способ определения ксенобиотиков в моче человека при допинговом контроле

Формула изобретения

Способ определения ксенобиотиков в моче человека при допинговом контроле, включающий приготовление растворов веществ-эталонов в органическом растворителе, приготовление анализируемой пробы путем экстракции, упаривания экстракта и растворения сухого остатка, хроматографическое разделение и масс-спектральный анализ эталонных растворов и анализируемой пробы, а также регистрацию полученных результатов с последующим определением наличия ксенобиотиков, отличающийся тем, что дополнительно готовят три пробы: первую - путем усреднения образцов мочи (по меньшей мере 10 образцов мочи здоровых людей, не принимавших лекарственных препаратов и заведомо не содержащих ксенобиотиков и продуктов их метаболизма), вторую - путем растворения веществ-эталонов в растворе сухого остатка после упаривания усредненной пробы мочи здоровых людей, не принимавших лекарственных препаратов, и третью - путем растворения веществ-эталонов в усредненной пробе мочи здоровых людей, не принимавших лекарственных препаратов, осуществляют хроматографическое разделение и масс-спектральный анализ приготовленных проб и регистрируют показатели времени удержания и соотношения интенсивности характеристичных ионов фоновых веществ в приготовленных пробах, а ксенобиотики определяют по сравнению показателей времени удержания и соотношения интенсивности характеристичных ионов во всех растворах и пробах, учитывая только те значения, которые не совпадают с фоновыми веществами.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области исследования или анализа материалов, в том числе ксенобиотиков, путем разделения образцов материалов на составные части с использованием хроматографии и масс-спектрометрии, а точнее к способам идентификации и определения ксенобиотиков, и может быть использовано в допинговом контроле.

Известны способы определения органических веществ, в том числе и ксенобиотиков (кортикостероидов, диуретиков, стимуляторов ЦНС, наркотических веществ и анаболических стероидов) методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией, например [1-3].

Общим недостатком таких методов является трудоемкая и продолжительная во времени стадия получения летучих производных для кортикостероидов, анаболических стероидов, наркотических веществ и диуретиков, что существенно усложняет ход анализа и увеличивает его продолжительность.

Наиболее близким по своей технической сущности и достигаемому результату к заявляемому способу является способ определения ксенобиотиков в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС) [4].

По указанному способу готовят стандартные растворы веществ-эталонов, снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики указанных растворов и исследуемой пробы мочи в режиме сканирования в выбранном диапазоне и определяют наличие ксенобиотиков путем сравнения зарегистрированных времени удержания и соотношений интенсивности характеристичных ионов веществ-эталонов и пробы.

Недостатком указанного способа является высокий порог чувствительности определения, заключающийся в том, что он не позволяет определять исследуемые вещества при низких концентрациях, и большая продолжительность проведения пробоподготовки, включающей ферментативный гидролиз.

Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является повышение информативности и достоверности допингового контроля за счет определения кортикостероидов, диуретиков, стимуляторов ЦНС, наркотических веществ и ряда анаболических стероидов в моче человека в одной пробе и сокращения продолжительности проведения пробоподготовки.

Поставленный технический результат достигается тем, что дополнительно готовят три пробы: первую - путем усреднения образцов мочи (по меньшей мере 10 образцов мочи здоровых людей, не принимавших лекарственных препаратов и заведомо не содержащих ксенобиотиков и продуктов их метаболизма), вторую - путем растворения веществ-эталонов в растворе сухого остатка после упаривания усредненной пробы мочи здоровых людей, не принимавших лекарственных препаратов, и третью - путем растворения веществ-эталонов в усредненной пробе мочи здоровых людей, не принимавших лекарственных препаратов, осуществляют хроматографическое разделение и масс-спектральный анализ приготовленных проб и регистрируют показатели времени удержания и соотношения интенсивности характеристичных ионов фоновых веществ в приготовленных пробах, а ксенобиотики определяют по сравнению показателей времени удержания и соотношения интенсивности характеристичных ионов во всех растворах и пробах, учитывая только те значения, которые не совпадают с фоновыми веществами.

Известно, что этические нормы в спорте предполагают полный отказ спортсменов от использования любых стимуляторов (ксенобиотиков), искусственно воздействующих на организм и центральную нервную систему, и именно поэтому Всемирное Антидопинговое Агентство (ВАДА) ежегодно публикует списки запрещенных к использованию соединений-ксенобиотиков: кортикостероидов, диуретиков, наркотических веществ, стимуляторов центральной нервной системы (ЦНС), анаболических стероидов, бета-адреноблокаторов, бета-2-агонистов, полипептидных гормонов (эритропоэтин, гормон роста, инсулин, кортикотропины) и антиэстрогенов. Кортикостероиды, стимуляторы ЦНС и бета-адреноблокаторы запрещены только на период соревнований. Диуретики, наркотические вещества, анаболические стероиды, бета-2-агонисты, гормоны и антиэстрогены запрещены постоянно, т.е. в соревновательном и внесоревновательном циклах.

Согласно утвержденным правилам ВАДА минимально требуемый предел детектирования (МТПД) для кортикостероидов, диуретиков, стимуляторов ЦНС, наркотических веществ, анаболических стероидов и бета-адреноблокаторов в моче человека является 30, 250, 500, 200, 10 и 500 нг/мл соответственно, а для кленбутерола и станозолола - 2 нг/мл [5]. Основными необходимыми и достаточными параметрами, учитываемыми при определении соединений-ксенобиотиков, в силу специфики метода ВЭЖХ-МС, являются значения времени удерживания и соотношения интенсивности характеристичных ионов, однако в то же время достоверность и точность определения указанных параметров прямо зависит от пределов детектирования, на которые, в свою очередь, существенное влияние оказывают параметры фоновых веществ в анализируемом образце мочи.

Действительно, при электрораспылительной ионизации ряд фоновых соединений может образовать одинаковые с определяемыми ксенобиотиками прекурсор-ионы. Кроме того, такие прекурсор-ионы в камере соударений могут фрагментироваться с образованием характеристичных ионов, идентичных по молекулярной массе и соответственно максимальной интенсивности таковым у определяемых ксенобиотиков. В таких случаях интерференция пиков значений характеристичных ионов искажает искомые показатели результатов анализа и приводит к ложным выводам о пределе обнаружения и даже природе определяемого ксенобиотика.

Совершенно очевидно, что чем большее число веществ будет привлечено к использованию в заявляемом способе определения ксенобиотиков, тем универсальнее он будет.

Для определения ксенобиотиков в качестве таковых могут быть выбраны, например:

а) кортикостероиды: кортизол, кортизон, флюнизолид, флюметазон, флюдрокортизон, флюдрокортизон 21-ацетат, будезонид, бетаметазон, беклометазон, метилпреднизолон, дезоксиметазон, триамцинолон, триамцинолон ацетонид, дезонид, флюокортолон, флюорометолон, дексаметазон, преднизон, преднизолон, дифлоразон диацетат, клобетазол пропионат;

б) диуретики: хлортиазид, гидрохлортиазид, ацетазоламид, хлорталидон, клопамид, трихлорметиазид, политиазид, фуросемид, бендрофлюметиазид, бензтиазид, индапамид, буметанид, пробенецид, этакриновая кислота, амилорид, триамтрен, спиронолактон, ацетазоламид, клопамид;

в) стимуляторы ЦНС и наркотические вещества: морфин, амфетамин, метиламфетамин, мефентермин, фенфлюрамин, норфенфлюрамин, стрихнин, метадон, норэфедрин, метилендиоксиэтамфетамин (MDEA), метилендиоксиметамфетамин (MDMA), кокаин, этиламфетамин, диметиламфетамин, фенметразин, октопамин, петидин, гидрокодон, кодеин, никетамид, кофеин, буторфанол, норпсефдоэфедрин, синефрин, адрафинил, бупропион, этамиван, псевдоэфедрин, метилфенидат, модафинил и амитриптилин. 3'-ОН-станозолол, 16 -ОН-станозолол, 4 -ОН-станозолол, 4 -ОН-станозолол, гептаминол, карфедон, кротетамид и кропропамид;

г) также такие соединения как метилэфедрин, эфедрин и фоледрин, амфепрамон и фампрофазон, тестостерон, эпитестостерон, гестринон, кленбутерол, тренболон, тетрагидрогестринон, оксандролон и оралтуринабол, пемолин, мезокарб, селегилин, торасемид, ксипамид, дихлорфенамид, метолазон, пролинтан, циклопентиазид, амифеназол, фентермин.

Стандартные растворы аналитов могут быть приготовлены растворением точных навесок в точном объеме растворителя, например метанола. Рабочие растворы могут быть получены разбавлением до соответствующей концентрации.

В качестве элюента могут быть использованы, например, смеси метанола, ацетата аммония и муравьиной кислоты.

В качестве экстрагента для ЖЖЭ может быть использован диэтиловый эфир.

В качестве регуляторов рН могут быть использованы гидрокарбонат натрия и карбонат калия.

В качестве системы ВЭЖХ-МС/МС могут быть использованы хромато-масс-спектрометр с тройным квадрупольным анализатором TSQ Quantum фирмы Thermo Finnigan (США), соединенным с высокоэффективным жидкостным хроматографом модели Surveyor, оснащенным автосамплером, насосом высокого давления и дегазатором фирмы Thermo Finnigan (США).

В качестве вспомогательного оборудования могут быть использованы:

- автоматический шейкер фирмы Glas-Col®, США - для ЖЖЭ;

- центрифуга марки Rotina 46R фирмы Hettich (ФРГ) для получения контрастной поверхности раздела между органической и водной фазами;

- упариватель фирмы Barnstead Inc.(CШA), совмещенный с генератором азота марки Mistral-4 фирмы Schmidlin-DBS AG (Чехия) для упаривания органического экстракта;

- колонка Eclipse XDB-C18, 150×2.1 мм, размер частиц 5 мкм, размер пор 100 , фирмы Agilent (США) для хроматографического разделения.

В качестве мобильной фазы может быть использована система: 0.05%-ный раствор муравьиной кислоты с 20 мМ раствором ацетата аммония (рН 3.0) (А) и метанол (В).

В качестве внутренних стандартов (ISTD) могут быть использованы, например, флюоксиместерон, метилтестостерон и мефрузид.

Изобретение может быть осуществлено следующим образом.

Готовят растворы веществ-эталонов в органических растворителях, в моче здоровых людей, не принимавших лекарственных средств, в растворе сухого остатка после упаривания экстракта из мочи, и усредненный образец мочи( усреднением по меньшей мере 10 образцов мочи, не содержащих ксенобиотиков и продуктов их метаболизма).

Снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики веществ-эталонов (детектируют не менее трех характеристических ионов каждого эталонного вещества, определяют время удержания, молекулярную массу, прекурсор-ионы, характеристичные ионы, нижний предел обнаружения) и полученные результаты вводят в программное обеспечение, например Xcalibur версии 1.3 фирмы Thermo Finnigan, США.

Далее проводят пробоподготовку, при которой в образец исследуемой мочи вводят флюоксиместерон, мефрузид и метилтестостерон, смешивают с твердым буфером (гидрокарбонат натрия и карбонат калия) и высаливателем - сульфатом аммония, растворяют добавки перемешиванием, экстрагируют диэтиловым эфиром, органический слой количественно отделяют, упаривают в токе азота, перерастворяют сухой остаток в мобильной фазе состава 40/60 метанол/0,02%-ный р-р муравьиной кислоты с 20 мМ р-ром ацетата аммония и далее одну часть пробы вводят в систему ВЭЖХ-МС/МС с электрораспылительной ионизацией в режиме регистрации отрицательных ионов и вторую часть - в режиме регистрации положительных ионов с последующей оценкой полученных результатов путем сравнения зарегистрированных показателей времени удержания и соотношения интенсивности характеристичных ионов во всех растворах и пробах, учитывая только те значения, которые не совпадают с фоновыми веществами.

Следует отметить, что заявляемый способ определения ксенобиотиков позволяет сократить количество процедур в пробоподготовке и проведении анализа в два раза по сравнению с прототипом, что сокращает затраты на проведение допингового контроля одной пробы.

Для лучшего понимания изобретение может быть проиллюстрировано, но не исчерпано следующими примерами его конкретного осуществления.

Пример 1

А. Получение масс-спектров, определение характеристических ионов, времени удержания и пределов детектирования исследуемых ксенобиотиков

Готовят стандартные растворы аналитов (1 мг/мл): кортизола, кортизона, флюнизолида, флюметазона, флюдрокортизона, флюдрокортизон 21-ацетата, будезонида, бетаметазона, беклометазона, метилпреднизолона, дезоксиметазона, триамцинолона, триамцинолон ацетонида, дезонида, флюокортолона, флюорометолона, дексаметазона, преднизона, преднизолона, дифлоразон диацетата, клобетазол пропионата, хлортиазида, гидрохлортиазида, ацетазоламида, хлорталидона, клопамида, трихлорметиазида, политиазида, фуросемида, бендрофлюметиазида, бензтиазида, индапамида, буметанида, пробенецида, этакриновой кислоты, амилорида, триамтрена, спиронолактона, ацетазоламида, клопамида, морфина, амфетамина, метиламфетамина, мефентермина, фенфлюрамина, норфенфлюрамина, стрихнина, метадона, норэфедрина, метилендиоксиэтамфетамина, метилендиоксиметамфетамина, кокаина, этиламфетамина, диметиламфетамина, фенметразина, октопамина, петидина, гидрокодона, кодеина, никетамида, кофеина, буторфанола, норпсефдоэфедрина, синефрина, адрафинила, бупропиона, этамивана, псевдоэфедрина, метилфенидата, модафинила, амитриптилина, 3'-ОН-станозолола, 16 -ОН-станозолола, 4 -ОН-станозолола, 4 -ОН-станозолола, гептаминола, карфедона, кротетамида, кропропамида, метилэфедрина, эфедрина, фоледрина, амфепрамона, фампрофазона, тестостерона, эпитестостерона, гестринона, кленбутерола, тренболона, тетрагидрогестринона, оксандролона, оралтуринабола, пемолина, мезокарба, селегилина, торасемида, ксипамида, дихлорфенамида, метолазона, пролинтана, циклопентиазида, амифеназола и фентермина** в метаноле, в моче здоровых людей, не принимавших лекарственных препаратов, в растворе сухого остатка после упаривания усредненной пробы мочи здоровых людей, не принимавших лекарственных препаратов, и усредненный образец мочи (усреднением по меньшей мере 10 образцов мочи здоровых людей, не принимавших лекарственных препаратов, и не содержащих ксенобиотиков и продуктов их метаболизма), далее получают рабочие растворы разбавлением стандартных растворов до соответствующей концентрации (мкг/мл). Приготовленные таким образом рабочие растворы трех видов вводят в систему ВЭЖХ-МС/МС (хромато-масс-спектрометр с тройным квадрупольным анализатором TSQ Quantum фирмы Thermo Finnigan (США), соединенным с высокоэффективным жидкостным хроматографом модели Surveyor, оснащенным автосамплером, насосом высокого давления и дегазатором фирмы Thermo Finnigan (США). Анализ ведут при скорости потока подвижной фазы 0.2 мл/мин. Определяемые вещества разделяют градиентным элюированием при условиях: 0 мин - 40% В; 8-9 мин - 90% В; 12-18 мин - 40% В, общее время анализа с учетом стабилизации системы перед вводом следующего образца составляет 18 мин. Ионизацию при атмосферном давлении осуществляют электрораспылением в режиме регистрации отрицательных и положительных ионов. Напряжение на капилляре - 3.8 кВ; температура капилляра 245°С; скорость потока осушающего газа (азот) - 0.45 л/мин; скорость потока газа (аргон) в камере соударения - 0.075 л/мин; температура в камере ионизации 200°С; давление на распылителе - 2 атм. Детектирование определяемых веществ проводят в режиме регистрации селективных реакций (SRM). Ширина пика для прекурсор-ионов и соответствующих характерных ионов на первом квадруполе (Q1) и третьем квадруполе (Q3) составляет 0.5 а.е.м. (на половине высоты), время задержки - 5 мс. Обработку полученных данных (масс-спектры, характеристические ионы, время удержания и пределы детектирования исследуемых ксенобиотиков) проводят с применением программного обеспечения Xcalibur версии 1.3 фирмы Thermo Finnigan, США (см. Таблицу 1).

Таблица 1
№ № п/п	Определяемое соединение	Время удержания (мин)	Мол. масса	Прекурсор-ион	Характеристич., ионы	Нижн. предел обнаруж., нг/мл
1	Амилорид	1,7	229	230[М+Н]+	171; 116	50
2	Ацетазоламид	2,0	222	221[М+Н]-	221; 83	50
3	Ацетазоламид	2,0	222	223[M+H]+	164; 181	50
4	Бензтиазид	5,8	431	221[M+H]-	308; 228	10
5	Буметанид	8,6	364	221[М+Н]-	319; 207	20
110	Тестостерон	9,6	288	289[М+Н]+	109; 97	0,5
111	Тренболон	8,3	270	271[М+Н]+	253; 199	1,0
112	Эпитестостерон	10,3	288	289[М+Н]+	109; 97	0,5
**Примечание: вышеперечисленные ксенобиотики были получены от фармацевтических и биомедицинских фирм и лабораторий РФ, США, Австралии, Швейцарии, Словакии, ФРГ и др. Содержание основного вещества в препаратах во всех случаях превышало 99%.

Б. Подготовка пробы и анализ исследуемой мочи

У добровольца, пользовавшегося запрещенными препаратами, получают образец мочи (5 мл), добавляют в нее 50 мкл раствора внутренннего стандарта, содержащего флюоксиместерон (50 нг/мкл), мефрузид (10 нг/мкл) и метилтестостерон (10 нг/мкл), подщелачивают до рН 9.5-10.0 смесью гидрокарбоната натрия и карбоната калия (1:2), добавляют 5 г сульфата аммония и далее экстрагируют с 5 мл диэтилового эфира в течение 10 мин на автоматическом экстракторе. Центрифугируют при 3000 об./мин в течение 10 мин, органический экстракт упаривают досуха в токе азота. Сухой остаток растворяют в 100 мкл метанола, затем 15 мкл раствора вводят в систему ВЭЖХ-МС/МС с электрораспылительной ионизацией при атмосферном давлении в режиме регистрации отрицательных ионов и 15 мкл - в режиме регистрации положительных ионов. Анализ ведут при следующих параметрах. Скорость потока подвижной фазы 0,2 мл/мин. Определяемые вещества разделяют градиентным элюированием при условиях: 0 мин - 40% В; 8-9 мин - 90% В; 12-18 мин - 40% В, общее время анализа с учетом стабилизации системы перед вводом следующего образца составляет 18 мин. Ионизацию при атмосферном давлении осуществляют электрораспылением в режиме регистрации отрицательных и положительных ионов. Напряжение на капилляре - 3.8 кВ; температура капилляра - 245°С; скорость потока осушающего газа (азот) - 0.45 л/мин; скорость потока газа (аргон) в камере соударения - 0.075 л/мин; температура в камере ионизации 200°С; давление на распылителе - 2 атм. Детектирование определяемых веществ проводят в режиме регистрации селективных реакций (SRM). Ширина пика для прекурсор-ионов и соответствующих характерных ионов на первом квадруполе (Q1) и третьем квадруполе (Q3) составляет 0.5 а.е.м. (на половине высоты), время задержки - 5 мс.

Полученные результаты приведны в Таблице 2.

Масс-спектры, характеристичные ионы, время удержания и пределы детектирования определяемых в моче веществ сравнивают с зарегистрированными характеристиками веществ-эталонов и трех дополнительных проб (см. Таблицу 1).

Таблица 2
№ № пп.	Время удержания (мин)	Мол. масса	Прекурсор-ион	Характеристич. ионы	Нижн. предел обнаруж., нг/мл	Найденное соединение
1	1.9	165	166 [М+Н] +	148(10); 133(20)	10	Эфедрин
2	1.8	299	300 [M+H] +	165(40); 215(20)	10	Кодеин
3	2.8	178	179 [М+Н] +	108(20); 78(30)	10	Никетамид

Таким образом, установлено, что в исследуемом образце мочи содержатся: кодеин, эфедрин и никетамид.

Примеры 2-6

Анализ образцов мочи проводили как в Примере 1, за исключением того, что исследовали образцы мочи, взятой у добровольцев, пользовавшихся запрещенными препаратами различной природы. Результаты анализа представлены в Таблице 3.

Пример контрольный

Подготовку и анализ пробы исследуемой мочи добровольца, пользовавшегося запрещенными препаратами, вели из Примера 1, однако не готовили дополнительные пробы и, соответственно, при определении наличия ксенобиотиков в пробе не могло быть учтено влияние фоновых веществ в моче. Результаты анализа представлены в Таблице 4.

Таблица 4
№ № пп.	Время удержания (мин)	Мол. масса	Прекурсор-ион	Характеристич. ионы	Нижн. предел обнаруж., нг/мл	Найденное соединение
1	1.9	165	166 [М+Н] +	148 (10); 133 (20)	25	Эфедрин
2	1.8	299	300 [M+H]+	165 (40); 215 (20)	25	Кодеин
3	2,8	178	179 [M+H]+	108 (20); 78 (30)	50	Никетамид

Как видно из описания приведенных примеров осуществления способа и контрольного примера, заявляемый способ обеспечивает однопробное определение широкого круга ксенобиотиков в моче человека, что повышает информативность и достоверность допингового контроля и сокращение продолжительности проведения пробоподготовки.

Источники информации

1. Хим. фарм. журнал, 1988, т.22, с.622.

2. RU 2313086 C2, G01N 30/72, 2007.

3. J. Anal. Toxicol., 2005, v.29, № 4, p.217.

4. Rapid Communications in Mass Spectroscopy, 20(22), pp.3465-3476 - прототип.

5. The World Anti-Doping Code. The 2008 Prohibited List. International Standard for Laboratories. 2008.