способ выявления и определения происхождения неизвестных веществ в спиртных напитках

Формула изобретения

Способ выявления и определения происхождения неизвестных веществ в спиртных напитках, при котором готовят пробу исследуемого напитка, подвергают ее ГХ/МС анализу, регистрируют масс-спектры и ассоциированные с ними хроматограммы и проводят распознавание компонентов сравнением с базой данных эталонных аналитических характеристик напитка, отличающийся тем, что дополнительно готовят водно-спиртовую смесь состава 60/40% объемных, на ее основе готовят ряд модельных образцов путем введения в водно-спиртовую смесь каждого компонента исследуемого напитка по отдельности и анализируют модельные образцы при температуре узла ввода 180°С, 250°С и 310°С, и при обнаружении в модельном образце неизвестное вещество квалифицируют как артефакт, образующийся при анализе, а при отсутствии его в модельных образцах готовят контрольный образец путем объединения всего ряда модельных образцов, анализируют его также при температуре узла ввода 180°С, 250°С и 310°С, регистрируют масс-спектры и ассоциированные с ними хроматограммы и при отсутствии в контрольном образце найденного неизвестного вещества его квалифицируют как маркер непищевого происхождения.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к газохроматографическому анализу различных химических соединений и может быть использовано в контроле спиртных напитков.

Известен способ анализа жидких препаратов на основе растительного сырья методом хроматографии, который включает извлечение летучих веществ отгонкой исходной пробы паром, концентрирование летучих веществ экстракцией низкокипящим растворителем с последующей отгонкой растворителя и наконец собственно определение компонентов методами газовой или жидкостной хроматографии [1].

Недостатком указанного технического решения является невысокая информативность получаемых данных, в частности хроматографических спектров, что препятствует однозначной идентификации химических соединений и их фрагментов в произвольных комбинациях.

Известен также способ хроматографической идентификации компонентов сложных смесей органических соединений, включающий пропускание вещества через систему последовательно соединенных колонок, заполненных сорбентом различной полярности, отбор пробы после каждой колонки, детектирование на детекторах различных типов и идентификацию определяемого вещества расчетом коэффициента чувствительности и относительного удерживания по данным двух детекторов [2].

К недостаткам указанного способа следует отнести сложность процедуры анализа, а также вероятность получения недостоверных результатов при расчетах значений удерживания разных колонок.

Известен также способ идентификации неизвестных веществ методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией. По указанному способу регистрируют хроматограмму как функцию времени удерживания и регистрируют масс-спектр в период времени, соответствующий выходу вещества из колонки, и сравнивают с масс-спектрами известных веществ, находящимися в базе данных, далее определяют индекс удерживания и сравнивают его с таковыми из базы данных и идентифицируют вещество по двум параметрам - масс-спектру и индексу удерживания [3].

Недостатком указанного способа несмотря на привлекательность использования индекса удерживания является высокая вероятность получения недостоверных результатов анализа, поскольку индексы удерживания изначально привязаны к конкретной колонке с определенными параметрами и зачастую либо не воспроизводятся либо воспроизводятся на другом оборудовании с искажением, что может привести к недостоверной интерпретации результатов анализа.

Наиболее близким аналогом к заявляемому техническому решению является способ осуществления масс-спектрального анализа многокомпонентной системы, заключающийся в регистрации масс-спектров образца, деконвалюции масс-спектров и ассоциированных с ними хроматограмм одного вещества и распознавании сравнением со справочным спектром вещества, сравнением интенсивностей пиков и времени удерживания распознанных веществ с предварительно определенными параметрами искомого вещества с подтверждением распознавания [4].

Недостатком указанного способа является низкий порог чувствительности определения, заключающийся в том, что он не позволяет определять исследуемые вещества при низких концентрациях, и вытекающая из этого высокая вероятность получения недостоверных результатов анализа при таком двухстадийном распознавании.

Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является обеспечение возможности однозначной идентификации химических соединений и их фрагментов и установление происхождения указанных химических соединений при одновременном повышении точности и оперативности определения.

Поставленный технический результат достигается тем, что дополнительно готовят водно-спиртовую смесь состава 60/40 % объемных, на ее основе готовят ряд модельных образцов путем введения в водно-спиртовую смесь каждого компонента исследуемого напитка по отдельности и анализируют модельные образцы при температуре узла ввода 180°C, 250°C и 310°C, и при обнаружении в модельном образце неизвестное вещество квалифицируют как артефакт, образующийся при анализе, а при отсутствии его в модельных образцах готовят контрольный образец путем объединения всего ряда модельных образцов, анализируют его также при температуре узла ввода 180°C, 250°C и 310°C, регистрируют масс-спектры и ассоциированные с ними хроматограммы и при отсутствии в контрольном образце найденного неизвестного вещества его квалифицируют как маркер непищевого происхождения.

Следует отметить, что заявляемый способ также может быть осуществлен с использованием аналитической системы ВЭЖХ-МС/МС, поскольку принципиальными положениями заявляемого технического решения являются пробоподготовка, проведение анализа в различных режимах кондиционирования параметров по градиенту температуры, выбор объектов анализа и последующая идентификация определяемых веществ сопоставлением результатов анализа с базовыми данными эталонных веществ.

В качестве исследуемого спиртного напитка может быть использован весь спектр доступных спиртосодержащих жидкостей.

В качестве аналитической системы ГХ-МС могут быть использованы например хромато-масс-спектрометр с квадрупольным анализатором Agilent-5973, соединенным с газовым хроматографом модели Agilent-6890.

В качестве вспомогательного оборудования могут быть использованы:

- автоматический шейкер фирмы Glas-Col®, США для ЖЖЭ;

- центрифуга марки Rotina 46R фирмы Hettich, (ФРГ), для получения контрастной поверхности раздела между органической и водной фазами;

- вакуумный концентратор фирмы Barnstead Inc.(CLUA) для упаривания органического экстракта;

- колонки типа FFAP для хроматографического разделения.

Разумеется, для реализации заявленного изобретения могут быть использованы и другие приборы и устройства с характеристиками, аналогичными вышеуказанным.

В качестве газа-носителя может быть использован гелий, азот или водород.

В качестве внутренних стандартов (ВС) используют циклогексанол или др. подходящее соединение.

Ионизацию осуществляют методом электронного удара в вакууме. Детектирование определяемых веществ проводят в режиме регистрации полного сканирования или по выбранным ионам.

Обработку данных проводят с применением программы автоматической обработки AMDIS и баз данных.

В принципе поиск, обнаружение и определение происхождения неизвестных веществ необходимо осуществлять для того, чтобы найти новые, неизвестные ранее маркеры, которые могут отвечать за качество спиртных напитков или же могут быть свидетелями фальсификации спиртного напитка.

Что касается порядка действий при осуществлении заявляемого технического решения, то авторы, основываясь на своих знаниях и опыте, полагают целесообразным осуществлять поиск в следующей последовательности:

- поиск и обнаружение неизвестного вещества (ГХ-МС анализ пробы исследуемого спиртного напитка при градиенте температуры 10°C/мин);

- выявление неизвестного вещества как продукта деструкции компонента(ов) исследуемого спиртного напитка (ГХ-МС анализ ряда модельных образцов водно-спиртовая смесь + компонент исследуемого напитка при температуре узла ввода 180°C, 250°C и 310°C);

- выявление неизвестного вещества как примеси или продукта распада компонентов контрольного образца (ГХ-МС анализ контрольного образца при температуре узла ввода 180°C, 250°C и 310°C).

Изобретение может быть осуществлено следующим образом.

Предварительно, для создания базы данных готовят образцы известных напитков-эталонов. Снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики их (детектируют не менее трех характеристических ионов каждого компонента, определяют время удержания, молекулярную массу, прекурсор-ионы, характеристичные ионы, нижний предел обнаружения). Из полученных данных формируют базу. Отдельно формируют базу данных фоновых лабораторных загрязнений и приборный фон.

Готовят раствор внутреннего стандарта, далее проводят пробоподготовку, при которой в образец исследуемого спиртного напитка вводят раствор внутреннего стандарта, доводят pH образца до 9,0 твердым буфером, проводят жидкостно-жидкостную экстракцию смесью органических растворителей различной полярности, органический слой выпаривают досуха в токе азота, перерастворяют в этилацетате и далее пробу вводят в систему ГХ-МС. Снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики пробы. Полученные результаты анализа сравнивают с базой данных и выявляют признаки неизвестного вещества (НВ). Затем проверяют вероятность присутствия НВ в каждом компоненте исследуемого спиртного напитка, для чего готовят водно-спиртовую смесь состава 60/40 об.% и на ее основе ряд модельных проб состава водно-спиртовая смесь - компонент исследуемого спиртового напитка. Каждую пробу вводят в систему ГХ-МС, снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики пробы при температуре узла ввода 180°C, 250°C и 310°C и определяют наличие НВ. Далее смешивают весь ряд модельных проб и полученный таким образом контрольный образец вводят в систему ГХ-МС, снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики контрольного образца также при температуре узла ввода 180°C, 250°C и 310°C. При отсутствии в контрольном образце найденного неизвестного вещества его квалифицируют как маркер непищевого происхождения.

Для лучшего понимания изобретение может быть проиллюстрировано, но не исчерпано следующими примерами его конкретного осуществления.

Пример 1.

Определение неизвестных веществ в коньяке.

А. Подготовка и анализ проб эталонного и исследуемого образца на наличие летучих соединений.

В качестве внутреннего стандарта используют раствор циклогексанола в этаноле с концентрацией 0,1 об.%. К 1 мл эталонного коньяка добавляют 30 мкл внутреннего стандарта до концентрации 28 мг/л и пробу вводят в систему ГХ-МС с колонкой FFAP.

Аналогично готовят и анализируют пробу исследуемого коньяка.

Анализ проводят на хромато-масс-спектрометрической системе Agilent 6890/5973N с масс-селективным детектором (регистрируют масс-спектр квадрупольный и масс-спектр «ионная ловушка»). Процесс ведут при следующих параметрах: температура узла ввода пробы - 180°C, аналитического интерфейса 190°C. Разделение проводят на кварцевой капиллярной колонке с неподвижной фазой (НФ) HP-FFAP длиной 50 м, внутренним диаметром 0,32 мм, толщина пленки неподвижной фазы 0,5 мкм. Скорость потока газа-носителя 1,2 мл/мин, средняя линейная скорость газа-носителя 32 см/сек. Объем вводимой пробы 1 мкл при делении потока 1/10. Температурная программа: 60°C (4 мин), 10°C/мин, 190°C, (40 мин). Регистрацию сигнала проводят по полному ионному току (SCAN) в диапазоне масс m/z 29 - 300 а.е.м. Время удерживания внутреннего стандарта составляет 4,52 мин. При использовании метода ГХ-ДИП анализ проводят в аналогичных условиях. Время удерживания внутреннего стандарта составляет 9,27 мин. Газ-носитель - азот. Количественный анализ проводят по выбранным ионам.

Б. Подготовка и анализ проб эталонного и исследуемого образца на наличие маркеров возраста.

К пробе эталонного коньяка (3 мл) добавляют 100 мкл внутреннего стандарта (раствор ортованилина в этаноле, 2 мг/л), экстрагируют 3 мл смеси гексан/диэтиловый эфир 1:1. Экстракт упаривают, добавляют 100 мкл этилацетата и 1 мкл пробы вводят в систему ГХ-МС с колонкой HP-5MS.

Аналогично готовят и анализируют пробу исследуемого коньяка. Снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики проб (детектируют не менее трех характеристических ионов каждого эталонного вещества, определяют время удержания, молекулярную массу, прекурсор-ионы, характеристичные ионы, нижний предел обнаружения).

По результатам анализа в исследуемом коньяке (см. Таблицу 1) найдено два вещества, идентифицированные как не характерные для коньяка.

Таблица 1
Время удерживания	Масс-спектр	Содержание	Предполагаемое вещество*
24,56 мин	103, 116, 145	8 нг/мкл	триацетин
26,75 мин	31, 43, 60, 172	6 нг/мкл
* - найдено по базе данных

Далее готовят водно-спиртовую (коньячный спирт соответствующей выдержки) смесь состава 60/40 об.% и на основе указанной смеси готовят ряд проб индивидуальных компонентов эталонного коньяка, в том числе:

водно-спиртовая смесь + этилгексеналь

водно-спиртовая смесь + диэтилкротональ

водно-спиртовая смесь + этиллактат

водно-спиртовая смесь + ванилин

водно-спиртовая смесь + сахароза

водно-спиртовая смесь + эвгенол

Каждую пробу вводят в систему ГХ-МС, снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики пробы при температуре узла ввода 180°C, 250°C и 310°C.

При анализе пробы водно-спиртовая смесь + сахароза обнаружено неизвестное вещество с параметрами: время удерживания 26,75 мин; характеристичные ионы 31, 43, 60, 172. Указанное вещество, таким образом, является продуктом термического разложения сахарозы в инжекторе хроматографа. По базе данных вещество определяют как димер 1,3-дигидроксиацетона. Полный анализ компонентов эталонного коньяка по отдельности и в совокупности не выявил наличия второго неизвестного вещества. По базе данных установлено, что указанное вещество это триацетин. Известно, что триацетин - непременный компонент искусственных ароматизаторов. По результатам анализа триацетин классифицируют как маркер непищевого происхождения.

Пример 2

Определение неизвестных веществ в водке.

Подготовку проб эталонной и исследуемой водок ведут, как в Примере 1. Анализ ведут, как в части Б Примера 1.

Результаты анализа представлены в Таблице 2.

Таблица 2
Время удерживания	Масс-спектр	Содержание	Предполагаемое вещество*
33,85	122, 105, 77	13,0
40,76	212, 194, 167, 105	8,5
45,02	234, 120, 86	7,6

Далее готовят эталонную водно-спиртовую смесь состава 60/40 об.% (в соответствии с рецептурой исследуемой водки) и анализируют пробу, как в примере 1. В контрольной пробе неизвестные вещества не были обнаружены. По базе данных найденные в исследуемой водке неизвестные вещества представляют собой бензойную кислоту, бензоил-бензоат и лидокаин соответственно и являются продуктами термического разложения битрекса - денатурирующей добавки к спиртам и квалифицируются по результатам анализа как маркеры непищевого происхождения.

Пример 3.

Определение неизвестных веществ в водке.

Подготовку проб эталонной и исследуемой водок ведут, как в Примере 2. Анализ ведут, как в части Б Примера 1.

Результаты анализа представлены в Таблице 3.

Таблица 3
Время удерживания	Масс-спектр	Содержание	Предполагаемое вещество*
39,45	222, 177, 149	34,7

В контрольной пробе неизвестное вещество не было обнаружено. По базе данных найденное в исследуемой водке неизвестное вещество представляет собой диэтилфталат.

В то же время диэтилфталат и другие эфиры фталевой кислоты являются типичными представителями лабораторных загрязнений (инжекторы, посуда и т.п.) и поэтому для квалифицированного определения происхождения найденного диметилфталата требуется провести контрольное определение уровня лабораторных загрязнений. Анализ ведут при следующих параметрах: 100°C (1 мин), 35°C/мин, 300°C, (20 мин), колонка HP-5MS.

Результаты анализа лабораторных загрязнений представлены в Таблице 4.

По результатам анализа квалифицировать обнаруженное в исследуемой водке неизвестное вещество - диметилфталат - квалифицируют как маркер непищевого происхождения, денатурирующая добавка к спирту.

Как видно из описания и приведенных примеров осуществления способа, заявляемое техническое решение обеспечивает возможность однозначной идентификации химических соединений и их фрагментов, позволяет установить происхождение указанных химических соединений при одновременном повышении точности и оперативности определения.

Источники информации

1. RU 2093822 С1, М.кл. G01N 30/04, опубл. 1997 г.

2. RU 2069363 С1, М.кл. G01N 30/02, опубл. 1996 г.

3. WO 2004/104571, М.кл. G01N 30/00, опубл. 2004 г.

4. ЕР 1846757 А2, М.кл. G01N 30/86, опубл. 2007 г. - ближайший аналог.