину, т.е. только констатирует сам факт наличия патологического влияния материалов зубных протезов, что снижает информативность известного способа и сужает его функциональные возможности.

Наиболее близким к предлагаемому является способ выполнения гемолитического тестирования конструкционного стоматологического материала, включающий приготовление объекта для исследования, приготовление питательной среды, содержащей эритроциты, помещение исследуемого объекта в питательную среду, инкубацию при температуре 37±2°С и по окончании инкубации интерпретацию результатов (Новичкова О.В., Сачина Л.А., Шахпазов Е.Х. и др., «Нержавеющая сталь «Нержстом» повышенной коррозионной стойкости для литых зубных протезов» // журнал «Панорама ортопедической стоматологии», 2007, № 2, с.12-14). Определяли наличие гемолитических свойств и гемолитическую активность конструкционного стоматологического материала стали «Нержстом». В качестве объекта для исследования использовали водную вытяжку из образцов стали, для чего образцы помещали в воду в колбы с притертым шлифом и оставляли на 15 суток. Как утверждают авторы способа, продолжительность экспозиции определялась тем, что выделяющиеся ионы легирующих элементов из стали мигрируют в модельную среду в течение первых 15 суток. Водной вытяжкой действовали на питательную среду: изолированные эритроциты кролика in vitro. Результаты показали, что вытяжки из образцов не проявили гемолитического действия: гемолиз 0,10% при допустимых значениях показателя не более 2% (Стандарты серии ГОСТ РИСО 10993 «Оценка биологического действия медицинских изделий»).

Недостаток выявленного способа состоит в том, что он позволяет выявить гемолитические свойства конструкционного стоматологического материала и оценить их только в условиях отсутствия микробной флоры, в то время как полость рта имеет широкий диапазон микробной флоры, в частности патогенной, обладающей гемолитической активностью. Это сужает функциональные возможности известного способа.

Предлагаемое изобретение решает задачу создания способа выполнения гемолитического тестирования конструкционного стоматологического материала, осуществление которого позволяет достичь технического результата, заключающегося в расширении функциональных возможностей за счет возможности выявления гемолитических свойств конструкционного стоматологического материала в присутствии микробной флоры, характерной для полости рта человека и обладающей гемолитической активностью.

Сущность заявленного способа выполнения гемолитического тестирования конструкционного стоматологического материала заключается в том, что в заявленном способе, включающем приготовление объекта для исследования, приготовление питательной среды, содержащей эритроциты, помещение исследуемого объекта на питательную среду, инкубацию при температуре 37±0,2°С и, по окончании инкубации, интерпретацию результатов, новым является то, что в качестве объекта исследования берут образцы конструкционного стоматологического материала, выполненные в форме пластин, а в качестве питательной среды берут кровяной агар с эритроцитами человека, который разливают в две чашки Петри, одну из которых засевают чистой культурой микроорганизмов, характерных для микрофлоры полости рта и обладающих гемолитической активностью, затем в каждую чашку Петри укладывают по образцу исследуемого материала, после чего обе чашки подвергают инкубации, по окончании инкубации чашки осматривают и констатируют отсутствие или наличие гемолитических свойств конструкционного стоматологического материала по наличию зоны гемолиза эритроцитов непосредственно около образца, а по ширине зоны гемолиза эритроцитов судят о величине гемолитической активности, при этом, если зона гемолиза эритроцитов формируется только в чашке Петри с кровяным агаром, засеянным чистой культурой исследуемых микроорганизмов, то констатируют наличие гемолитических свойств конструкционного стоматологического материала только в присутствии исследуемых микроорганизмов.

Технический результат достигается следующим образом. Признаки заявленного изобретения: приготовление объекта для исследования, приготовление питательной среды, содержащей эритроциты, помещение исследуемого объекта на питательную среду, инкубацию при температуре 37±0,2°С, которая соответствует температуре в ротовой полости, и по окончании инкубации осуществляют интерпретацию результатов что является обязательными условиями для выполнения заявленного способа, а следовательно, обеспечивает получение заявленного технического результата.

Использование в качестве объекта исследования непосредственно образцов конструкционного стоматологического материала позволяет смоделировать законченное стоматологическое изделие, а выполнение его в форме пластин, т.е. плоским, позволяет при помещении его на питательную среду создать оптимальные условия взаимодействия его поверхности со средой.

Благодаря тому, что в заявленном способе в качестве питательной среды берут кровяной агар с эритроцитами человека, обеспечиваются условия, приближенные к ротовой полости человека и обеспечивается возможность тестрирования наличия гемолитических свойств исследуемого конструкционного стоматологического материала, именно по отношению к эритроцитам человека.

Благодаря тому, что питательную среду в одной из чашек Петри засевают чистой культурой микроорганизмов, характерных для микрофлоры полости рта и обладающих гемолитической активностью, имитируется среда ротовой полости, а так же создаются условия для гемолитического тестирования конструкционного стоматологического материала. Известно, что поддержание воспалительного процесса в полости рта происходит в результате дисбаланса микробной флоры. Так, например, у пациентов с протезами из разнородных металлов титр лактобактерий меньше, чем в полости рта здоровых людей. При явлении гальванизма повышается высеваемость дрожжеподобных грибов рода Candida. Наличие благоприятных условий для развития микроорганизмов в полости зубодесневого кармана обуславливает у таких больных высевание гемолитических стрептокока и стафилокока как до, так и после протезирования. Например, выраженный гемолиз проявляется у патогенной микрофлоры Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus pyogenes и др. Проявление гемолитической активности возможно и у резистентной микрофлоры (Neisseria spp., Staphylococcus saprophiticus).

Поскольку питательную среду разливают в две чашки Петри, причем засевают чистой культурой микроорганизмов только одну из них, а идентичные конструкционные материалы помещают в обе, то обеспечивается возможность одновременного гемолитического тестирования исследуемого конструкционного стоматологического материала в условиях отсутствия и при наличии культуры микроорганизмов, характерных для микрофлоры полости рта и обладающих гемолитической активностью. При этом в основе тестирования используют свойство микроорганизмов, обладающих гемолитической активностью, заключающееся в наличии потенциального фактора патогенности, а именно их способность в благоприятных условиях продуцировать ферменты, вызывающие гемолиз эритроцитов, т.е. усиливать свою гемолитическую активность. Это и позволяет констатировать наличие или отсутствие гемолитических свойств конструкционного стоматологического материала по образованию зоны гемолиза эритроцитов непосредственно около образца, а по ширине зоны гемолиза эритроцитов судить о величине гемолитической активности.

Кроме того, использование двух чашек Петри с питательной средой, из которых только одна засеяна чистой культурой микроорганизмов, позволяет путем сравнения результатов исследования, достоверно их интерпретировать, в частности, повышает достоверность заключения о том, что если зона гемолиза эритроцитов формируется только в чашке Петри с кровяным агаром, засеянным чистой культурой исследуемых микроорганизмов, то констатируют наличие гемолитических свойств конструкционного стоматологического материала только в присутствии исследуемых микроорганизмов.

Время инкубации определяется временем роста посеянных микроорганизмов и выбрано в соответствии с методическими рекомендациями МУК 4.2.1890-04; «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» (Клиническая микробиологическая химеотерапия. - 2004. Т.6. - № 4. - с.306-359; утверждены и введены в действие Главным врачом РФ Онищенко Г.Г. от 04.03.2004 г.). При выполнении способа время инкубации составило 48 часов. За это время не происходит зарастания поверхности питательной среды и хорошо видны образуемые зоны гемолиза эритроцитов.

Осмотр чашек Петри по окончании инкубации позволяет интепретировать полученные результаты тестирования: констатируют наличие гемолитических свойств конструкционного стоматологического материала при наличии зоны гемолиза эритроцитов непосредственно около образца; при этом, если зона гемолиза эритроцитов формируется только в чашке Петри с кровяным агаром, засеянным чистой культурой исследуемых микроорганизмов, то констатируют наличие гемолитических свойств конструкционного стоматологического материала только в присутствии исследуемых микроорганизмов; по ширине зоны гемолиза эритроцитов судят о величине гемолитической активности.

Таким образом, заявленный способ выполнения гемолитического тестирования конструкционного стоматологического материала позволяет получить более полную характеристику материала в отношении его гемолитических свойств, так как выявляет гемолитические свойства материала в реальных условиях, характерных для микробной флоры полости рта. При этом гемолитические свойства материала проявляются опосредованно путем усиления гемолитической активности микробной флоры. Это обуславливается созданием благоприятных условий для микробной флоры, обладающей гемолитическим свойством, и, тем самым, стимуляцией ее микроорганизмов к продуцированию ферментов, вызывающих гемолиз эритроцитов.

В результате, из вышеизложенного следует, что заявленный способ выполнения гемолитического тестирования конструкционного стоматологического материала при осуществлении обеспечивает достижение технического результата, заключающегося в расширении функциональных возможностей за счет выявления гемолитических свойств конструкционного стоматологического материала в присутствии микробной флоры, характерной для полости рта человека и обладающей гемолитической активностью.

Способ осуществляют следующим образом. Приготовление объекта для исследования заключалось в изготовлении образцов конструкционного стоматологического материала, которые выполняли из известных конструкционных стоматологических материалов в форме пластин с соблюдением технологических процессов, необходимых для изготовления зубных протезов. В примерах выполнения способа образцы имели следующие размеры: 30×10×1,5 мм. В качестве образцов были использованы стоматологические конструкционные материалы, которые представлены в таблице 1. Данные о конструкционных стоматологических материалах брали из инструкции фирмы производителя.

Таблица 1.
СР Titanium Grade 4, ASTM Standard, "OROTIG" (Verona) Itali. (Титановый сплав для керамических протезов)	Ti - 99,09%, O2 - 0,45%
Fe - 0,30%, H2 - 0,01%
С - 0,10%, N2 - 0,05%
Сплав золота (ЗлПлПдСр 87,2-8,8-1,3-0,4)	Au - 87,2%
Pt - 8,8%
Pd - 1,3%
Ag - 0,4%
Серебренный припой ПСрМЦ-37 для пайки деталей зубных протезов, ЗАО «ОЭЗ ВладМиВа» Россия.	Ag - 37%, Mn, Zn, Ni, Cd, Mg, Cu
«Фторакс», «Стома» Украина (для изготовления базисов съемных пластиночных зубных протезов).	Привитый сополимер метилметакрилата (ММА) к фторкаучуку и фтористого винилидена в соотношении 1:2.
«Редонт», «Стома» Украина (для починки и реставраций съемных пластиночных зубных протезов). Сополимер метилового и	Порошок: Сополимер метилметакрилата - 98,1 %; Пероксид бензоила - 1,5%;
этилового эфиров метакриловой кислоты.	Краситель - 0,4%; Жидкость: Метилметакрилат - 98,8%; Диметилпаратолуидин - 1,2% активатор); Гидрохинон (ингибитор).
Rebaron ("GC" Япония), для проведения перебазировок съемных зубных протезов
«Синма - 74», «Стома» Украина (для несъемных протезов).	Порошок: Суспензионный привитый фторсодержащий сополимер; TiO2 (замутнитель). Жидкость: Метилметакрилат (ММА); Гидрохинон (ингибитор). Красители.
Ацетатная пластмасса «DENTAL-D» (Quattro Ti, Italia), технополимер.
Керамика «Дуцерам», («Дуцера», Германия).

В качестве питательной среды использовали кровяно-дрожжевой сывороточный агар с эритроцитами человека.

В качестве культур микроорганизмов, характерных для микрофлоры полости рта и обладающих гемолитической активностью, были использованы среды с чистой культурой микроорганизмов Streptococcus Piogenes., Neisseria spp., Streptococcus haemolyticus., Staphylococcus saprophiticus., Klebsiella oxytoca., Streptococcus aureus., Pseudomonas aeruginosa, Es. coli. Идентификацию выделенных микроорганизмов осуществляли общепринятыми методами, с учетом морфологических, культуральных и биохимических свойств.

Кровяной агар с эритроцитами человека разливали в две чашки Петри, толщиной до 4 мм. Одну из чашек Петри с питательной средой засевали чистой культурой микроорганизмов. Посев культур микроорганизмов осуществляли бактериологической петлей диаметром 2 мм полуколичественным методом (Приказ МЗ СССР № 535 от 22.04.85 г. «Об унификации микробиологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений»).

Образцы конструкционных стоматологичесих материалов подвергали дезинфекционной обработке и стерилизации в автоклаве и укладывали в каждую чашку Петри с питательной средой. После чего обе чашки подвергали инкубации в течение 48 часов при температуре 37±0,2°С. По окончании инкубации чашки осматривали и констатировали наличие или отсутствие гемолитических свойств конструкционного стоматологического материала по наличию зоны гемолиза эритроцитов непосредственно около образца, а по ширине зоны гемолиза эритроцитов судили о величине его гемолитической активности. При этом, если зона гемолиза эритроцитов формировалась только в чашке Петри с кровяным агаром, засеянным чистой культурой исследуемых микроорганизмов, то констатировали наличие гемолитических свойств конструкционного стоматологического материала только в присутствии исследуемых микроорганизмов.

Приготовление питательной среды, посев культуры, а также последовательность операций в заявленном способе выполняли в соответствии с методическими указаниями для определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (МУК 4.2.1890-04; «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» // Методические рекомендации / Клиническая микробиологическая химеотерапия - 2004. Т.6. - № 4. - с.306-359; утверждены и введены в действие Главным врачом РФ Онищенко Г.Г. от 04.03.2004 г.).

Результаты тестирования приведены в таблице 2. Конструкционные стоматологические материалы с положительным результатом тестирования представлены отдельно каждый. Материалы с отрицательными результатами тестирования объединены в одну группу (СКМ). Количество плюсов отражает ширину зоны гемолиза: с увеличением зоны гемолиза количество плюсов также возрастает.

Таблица 2.
Микроорганизмы	СКМ	напыление TiN	Сплав Ti	Сплав Au	Серебряный припой
сплавы металлов	Пластмассы
Staphylococcus aureus	-	-	+++	++	+	++
Streptococcus pyogenes	-	-	+++	++	+	+++
Neisseria spp	-	-	++	++	++	+++
Pseudomonas	-	-	+++	++	+	++
aeruginosa
Streptococcus	-	-	++	+	+++	+++
haemolyticus
Staphylococcus	-	-	+++	++	++	+++
saprophiticus
Klebsiella oxytoca	-	-	+++	++	+	+++
Es.coli	-	-	+++	++	++	+++
- отрицательная реакция; + слабо положительная; ++ положительная реакция; +++ выраженная положительная реакция.