штамм lactobacillus plantarum - продуцент кормового белка

Классы МПК:C12N1/20 бактерии; питательные среды для них
C12P21/00 Получение пептидов или протеинов
C12R1/25 Lactobacillus plantarum
Автор(ы):
Патентообладатель(и):Общество с ограниченной ответственностью "БИОПРОТЕИН" (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2007-12-21
публикация патента:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве для приготовления корма. Штамм Lactobacillus plantarum 578/26 депонирован в коллекции ВГНКИ под номером ВГНКИ - 08.02.54. - ДЕП. Данный штамм является продуцентом кормового белка. Изобретение позволяет исключить загрязнение окружающей среды при производстве белкового корма, повысить удельный выход белка, снизить энергозатраты при приготовлении белкового корма, упростить и ускорить процесс его приготовления, упростить аппаратурное оснащение, утилизировать отходы производств, использующих природное сырье. 2 табл.

Формула изобретения

Штамм Lactobacillus plantarum 578/26 - продуцент белкового корма, депонированный в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте пищевой биотехнологии (ГНУ ВНИИПБТ Россельхозакадемии).

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к пищевой промышленности, биотехнологии, сельскому хозяйству.

Известны дрожжи Saccharomices cerevisiae расы У-1986 - (Патент RU № 2183666, С12F 3/10, опубл. 2002 г.) (1).

Дрожжи данной расы используют для сбраживания зернового сусла в спиртовом производстве. Их функцией является переработка сахаров сусла в спирт. Кормовой продукт при этом не является целевым продуктом, его утилитарное назначение не определено. Он является отходом спиртового производства, загрязняющим окружающую среду. Контроль за качеством и составом данного отхода осуществлять трудно.

Известен штамм дрожжей Candida tropicalis ВСБ-928К - продуцент кормового белка (Патент RU № 2042713, С12Р 1/100, опубл. 20.06.2002 г.) (2) (прототип).

Недостатком данного известного штамма является использование для получения кормового белка дрожжей рода Candida, которые являются условно патогенным микроорганизмом, что требует выполнения дополнительного процесса термолиза и наличия специального оборудования, сложной системы обезвреживания стоков и воздушных выбросов при значительных объемах используемого воздуха. Санитарно-эпидемиологическими правилами СанПиН 2.3.2.1078-01 дрожжи рода Candida включены в перечень веществ, которые оказывают вредное воздействие на здоровье человека. Скорость роста клеток известного штамма невысокая, что удлиняет производственный цикл и снижает удельный выход целевого продукта на стадии биосинтеза. Кроме того, при приготовлении кормового белка с использованием данного известного штамма дрожжей требуется большой расход тепло- и энергоресурсов для высушивания биомассы и значительный расход (1,5 г/л) сульфата аммония.

Наиболее близким к данному изобретению является штамм Lactobacillus plantarum 578/25 - продуцент кормового белка (Патент RU № 2244001, C1 С12N 1/20, С12F 21/00//(С12N 1/20, C12R 1:25) (опубл. 10.01.2005 г.).

Недостатком данного изобретения является недостаточно высокая концентрация биомассы, накапливаемая в присутствии 2,5% молочной кислоты, а следовательно, недостаточное количество белка, которое могло бы образоваться культурой.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является исключение загрязнения окружающей среды, снижение энергозатрат при приготовлении кормового белка, упрощение аппаратурного оснащения, утилизация отходов производств, использующих природное сырье, повышение биологической ценности кормового белка за счет обеспечении возможности обогащать микрофлору кишечника животных живыми клетками молочнокислых бактерий.

Указанный технический результат достигается тем, что в качестве продуцента кормового белка используют вновь выделенный штамм Lactobacillus plantarum 578/26, депонированный во Всероссийской Государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, регистрационный номер - штамм Lactobacillus plantarum ВГНКИ-08.02.54.-ДЕП (123022, г.Москва, Звенигородское шоссе, 5). Местом хранения штамма определена коллекция микроорганизмов ГНУ ВНИИПБТ (111033, Москва, ул.Самокатная, д.4Б).

Использование бактерий в качестве продуцента белкового корма является более эффективным, так как бактерии образуют до 75% белка по массе, в то время как дрожжи - не более 60%. Использование нового штамма Lactobacillus plantarum 578/26 для приготовления белкового корма не требует расхода воздуха и энергозатрат на его подачу, так как данный штамм молочнокислых бактерий является анаэробом. Штамм обладает широким спектром антимикробного действия, что исключает развитие посторонней микрофлоры в процессе биосинтеза и поэтому не требуется наличие специального оборудования для соблюдения условий стерильности. Возможность утилизации разнообразных отходов отраслей промышленности, использующих природное сырье, при наращивании биомассы нового штамма с целью приготовления белкового корма, решает экологические проблемы предприятий.

Ниже приведены примеры реализации изобретения.

Пример 1

Штамм Lactobacillus plantarum 578/26 был получен путем многократных (не менее 35) пересевов клеток исходного штамма Lactobacillus plantarum В 578 на плотную питательную среду следующего состава:

Мясная вода400 мл
Дрожжевой экстракт 5,0 г
Натрия ацетат5,0 г
Глюкоза 5,0 г
Аммония цитрат2,5 г
K2 HPO42,0 г
MgSO 4·7H2O 0,2 г
МnO 4·4Н2O 0,05 г
Твин 80 1 мл
Агар 20,0 г
Вода дистиллированная до 600 мл

Содержание свободной молочной кислоты в среде постепенно повышали от 0 до 3,5%. Клетки инкубировали на плотной питательной среде при 37°С в течение 24 час. Отбор осуществляли по количеству колоний и по кислотообразующей способности, которую определяли титрованием. Отбирали те колонии, рост которых на плотной питательной среде не ингибировался в присутствии 3,5% молочной кислоты. После 35 пересевов штамм достиг генетической устойчивости. Результаты отбора нового штамма Lactobacillus plantarum 578/26 путем ступенчатого селекционирования приведены в таблице 1, свидетельствующей о том, что при содержании в среде молочной кислоты до 2,5%, рост клеток нового штамма молочнокислых бактерий (в отличие от исходного штамма) не ингибируется и характеризуется достаточно большим количеством клеток. При большем содержании молочной кислоты (3,5%) происходит резкое снижение количества клеток и морфология клеток меняется.

Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

Сравнение свойств исходного и нового штаммов Lactobacillus plantarum
Наименование штамма Концентрация молочной кислоты, % Количество клеток в 1 мл культуральной жидкости
Lactobacillus plantarum В 5780 1,5·109
(исходный штамм) 0,51,0·10 7
штамм lactobacillus plantarum - продуцент кормового белка, патент № 2390554 1,0 1,0·105
штамм lactobacillus plantarum - продуцент кормового белка, патент № 2390554 1,25 1,0·103
Lactobacillus plantarum В 578/26 02,0·10 11
штамм lactobacillus plantarum - продуцент кормового белка, патент № 2390554 1,0 1,5·109
штамм lactobacillus plantarum - продуцент кормового белка, патент № 2390554 2,0 1,0·107
штамм lactobacillus plantarum - продуцент кормового белка, патент № 2390554 2,5 1,5·105
штамм lactobacillus plantarum - продуцент кормового белка, патент № 2390554 3,0 2,0·104
штамм lactobacillus plantarum - продуцент кормового белка, патент № 2390554 3,5 1,0·103

Для размножения штамма наиболее крупные колонии пересевали на жидкую питательную среду следующего состава:

Мясная вода400 мл
Дрожжевой экстракт 5,0 г
Натрия ацетат5,0 г
Глюкоза 2,5 г
Аммония цитрат2,5 г
K2 HPO42,0 г
MgSO 4·7H2O 0,2 г
MnSO 4-4H2O 0,05 г
Твин 801 мл
Вода дистиллированная до600 мл

Для длительного хранения клетки штамма лиофилизировали в сепарированном молоке и хранили в условиях отсутствия кислорода. Клетки штамма можно также хранить на 10%-ном сахарозно-желатиновом агаре или в полужидкой среде под маслом.

Штамм не является зоопатогенным или фитопатогенным. Он не представляет опасности по другим причинам.

В соответствии с Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9 edition, 1994, Williams & Wilkins, USA, выделенный штамм идентифицирован как Lactobacillus plantarum 578/26.

Культурально-морфологическе особенности штамма: неподвижные палочки размером (0,9-1,2)×(3-8) мкм. Грам-положительные. Неспорообразующие. Аэротолерантные. Сбраживает фруктозу, лактозу, галактозу, глюкозу (кислота), мальтозу, маннит, рибозу, сахарозу, целлобиозу. Образует DL-формы молочной кислоты. Оптимум рН 5,8-6,0. Оптимум температуры 37°С.

Пример 2

Штамм Lactobacillus plantarum 578/26 был оценен по способности образовывать повышенное содержание белка путем культивирования его на жидкой питательной среде состава, указанного в примере 1, по результатам измерения количества образовавшейся в культуральной жидкости биомассы и сырого протеина.

Инокулят в количестве десяти объемных процентов вносили в колбы с жидкой питательной средой объемом 750 мл и проводили культивирование в стационарных условиях при соблюдении следующих параметров: температура 37°С, рН 6,0. В качестве нейтрализующего агента использовали 20%-ный раствор гидроокиси натрия. После 24 часов культивирования определяли рост бактерий и количество образовавшейся в процессе биосинтеза биомассы и сырого протеина в культуральной жидкости. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2

Характеристика выделенного штамма Lactobacillus plantarum 578/26
Наименование показателя Величина показателя
Количество клеток в 1 мл культуральной жидкости 2,0·109
Удельный выход от субстрата, мас % 96,0
Массовая доля сырого протеина, % 49,5

На основании полученных результатов сделан вывод о том, что селекционированный штамм обладает высокой продуктивностью в отношении целевого продукта - накопления биомассы (исходное содержание бактериальных клеток было равно 1,0·105), высоким удельным выходом от используемого субстрата и накоплением сырого протеина до 49,5% против 25% у исходного штамма. Штамм может быть использован в промышленном масштабе.

Новый штамм Lactobacillus plantarum 578/26 позволяет получать белковый корм с высоким выходом при утилизации отходов производств: послеспиртовой барды, пивной дробины, отходов мукомольного и крахмального производств, отходов переработки зернового и плодового сырья.

Пример 3

На послеспиртовой барде выращивают чистую культуру Lactobacillus plantarum 578/26.

По окончании процесса ферментации полученную массу разделяют на твердую и жидкую фазу путем фильтрования.

Твердую фазу направляют на высушивание при температуре (80-90)°С.

Кормопродукт, получаемый после высушивания твердой фазы, содержит 46,0% сырого протеина и имеет следующий состав:

массовая доля углеводов, % по св. 45,0
массовая доля золы, % по св. 2,5
общее содержание аминокислот, % 43,4

из них

лизин+гистидин2,2
аргинин 1,25
аспарагиновая кислота4,25
треонин 2,0
серии 2,08
глутаминовая кислота 14,84
метионин+цистин 1,3
глицин2,6
пролин 3,14
фенилаланин+тирозин 2,65
аланин4,4
изолейцин+лейцин 2,53
массовая доля белка по Барштейну, % по св. 37,1
массовая доля жира, % по св. 5,1
общее содержание микроэлементов, мг/кг 21800

из них

фосфор5900
калий 3500
натрий 500
кальций11600
магний 1000
железо 750
кобальт4,9

содержание витаминов, мг/кг

Е(токоферол)43,5
B1 (тиамин)3,3
В2 (рибофлавин)8,0
В3 (пантотеновая кислота) 35,3
В 4(холин)800
В5 (никотиновая кислота) 26,8
В 6(пиридоксин) 8,2
В 9(фолиевая кислота) 18,0
обменная энергия, МДж13,4
кормовых единиц, кг1,39

Полученная после фильтрации жидкая фаза с содержанием в г/л:

сухих веществ10,1
массовая доля азотистых веществ 1,04
массовая доля золы1,3
массовая доля жира0,006
массовая доля углеводов 1,7
массовая доля аммонийного азота 0,04
общее содержание аминокислот,% 0,29
общее содержание микроэлементов 1,05
общее содержание витаминов 1,01
содержание лактата, г/100 мл 3,0

Полученный кормовой продукт содержит живые клетки молочнокислых бактерий, обогащающие микрофлору кишечника животных, потребляющих корм, что приводит к повышению его биологической ценности.

Пример 4

Культуральную жидкость после ферментации с помощью Lactobacillus plantarum 578/26 по примеру 3 подвергают предварительной фильтрации. После фильтрации получается осадок влажностью 50-61%, который может использоваться в качестве готового влажного корма.

Пример 5

В молочную сыворотку с содержанием сухих веществ 4-5%, подогретую до 50°С, вносят 20% об. клеток чистой культуры Lactobacillus plantarum 578/26. Инкубацию проводят в течение 4 час, при температуре 45°С и рН 5,9-6,0. После высушивания полученной биомассы получают белково-витаминный корм, содержащий живые клетки молочнокислых бактерий в экспоненциальной фазе роста.

Пример 6

Пивную дробину разводят водопроводной водой в соотношении 1:1, устанавливают рН на уровне 5,8-6,0, температуру 59-61°С и вносят 1,4 ед/г условного крахмала штамм lactobacillus plantarum - продуцент кормового белка, патент № 2390554 -амилазы. Смесь выдерживают в этих условиях в течение 55 мин, а затем - 55 мин при температуре 74-76°С. После охлаждения смеси до 59-61°С вводят в нее 0,4 ед/г штамм lactobacillus plantarum - продуцент кормового белка, патент № 2390554 -амилазы и выдерживают в этих условиях в течение 35 мин. Смесь охлаждают до 45-50°С и вносят 5,5 ед/г условного крахмала глюкоамилазы и выдерживают при рН 5,0 до достижения содержания редуцирующих веществ 6%, после чего в приготовленный ферментолизат пивной дробины вносят чистую культуру Lactobacillus plantarum 578/26 в количестве 10% об. Инкубацию ведут при периодическом перемешивании в течение 18 час при температуре 50°С и рН 5,9-6,0.

Полученную биомассу молочнокислых бактерий, находящихся в экспоненциальной фазе роста, высушивают и получают белково-витаминный корм.

Жизнеспособность клеток в готовом высушенном белковом корме сохранилась.

Полученный белково-витаминный продукт содержал протеина 49,7% по св., аминокислот 44,3% по св., углеводов 37,8% по св.

Пример 7

Мукомольные отходы измельчают до прохода не менее 80% через сито с ячейками диаметром 1 мм. Готовят водную суспензию измельченных мукомольных отходов путем их смешивания с водой в соотношении 1:3. В приготовленную суспензию вносят 20 ед/г сухого вещества целлюлозы целлюлолитического фермента штамм lactobacillus plantarum - продуцент кормового белка, патент № 2390554 -глюканазы и выдерживают приготовленную смесь при температуре 59-61°С и рН 6,0 в течение 55 мин, а затем при температуре 105°С в течение 25 минут до достижения содержания редуцирующих веществ 3-5%, после чего дополнительно вносят 8 ед/г целлюлозы штамм lactobacillus plantarum - продуцент кормового белка, патент № 2390554 -глюканазы и 5 ед./г условного крахмала глюкоамилазы. Приготовленную смесь выдерживают при температуре 45°С и рН 5,0 в течение 30 мин до достижения содержания редуцирующих веществ 7-10%.

После обработки осахаренную массу используют для инкубации на ней микроорганизмов Lactobacillus plantarum 578/26 при температуре 45°С и рН 5,9-6,0. Через 24 часа образуется белково-витаминный продукт с массовой долей протеина до 49,7% по св., с содержанием аминокислот 44,3% по св., содержанием углеводов 37,8% по св.

Пример 8

Крахмальные отходы обрабатывают аналогично зерновому сырью и мукомольным отходам, исключая стадию измельчения. При приготовлении смеси - крахмальные отходы - вода, количество воды регулируют так, чтобы получить суспензию концентрацией 14-16%.

На полученной среде проводят инкубацию Lactobacillus plantarum 578/26.

Получают корм, богатый биологически активными веществами и белком.

Пример 9

Измельченное зерно, мукомольные отходы или крахмальные отходы используют для приготовления ферментолизатов путем обработки их водных суспензий амилолитическими ферментами. Для этого в водную суспензию вносят 1,4 ед/г условного крахмала штамм lactobacillus plantarum - продуцент кормового белка, патент № 2390554 -амилазы, смесь выдерживают 55 мин при температуре 59°С и рН 5,8, затем 35 мин при 95°С, после чего смесь охлаждают до 45°С, вводят в нее 0,4 ед/г условного крахмала штамм lactobacillus plantarum - продуцент кормового белка, патент № 2390554 -амилазы и 6,5 ед/г условного крахмала глюкоамилазы. Выдерживают приготовленную смесь 30 мин при температуре 45°С и рН 5,0 до достижения содержания редуцирующих веществ 7% с получением ферментолизата, на котором инкубируют чистую культуру Lactobacillus plantarum 578/26 с получением полноценного белково-витаминного корма.

Класс C12N1/20 бактерии; питательные среды для них

способ определения чувствительности патогенных бактерий к комплексным антибактериальным препаратам -  патент 2529711 (27.09.2014)
бифазная транспортная питательная среда для выделения и выращивания бруцеллезного микроба -  патент 2529364 (27.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528874 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528873 (20.09.2014)
штамм lactobacillus fermentum, обладающий широким спектром антагонистической активности и пробиотический консорциум лактобактерий для изготовления бактериальных препаратов -  патент 2528862 (20.09.2014)
изолированный штамм (варианты), обеспечивающий улучшение состояния здоровья жвачных животных, способ его получения, и способ его введения жвачным животным -  патент 2528859 (20.09.2014)
способ получения миллерита с использованием сульфатредуцирующих бактерий -  патент 2528777 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528744 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528740 (20.09.2014)
питательная среда для культивирования легионелл -  патент 2528101 (10.09.2014)

Класс C12P21/00 Получение пептидов или протеинов

рекомбинантная плазмидная днк ppa-oprf-eta, кодирующая синтез рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa, штамм escherichia coli pa-oprf-eta - продуцент рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa и способ получения рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa -  патент 2529359 (27.09.2014)
модифицированная дрожжевая двугибридная система для эффективного исследования взаимодействия между белками и их доменами. -  патент 2529356 (27.09.2014)
лейколектины и их применение -  патент 2528860 (20.09.2014)
модифицированный фактор виллебранда с удлиненным полупериодом существования in vivo, его применения и способы получения -  патент 2528855 (20.09.2014)
способ получения пептидов, специфично распознающих определенные типы клеток и предназначенных для терапевтических целей -  патент 2528739 (20.09.2014)
слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк -  патент 2528251 (10.09.2014)
способ получения цитохрома с -  патент 2528061 (10.09.2014)
рсв-специфичные связывающие молекулы и средства для их получения -  патент 2527067 (27.08.2014)
способы, относящиеся к модифицированным гликанам -  патент 2526250 (20.08.2014)
l-фукоза 1 6 специфичный лектин -  патент 2524425 (27.07.2014)

Класс C12R1/25 Lactobacillus plantarum

штамм молочнокислых бактерий (варианты) для полного разложения глютена в муке и его использование -  патент 2523597 (20.07.2014)
способ приготовления лечебно-профилактического препарата из живых штаммов микроорганизмов лактобацилл и бифидобактерий "lb-комплекс плюс" -  патент 2517734 (27.05.2014)
консорциум пробиотических штаммов lactobacillus rhamnosus и lactobacillus plantarum для изготовления бактериального препарата и закваски прямого внесения для производства ферментированного молока и ферментированного свекольного сока -  патент 2506308 (10.02.2014)
пробиотические штаммы lactobacillus и их консорциум для профилактики и лечения урогенитальных инфекционных заболеваний у женщин -  патент 2504580 (20.01.2014)
изолированный штамм микроорганизма lactobacillus plantarum inducia dsm 21379 в качестве пробиотика, усиливающего врожденный иммунитет организма, продукт и композиция, содержащие упомянутый микроорганизм, и применение упомянутого микроорганизма для изготовления лекарственного средства, которое усиливает клеточный иммунитет -  патент 2486234 (27.06.2013)
изолированный штамм микроорганизма lactobacillus plantarum tensia dsm 21380 как противомикробный и гипотензивный пробиотик, продукт питания и композиция, содержащая упомянутый микроорганизм, и применение упомянутого микроорганизма для получения гипотензивного лекарственного средства, способ подавления патогенов и побочных лактобактерий в продукте питания -  патент 2477750 (20.03.2013)
применение lactobacillus для лечения вирусных инфекций -  патент 2440123 (20.01.2012)
применения lactobacillus для получения композиции, увеличивающей адсорбцию железа или его ионов, и для получения фармацевтической композиции для лечения анемии и способ увеличения адсорбции железа или его ионов млекопитающим -  патент 2402341 (27.10.2010)
пищевой продукт, обогащенный пробиотиком и обедненный органическими кислотами -  патент 2391865 (20.06.2010)
композиция, обладающая противовоспалительными свойствами, штамм lactobacillus plantarum - продуцент танназы (варианты) и его применения -  патент 2356942 (27.05.2009)
Наверх