фрагменты двуцепочечной рнк, обладающие антипролиферативной и интерферон-индуцирующей активностями

Формула изобретения

Фрагменты двуцепочечной РНК длиной 22-нуклеотида, содержащие тринуклеотидные выступающие 3'-концы, состоящие из нуклеотидных цепей следующей последовательности:

5'-AAAN₁ N₂N₃N₄N₅N₆ N₇GCCUGACACUUU/A-3'

5'-GUGUCAGGCN ₁₄N₁₃N₁₂N₁₁N₁₀ N₉N₈UUUUUU/A-3',

где N ₁-N₇ комплементарны N₈-N₁₄ соответственно, обладающие антипролиферативной и интерферон-индуцирующей активностями.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано в медицине и фармацевтической промышленности.

Онкологические заболевания являются одной из основных проблем современной медицины. Существующие на данный момент схемы лечения злокачественных опухолей используют хирургические методы в комплексе с высокодозной агрессивной химиотерапией, серьезным недостатком которой является высокая токсичность современных противоопухолевых препаратов в отношении жизненно важных органов и систем организма. Сопутствующие побочные эффекты снижают эффективность, а в ряде случаев, ограничивают применение противоопухолевых средств. Другой проблемой в лечении онкологических заболеваний является проблема остаточного опухолевого клона. Опухолевые клетки, пережившие химиотерапию, обычно проявляют лекарственную устойчивость к широкому кругу препаратов и вызывают рецидив заболевания в более тяжелой форме. В связи со всем вышесказанным, актуальной задачей является поиск новых противоопухолевых препаратов, обеспечивающих высокую избирательность и эффективность лечения.

Известно, что в клетках млекопитающих длинные двуцепочечные РНК (дцРНК) [Oates А.С., Bruce А.Е., Но R.K. // Dev. Biol. 2000, 224, 20-28] и некоторые короткие дцРНК (siPHK), содержащие определенные мотивы в их последовательности, могут вызывать неспецифический интерфероновый ответ [Persengiev S.P., Zhu X., Green M.R. // RNA, 2004, 10, 12-18; Eberly F., Giebler K., Deck C, Heeg K., Peter M., Richert C, Dalpke A. // J. Immunol. 2008, 180, 3229-3237]. В случае специфического ингибирования экспрессии определенных мРНК с помощью siPHK по механизму РНК-интерференции индукция интерферонового ответа является нежелательным побочным эффектом, однако сама по себе она имеет большое терапевтическое значение, т.к. приводит к ингибированию пролиферации опухолевых клеток, их дифференцировке или апоптозу. Результаты исследований свидетельствуют, что некоторые siPHK, действующие по механизму РНК-интерференции или активирующие иммунный ответ, могут стать основой препаратов для терапии онкологических заболеваний.

Одними из важных направлений в медицинской химии являются разработка и использование иммуномодулирующих препаратов на основе интерферонов. В настоящее время уже доказана важная роль иммунотерапии в онкологии после операций. Однако применение препаратов интерферона ограничено такими факторами, как их пирогенность и аллергенность, опасность возникновения аутоиммунных процессов и необходимость многократного введения суточной дозы [Новиков В.И. Иммунотерапия при злокачественных новообразованиях // М., 1997]. Этих недостатков лишены индукторы эндогенного интерферона, одним из которых является дцРНК. Интерфероногенная активность препаратов дцРНК интенсивно исследуется в связи с попытками создать на их основе терапевтические препараты для лечения вирусных и опухолевых заболеваний. Известен целый ряд индукторов интерферона, которые применяются в терапии как иммуномодулирующие, противовирусные и антипролиферативные препараты.

Наиболее ближайшим к заявляемому изобретению - прототипом, является двуцепочечная РНК из киллерных штаммов дрожжей, обладающая интерферон-индуцирующей активностью. На основе данной дцРНК создан препарат («Ридостин»), представляющий собой липосомальную композицию на основе водно-солевого раствора дцРНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae с pH 6,5-7,5 или лиофилизат, проявляющие выраженную противовирусную активность в отношении различных форм герпесной и хламидиозной инфекций (Патент РФ 2083221, кл. А61К 38/20, 1997 г.).

Недостатками активного агента и фармацевтической композиции являются довольно высокое содержание дцРНК (5-15%), что является причиной повышенной токсичности композиции и проявления мутагенного эффекта; быстрое выведение активного компонента из организма (в течение 24 ч), что требует частого его приема для поддержания терапевтической дозы. Поскольку препараты нуклеиновых кислот относятся к классу нестабильных высокотоксичных соединений, то увеличение дозировок ведет к усилению побочных эффектов.

Технической задачей изобретения является создание новых эффективных, низкотоксичных соединений на основе дцРНК, обладающих антипролиферативной и интерферон-индуцирующей активностями.

Поставленная техническая задача решается предлагаемыми фрагментами двуцепочечной РНК длиной 22-нуклеотида, содержащими тринуклеотидные выступающие 3'-концы, со следующей оригинальной нуклеотидной последовательностью (1):

5'-AAAN₁N₂N ₃N₄N₅N₆N₇GCCUGACACUUU/A-3'

3'-A/UUUUUUN₈N₉N₁₀ N₁₁N₁₂N₁₃N₁₄CGGACUGUG-5',

где N₁-N₇ комплементарны N ₈-N₁₄, соответственно, обладающими антипролиферативной и интерферон-индуцирующей активностями.

Предлагаемые фрагменты представляют собой двуцепочечные молекулы РНК длиной 22 нуклеотида, имеющие на 3'-концах выступы из 3 нуклеотидов. Данные фрагменты получают объединением двух цепей определенной последовательности (1), где N_1-7 любой рибонуклеотид,

a N_8-14=А, G, U, С, если N_n-7 =U, С, A, G, соответственно.

Было исследовано влияние заявляемых фрагментов дцРНК (1) на пролиферацию клеток карциномы, нейробластомы и опухолевых клеток почки эмбриона человека. Исследована динамика изменения экспрессии генов-маркеров интерферонового ответа, а также интерферон-чувствительных генов под действием заявляемых фрагментов дцРНК (1).

В результате было установлено, что заявляемые фрагменты дцРНК (1) проявляют высокую антипролиферативную активность по отношению ко всем исследованным опухолевым клеточным культурам. При исследовании цитотоксичности соединений (1) по отношению к использованным опухолевым клеткам были получены значения IC50, концентрации соединения, при котором наблюдается гибель 50% клеток. Показано, что значения IC50 для соединений (1) имеют сходный порядок величины для всех опухолевых клеток и лежат в диапазоне 45-200 нМ. Полученные данные по антипролиферативной активности соединений (1) позволяют рассматривать их как перспективные противоопухолевые агенты.

Под действием как контрольного индуктора интерферона poly(I:C), так и заявляемых фрагментов дцРНК (1) происходит активация экспрессии гена-маркера интерферонового ответа PKR и подавление экспрессии интерферон-чувствительных генов с-mус и -актина. Полученные данные свидетельствуют об интерферон-индуцирующей активности исследуемых фрагментов дцРНК (1).

На основе предлагаемых соединений могут быть созданы фармацевтические композиции, содержащие в своем составе в качестве активного агента по меньшей мере один фрагмент дцРНК, описанный выше (1), и фармацевтически приемлимый носитель. В качестве фармацевтически пригодного носителя могут быть использованы катионные липиды и катионные полимеры, облегчающие проникновение заявляемого фрагмента дцРНК в клетку. Для терапевтического применения данные композиции могут быть выполнены в форме раствора, например инъекционного, крема, мази, таблетки, суспензии и т.п. Композицию можно вводить любым подходящим способом, например инъекцией, пероральным, местным, назальным, ректальным введением.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими фигурами и примерами.

Пример 1. Синтез фрагментов двуцепочечной РНК.

Для сравнительного исследования влияния заявляемых фрагментов дцРНК (1) на пролиферацию клеток карциномы человека КВ-3-1 были синтезированы пять фрагментов дцРНК (1.1-1.5), последовательность которых соответствует общей формуле заявляемых фрагментов дцРНК (1), и три контрольных фрагмента (контроль 1 - контроль 3), последовательности которых не соответствуют общей формуле заявляемых фрагментов дцРНК (1).

Фрагменты дцРНК синтезировали твердофазным фосфитамидным методом [Damha M.J., Ogilvie K.K. // Methods Mol. Biol. 1993, 20, 81-114] на автоматическом синтезаторе ASM-102U ("Биоссет", Россия), очищали с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях с последующим обессоливанием на картридже Sep-Pak С18 ("Millipore", США) и осаждали этанолом в присутствии 0.3 М ацетата натрия. Строение фрагментов РНК подтверждали с помощью секвенирования по [Donis-Keller Н., Maxam A.M., Gilbert W. // Nucleic Acids Res. 1977, 4, 2527-2538] и MALDI-TOF масс-спектрометрии. Последовательности и обозначения синтезированных фрагментов дцРНК приведены в таблице 1.

Пример 2. Влияние фрагментов двуцепочечной РНК 1.1-1.5 на пролиферацию клеток карциномы человека КВ-3-1.

Клетки линии КВ-3-1 (эпидермоидная карцинома ротовой полости) культивировали в среде DMEM, содержащей 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, антибиотики (100 ед./мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина) и антимикотик амфотерицин (0.25 мкг/мл), в атмосфере 5%-ного CO₂ при 37°С.

Количество живых клеток после инкубации с фрагментами 1.1-1.5 и Контроль 1 - Контроль 3 (Табл.1) определяли с помощью МТТ теста, который основан на способности митохондриальных дегидрогеназ живых клеток превращать водорастворимые соли тетразолия в ярко окрашенные кристаллы формазана, что позволяет спектрофотометрически оценивать количество живых клеток в препарате. Для этого клетки КВ-3-1 высаживали в 96-луночные планшеты (1000 клеток на лунку). Через 24 ч в лунках меняли среду на свежую среду DMEM без сыворотки и антибиотиков и клетки трансфицировали с помощью препарата из группы катионных липидов Липофектамина2000 (согласно протоколу производителя) фрагментами 1.1-1.5 и Контроль 1 - Контроль 3 (конечная концентрация фрагментов в среде варьировала от 25 до 200 нМ). Клетки инкубировали с комплексами фрагментов с катионным липидом в среде без сыворотки и антибиотиков в атмосфере 5%-ного СО₂ при 37°С в течение 4 ч, после чего добавляли эмбриональную телячью сыворотку до концентрации 10% и инкубировали в тех же условиях в течение еще 72 ч. По окончании инкубации, без смены среды, к клеткам добавляли раствор МТТ (5 мг/мл) в фосфатно-солевом буфере до концентрации 0.5 мг/мл и инкубировали в течение 3 ч в тех же условиях. Среду удаляли, к клеткам добавляли по 100 мкл ДМСО, в котором происходит растворение образовавшихся в клетках кристаллов формазана, и измеряли оптическую плотность на многоканальном спектрофотометре Multiscan RC (Labsystems) на длинах волн 570 и 620 нм, где А₅₇₀ - поглощение формазана, а А₆₂₀ - фон клеток.

Данные представляли в виде количества живых клеток в пробе относительно контроля. За 100% принимали количество клеток в контроле, где клетки инкубировали в течение 72 ч в отсутствие соединения, но в присутствии Липофектамина2000 (фиг.1).

Из данных, приведенных на фиг.1 видно, что при трансфекции клеток КВ-3-1 фрагментами дцРНК 1.1-1.5 в концентрации 200 нМ наблюдается эффективное снижение количества живых клеток до 30-50% относительно контроля. Наиболее эффективным ингибитором пролиферации является фрагмент дцРНК (1.3), значение IC₅₀ для которого составило 46 нМ. Значения IC₅₀ - концентрация соединения, при которой количество клеток сокращается на 50% - приведены в таблице 2. Из данных, приведенных на фиг.1, видно, что внесение замен в структуру фрагмента двуцепочечной РНК 1.3 в позиции 10-16 (соединения 1.4 и 1.5) не значительно снижает антипролиферативную активность соединений, в то время как замены 3'-концевых нуклеотидов A/U на G/C (Контроль 2, Контроль 3) или удаление этих нуклеотидов (Контроль 1) приводит к полному исчезновению антипролиферативного действия исследуемых фрагментов дцРНК. Далее проводили исследование фрагмента дцРНК 1.3, проявляющего наибольшую антипролиферативную и интерферон-индуцирующую активность.

Пример 3. Влияние фрагмента дцРНК 1.3 на пролиферацию клеток нейробластомы человека SK-N-MC.

Клетки линии SK-N-MC (нейробластома) культивировали в среде DMEM, содержащей 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, антибиотики (100 ед./мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина) и антимикотик амфотерицин (0.25 мкг/мл), в атмосфере 5%-ного СО₂ при 37°С.

Жизнеспособность клеток после инкубации с фрагментом дцРНК 1.3 в комплексе с олигофектамином определяли с помощью МТТ теста, как описано в примере 2, за исключением того, что для трансфекции использовали другой препарат из группы катионных липидов (олигофектамин) и клетки высаживали в 96-луночные планшеты в количестве 10000 клеток на лунку.

Данные представляли в виде количества живых клеток относительно контроля. За 100% принимали количество клеток в контроле, где клетки инкубировали в течение 72 ч в отсутствие соединения, но в присутствии олигофектамина (фиг.2). Из данных, приведенных на фиг.2 видно, что при трансфекции клеток SK-N-MC фрагментом дцРНК 1.3 наблюдается эффективное снижение количества клеток уже при концентрации фрагмента 75-150 нМ, что подтверждает его высокий антипролиферативный потенциал. Значение IC₅₀ , полученное для данной клеточной линии, составило 88 нМ.

Пример 4. Влияние фрагмента дцРНК 1.3 на пролиферацию клеток почки эмбриона человека 293.

Клетки линии 293 культивировали в среде DMEM, содержащей 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, антибиотики (100 ед./мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина) и антимикотик амфотерицин (0.25 мкг/мл), в атмосфере 5%-ного СО₂ при 37°С.

Количество живых клеток после инкубации с фрагментом дцРНК 1.3 определяли с помощью МТТ теста, как описано в примере 2. Для этого клетки высаживали в 96-луночные планшеты (3000 клеток на лунку). Далее как в примере 2.

Данные представляли в виде количества живых клеток относительно контроля. За 100% принимали количество клеток в контроле, где клетки инкубировали в течение 72 ч в отсутствие фрагментов РНК, но в присутствии Липофектамина2000 (Фиг.3). Из данных, приведенных на фиг.3 видно, что при трансфекции клеток SK-N-MC фрагментом дцРНК 1.3 наблюдается эффективное снижение количества живых клеток уже при концентрации фрагмента 100-200 нМ, что подтверждает его высокий антипролиферативный потенциал. Значение IC₅₀, полученное для данной клеточной линии, составило 165 нМ.

Пример 5. Активация экспрессии гена-маркера интерферонового ответа PKR под действием фрагмента дцРНК 1.3.

При развитии неспецифического интерферонового ответа в клетках млекопитающих повышается уровень экспрессии протеинкиназы R (PKR) [Stark G.R., Kerr I.M., Williams B.R., Silverman R.H., Schreiber R.D. // Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 227-264]. Экспрессия этого гена часто используется для мониторинга возможных интерферон-индуцирующих эффектов малых интерферирующих РНК. Для исследования интерферон-индуцирующей активности фрагмента дцРНК 1.3 оценивали уровень экспрессии PKR с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени, в качестве контрольного индуктора интерферонового ответа использовали коммерчески доступный препарат poly(I:C).

Клетки КВ-3-1 культивировали, высаживали в 24-луночные планшеты (10000 клеток на лунку) и трансфицировали с помощью Липофектамина2000 фрагментом дцРНК 1.3 (150 нМ) и poly(I:C) (0,05 мкг/мл), как описано в примере 2.

Суммарную клеточную РНК выделяли из культивируемых клеток линии КВ-3-1 через 24, 48 или 72 ч после трансфекции методом [Chattopadhyay N., Kher R., Godbole M. // Biotechniques 1993, 15, 24-26]. Чтобы предотвратить деградацию РНК, все операции по ее выделению проводили на льду. Клетки (10⁵-10⁶) осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин при 4°С (центрифуга "Contron"). Супернатант удаляли, клетки промывали PBS и лизировали в 200 мкл 1%-ного SDS. К смеси добавляли 1/10 объема 2 М ацетата натрия, рН 4.5 и 2 объема (400 мкл) фенола, уравновешенного водой, тщательно перемешивали. Водную фазу отделяли центрифугированием (12000 об/мин, 10 мин, центрифуга "Eppendorf") и экстрагировали равным объемом фенол/хлороформ (1:1). РНК осаждали из раствора этанолом (2.5-3 объема) в присутствии 0.3 М ацетата натрия (рН 4.5) и инкубировали для формирования осадка в течение 12 ч при -20°С. Осадок РНК отделяли центрифугированием (13000 об/мин, 4°С, 15 мин, центрифуга "Contron"), промывали 75%-ным этанолом, высушивали и растворяли в автоклавированной воде, хранили при -20°С. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически из расчета, что 1 мг/мл РНК=25 OE₂₆₀/мл. Чистоту препарата определяли по соотношению оптических плотностей при 260 нм и 280 нм.

кДНК получали методом обратной транскрипции в реакционной смеси, содержащей ОТ-буфер (50 мМ Трис-HCl, pH 8.3, 3 мМ MgCl₂, 5 мМ DTT, 75 мМ KCl), 0.05 мкг/мкл суммарной РНК, 5 мкМ праймер d(T)₁₅, 0.5 мМ dNTP и 0.5 е.а./мкл РНК-зависимой ДНК-полимеразы M-MuLV. Реакцию синтеза кДНК проводили при 42°С в течение 1 ч.

Полимеразную цепную реакцию проводили в реакционной смеси объемом 20 мкл, содержащей 250 мкМ каждого из dNTP, 0.25 мкМ прямого и обратного праймера, кДНК, полученную с 25 нг суммарной клеточной РНК, фирменный раствор SYBR Green I в разведении 1:20000 и 2 е.а. Taq-ДНК-полимеразы в буфере ПЦР (10 мМ Трис-HCl, рН 8.3, 50 мМ KCl, 1.5 мМ MgCl ₂, 0.01%-ный Твин-20). ПЦР в реальном времени проводили на амплификаторе с оптическим модулем iCycler (Bio-Rad, США). Количество образующегося продукта оценивали по интенсивности флуоресценции, связанной с интеркаляцией SYBR Green I в двуцепочечную ДНК. Эффективность амплификации каждого ПЦР-продукта определяли по калибровочным кривым, построенным по серии разведений образцов контрольной кДНК. Эффективности амплификации ПЦР-продуктов были близки и лежали в диапазоне 1.75<Е<2. Для каждого экспериментального образца кДНК выполняли 3 повтора, определяя количество образующегося продукта как среднее арифметическое для каждого из них. Образование специфического продукта подтверждалось кривыми плавления и электрофорезом в 1.5%-ном агарозном геле.

Проводили 40 циклов амплификации по следующей программе: 95°С - 30 с, 58°С - 30 с, 72°С - 30 с, температура плавления ПЦР-продукта T_m-3°С - 15 с (измерение флуоресценции). T _m предварительно определялась путем анализа кривой плавления ПЦР-продукта в диапазоне 55°С-95°С с шагом в 0.5°С.

Количество специфического ПЦР-продукта гена PKR определяли относительно ПЦР-продукта ₂-микроглобулина с помощью программы "pfaffl-spread (http://pathmicro.med.sc.edu/pcr/pcr-pfaffl.htm). Относительный уровень мРНК гена PKR в клетках определяли с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени через 24 ч (белые столбцы), 48 ч (серые столбцы) и 72 ч (черные столбцы) после трансфекции с помощью Липофектамина2000 фрагмента дцРНК 1.3 (150 нМ) или poly(I:C) (0.05 мкг/мл). Соотношение PKR/beta2m в контроле принимали за 1, стандартное отклонение определяли по результатам трех независимых экспериментов (фиг.4).

Из данных, приведенных на фиг.4, видно, что при трансфекции клеток КВ-3-1 фрагментом дцРНК 1.3 (150 нМ) и poly(I:C) (0,05 мкг/мл) наблюдается 10- и 25-кратное повышение уровня PKR мРНК, соответственно. Полученные данные по активации экспрессии PKR свидетельствуют об интерферон-индуцирующей активности исследуемого фрагмента дцРНК 1.3.

Пример 6. Ингибирование экспрессии интерферон-чувствительных генов - с-mус и -актина под действием фрагмента дцРНК 1.3.

Известно, что экспрессия генов, кодирующих актины, которые играют ключевую роль в митотическом делении и в создании архитектуры клетки, так же как и экспрессия генов семейства mус является интерферон-чувствительной [Chang Х.М., Chang Y., Jia A.A. // World J. Gastroenterol. 2005, 11, 2634-2636; Einat M., Resnitzky D., Kimchi A. // Nature 1985, 313, 597-600; Yarden A. & Kimchi A. // Science 1986, 234, 1419-1421; Kimchi A. // J. CellBiochem. 1992, 50, 1-9].

Для исследования интерферон-индуцирующей активности фрагмента дцРНК 1.3 в клетках линии КВ-3-1 оценивали уровни экспрессии генов -актина и с-mус с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени, в качестве контрольного индуктора эндогенного интерферона использовали коммерчески доступный препарат poly(I:C).

Клетки КВ-3-1 культивировали, высаживали в 24-луночные планшеты (10000 клеток на лунку) и трансфицировали с помощью Липофектамина2000 фрагмент дцРНК 1.3 (150 нМ) и poly(I:C) (0,05 мкг/мл), как описано в примере 2.

Суммарную клеточную РНК выделяли из культивируемых клеток линии КВ-3-1 через 72 ч после трансфекции методом [Chattopadhyay N., Kher R., Godbole M. // Biotechniques 1993, 15, 24-26], как описано в примере 5. ОТ-ПЦР в реальном времени проводили аналогично условиям, описанным в примере 5.

Количество специфических ПЦР-продуктов генов с-mус и -актина определяли относительно ПЦР-продукта ₂-микроглобулина с помощью программы "pfaffl-spread" (http://pathmicro.med.sc.edu/pcr/pcr-pfaffl.htm). За 1 принимали относительный уровень мРНК генов с-mус и -актина в контроле, где клетки инкубировали в течение 72 ч в отсутствие соединений, но в присутствии олигофектамина (фиг.5). Из данных, приведенных на фиг.5 видно, что при трансфекции клеток КВ-3-1 как контрольным индуктором интерферона poly(I:C), так и исследуемым фрагментом дцРНК 1.3 наблюдается концентрационно-зависимое снижение уровней мРНК исследуемых генов. Так, через 72 ч после трансфекции клеток КВ-3-1 фрагментом дцРНК 1.3 (150 нМ, что соответствует примерно 2,2 мкг/мл) и poly(I:С) (0,25 мкг/мл) наблюдается снижение уровня мРНК -актина на 80 и 85%, а также уровня мРНК с-mус на 80 и 70%, соответственно. Полученные данные по снижению уровней экспрессии интерферон-чувствительных генов с-mус и -актина подтверждают потенциал фрагмента дцРНК 1.3 как индуктора интерферонового ответа.

Таким образом, приведенные примеры однозначно указывают на высокую антипролиферативную и интерферон-индуцирующую активность фрагментов дцРНК (1), что позволяет использовать их в качестве активных компонентов для разработки лекарственных форм препаратов, предназначенных для лечения вирусных заболеваний.

Таблица 2
Фрагмент двуцепочечной РНК	IC50 для клеток КВ-3-1 через 72 ч после трансфекции
1.1	80 нМ
1.2	200 нМ
1.3	46 нМ
1.4	74 нМ
1.5	81 нМ